JP5139170B2 - 多光子励起測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、多光子吸収現象を用いて観察対象の測定を行う多光子励起測定装置に関するものである。

近年、生命科学の先端研究分野等では、生体等の標本のより深部を観察したいという要請が高まっている。多光子吸収現象を用いた多光子励起測定装置の一例としての多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムは、組織透過性の高い長波長のレーザ光を使用するので、従来使用されている共焦点レーザ顕微鏡と比べて、生体標本の深部を観測するのに適している。

多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムにより試料の表層部から深層部まで異なる深さにおける画像データを取得するには、試料への入射光の光軸に垂直な平面であるＸＹ平面に対して入射光の集光点を走査しつつ、該試料からの反射光又は透過光を検出することによってＸＹ方向の２次元平面の画像データを取得し、上記入射光の集光点を光軸と平行な方向であるＺ軸方向に変化させて、試料から発生する信号光を観察する。

ところで、上述のようにＺ軸方向に集光位置を変えた場合、励起光パルスは試料の表面から深部に至る際に散乱・吸収を受けるため、試料の表面と同一の多光子励起を行うことはできない。また、得られる画像も、表層部からの深さが深くなるに従い、試料から発する蛍光が散乱や吸収を受けるために輝度が低下してしまうという現象が生じる。そのため、集光位置の試料表層部からの深さに応じて、レーザ光の光強度を変化させることや、単位時間当たりに照射する光パルス数を変化させることによって、輝度を均一化する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

図１３は、特許文献１に記載された多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図を示している。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１では、超短パルスレーザと音響光学素子（ＡＯＭ）とを備える光源装置１０２から出射した光パルスが、２次元走査機構１０３、ミラー１０４を経由して、対物レンズ１０５により試料１０７内の集光点に集光する。ここで、光源装置１０２の超短パルスレーザは、所定の繰返し周波数で光パルス列を発振する。

また、ＡＯＭはこの光パルス列の一部の透過を抑止して単位時間当たりのパルス数を変化させる、あるいは、強度変調を行う機能を有する。さらに、２次元走査機構１０３は、試料内の集光点を入射する光パルスの光軸と垂直な２次元平面、すなわちＸＹ平面内で走査可能としている。対物レンズ１０５には、この対物レンズ１０５を試料１０７に対してＺ方向に変位させるためのＺ軸方向駆動部１０６が接続されている。

さらに、この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１は、モニタ１１３が接続されたコンピュータ１０８を備えている。このコンピュータ１０８は、走査制御装置１１０を介してＺ軸方向駆動部１０６および２次元走査機構１０３を制御し、且つ、レーザ制御装置１０９、レーザパワーコントローラ１１１を介して光源装置１０２内のＡＯＭを制御することができる。

このような構成により、この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１０１の使用者は、モニタ１１３の表示を参照しつつコンピュータ８を介して以下の操作を行う、すなわち、Ｚ軸方向駆動部１０６により対物レンズ１０５を移動させることにより、試料１０７内の光パルスの集光点を観測したい領域のうち最も深い位置に移動させる。そして、図示しない多光子励起により発生した蛍光の可視化装置により蛍光の輝度を確認し、この輝度が充分な強さとなるように、ＡＯＭによる強度変調度または単位時間当たりの照射光パルス数を調整する。次に、試料１０７の最表面に光パルスの集光点を移動させて、上記と同様に、強度変調度、または、照射光パルス数を調整して、多光子励起により発生した蛍光の輝度が、上記の、最も深い位置における輝度と同等の明るさとなるよう調整する。

そしてこの調整結果は、レーザ制御装置１０９内のメモリ装置１１２に、試料１０７内の集光点のＺ軸方向の位置（以下、Ｚ軸位置とも呼ぶ）およびＡＯＭ設定値のテーブルとして記憶される。次に、使用者がＺ軸方向の観測したい最表面と最深部とその間の分割数を設定し測定をスタートさせると、設定した分割数に応じて分割された各Ｚ軸位置に応じて、Ｚ軸方向駆動部１０６が対物レンズ１０５を移動させる。これと略同時に、レーザ制御装置１０９は、メモリ装置１１２のテーブルを参照してＡＯＭの強度変調度あるいは照射パルス数を設定して観察を行う。これによって、輝度が均一で見やすい画像が得られるようになっている。

特開２００７−２６３７３０号公報

しかしながら、上記特許文献１に記載された多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムでは、試料の深部を測定する場合、ＡＯＭを用いて超短パルスレーザの光パルス列の透過率を高める（変調度を低くする）か、あるいは、単位時間当たりの光パルス数を増加させるので、試料に照射されるレーザ光の平均光強度が増大する。このため、例えば、生細胞などの試料が過剰に過熱されて損傷してしまう虞がある。

なお、２次元走査機構１０３により、光を偏向して試料を２次元走査する場合には、対物レンズの光軸から離れるに従って、対物レンズの収差等の影響により集光点が大きくなり、蛍光の輝度の低下が生じることになるが、従来はこの点については、着目されていない。これを解決する手段として試料の外周部の光パルス列の透過率を高めるか単位時間当たりの光パルス数を増加させると、上記と同様の問題が発生する。

したがって、これらの点に着目してなされた本発明の目的は、光パルスによる加熱により試料を損傷することなく、観測点の位置に依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる多光子励起測定装置を提供することにある。

上記目的を達成する請求項１に記載の多光子励起測定装置の発明は、高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、繰返し周波数が調整可能な光パルスを出射する短パルス光源と、前記短パルス光源から出射した光パルスを前記試料内の観測点に集光させて照射する照明光学系と、前記光パルスの照射により前記観測点から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、前記試料内の前記観測点の位置を変位させる観測点変位手段と、前記観測点変位手段による前記観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御する制御手段と、前記検出器により検出された前記信号光による信号を情報化して表示する表示手段とを備えたことを特徴とするものである。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、出射する光パルスの強度の尖頭値を、前記繰返し周波数に応じて制御することを特徴とするものである。

請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、平均光強度が略一定の光パルスを出射することを特徴とするものである。

請求項４に記載の発明は、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、パルス幅が略一定の光パルスを出射することを特徴とするものである。

請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記観測点変位手段は、前記照明光学系と前記試料とを前記照明光学系の光軸方向に相対的に変位させるように構成し、前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と平行な方向における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とするものである。

請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記観測点変位手段は、前記照明光学系の光軸に垂直な面内で、前記短パルス光源から出射した光パルスを２次元方向に偏向する２次元走査手段を有し、前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と垂直な面内における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とするものである。

請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源は、光パルスを発生する光源と、該光源からの光パルスを増幅するファイバ増幅器とを有することを特徴とするものである。

請求項８に記載の発明は、前記短パルス光源は、請求項７に記載の多光子励起測定装置において、利得スイッチ半導体レーザを含んで構成されることを特徴とするものである。

請求項９に記載の発明は、前記短パルス光源は、請求項７に記載の多光子励起測定装置において、能動モードロックファイバリングレーザを含んで構成されることを特徴とするものである。

請求項１０に記載の発明は、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置において、前記短パルス光源と前記照明光学系との間に、非線形パルス圧縮手段を備えたことを特徴とするものである。

本発明によれば、観測点変位手段により設定された観測点の位置に応じて、光パルスの繰り返し周波数を調節するようにしたので、平均光強度が略一定である場合には、光パルスによる加熱のため試料を損傷することなく、光パルスの強度の尖頭値を変化させて、観測点の位置に依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる。

以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。

[第１実施の形態]
本発明による多光子励起測定装置の第一実施の形態を、図１〜図６を用いて詳細に説明する。なお、ここでは多光子励起測定装置として多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを例として説明を行う。

図１は、本発明の第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。この多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、光パルスを出射してこの光パルスを空間伝播によりレーザ走査型顕微鏡４に供給する短パルス光源２、短パルス光源２から入射した光パルスにより試料６の多光子励起による蛍光の検出を行うレーザ走査型顕微鏡４、このレーザ走査型顕微鏡４に接続し、多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１全体の制御を行うとともに、レーザ走査型顕微鏡４からの信号を画像化するコンピュータ８１、画像化した上記信号等を表示するモニタ８２、コンピュータ８１に接続されてコンピュータ８１からの命令により短パルス光源２から出射する光パルスの繰り返し周波数を調節するレーザ制御装置８３、多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１の使用者が、コンピュータ８１に対して入力を行うためのインタフェース装置８４とから構成される。ここで、コンピュータ８１およびレーザ制御装置８３は、制御手段を構成し、また、コンピュータ８１とモニタ８２は表示手段を構成する。

さらに、レーザ走査型顕微鏡４は、短パルス光源２から入射した光パルスを反射させるミラー４１、ミラー４１で反射された光を２次元走査させる２次元走査手段４２、２次元走査手段４２を出射した光パルスを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ４３、中間像を結像した光パルスを略平行光にする結像レンズ４４、結像レンズ４４を出射した略平行光を試料６に集光させる対物レンズ４５、および、試料６を載置するステージ７を含んで構成する。ここで、２次元走査手段４２は、例えば互いに直交する２本の軸線回りに揺動する２枚のガルバノミラーを近接配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成する。また、ステージ７は、試料６を載置するステージ上面を入射する光パルスの光軸方向（Ｚ軸方向）に変位させて対物レンズ４５との相対距離を変化させるための駆動機構を備える。以上の構成において、瞳投影レンズ４３、結像レンズ４４、および対物レンズ４５は、照明光学系を形成している。また、２次元走査手段４２およびステージ７は、観測点の位置を変位させる観測点変位手段である。

ここで試料６は、例えば、蛍光タンパクが発現した生細胞である。この試料に光パルスを集光すると、蛍光タンパクが多光子吸収により励起され、信号光である蛍光を発する。この多光子吸収過程は非線型過程であり、蛍光強度は、２光子励起の場合、励起光パルスの平均光強度の２乗に比例し、光パルスの時間幅と繰返し周波数に反比例する。

また、レーザ走査顕微鏡４は、結像レンズ４４と対物レンズ４５との間に配置され、入射光パルスを透過させ、入射光パルスの光路と逆方向に伝播する蛍光を反射させて、入射光パルスと蛍光とを波長によって分離するダイクロイックミラー４６と、ダイクロイックミラー４６で反射した蛍光を集光させる集光レンズ４７と、この集光レンズ４７による集光点で蛍光を検出して電気信号に変換する検出器４８とを更に備える。ここで、ダイクロイックミラー４６は、入射光パルスおよび光パルスの試料６による反射光を透過させ、多光子励起により発生する蛍光を反射させる反射、透過特性を有する。

さらに、レーザ走査顕微鏡４は、コンピュータ８１と接続された外部入出力装置４９を含んで構成される。この外部入出力装置４９は、２次元走査手段４２およびステージ７と電気的に接続されており、コンピュータ８１からの指令により２次元走査手段４２およびステージ７の動作を制御するとともに、検出器４８とも電気的に接続され、この検出器４８から出力された電気信号を蓄積し、および、コンピュータ８１に送信できるように構成されている。

次に短パルス光源２の詳細について説明する。図２は、短パルス光源２の概略構成図である。短パルス光源２は、数百から数千ピコ秒幅の電気パルスを発生させる電気パルス発生器２１、この電気パルスにより流入する電流によって利得が瞬間的に発生消滅する、いわゆる利得スイッチ動作により短波長から長波長へと時間的にチャープした数十ピコ秒幅の光パルスを発生させる半導体レーザ２２、半導体レーザ２２から出射した光パルスを伝播させる、例えば、長さ約１ｋｍのシングルモード光ファイバ２３、シングルモード光ファイバ２３から出射した光パルスを数十ｍＷから数Ｗの平均光強度（平均出力）に増幅する二つのファイバ増幅器２４、２５を含んで構成する。

電気パルス発生器２１はレーザ制御装置８３と電気的に接続されており、図１のコンピュータ８１からの指令を受けたレーザ制御装置８３からのパルス繰返し周波数（パルス間隔時間）の指令により、電気パルスの繰返し周波数が、１ＭＨｚから２００ＭＨｚ（パルス間隔に換算して５ｎｓから１μｓ）の範囲で、随時変更可能である。

半導体レーザ２２はＶＣＳＥＬ（面発光レーザ）を使用し、また、光パルスの波長は試料６の多光子励起に適した波長であれば良く、可視から近赤外や赤外光までの波長が使用可能であるが、本実施の形態では近赤外の９８０ｎｍ帯を用いる。

シングルモード光ファイバ２３は、正の群速度分散（ＧＶＤ）を有し、これによってこのシングルモード光ファイバ２３を伝播する光パルスの長波長側が短波長側より速く光ファイバを伝播してチャープが補正される。光パルスの時間幅とその波長の拡がり幅（光スペクトル幅）との積には、限界となる最小値であるトランスフォームリミット（ＴＬ）を有することが知られている。すなわち、より短い時間幅の光パルスを得るためにはより広い光スペクトル幅が必要となる。ＶＣＳＥＬの光スペクトル幅は１ｎｍ程度なので、ＴＬな光パルスの時間幅は３ｐｓから５ｐｓ程度となる。シングルモード光ファイバ２３は、光パルスを数ピコ秒幅のＴＬな光パルスに変換する。

ファイバ増幅器２４、２５は、図示しない半導体レーザで励起されるＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバである。このファイバ増幅器２４、２５は飽和出力動作の状態となっており、すなわち、入射する光パルスの繰返し周波数によらず略一定の平均光強度（平均出力）の光パルスを出力する。

なお、短パルス光源２には、各光学素子の接続に適宜偏波保持光ファイバが使用され、偏波による動作の不安定を抑制する。また、反射光による半導体レーザ２２やファイバ増幅器２４、２５の損傷を防ぐための光アイソレータや、最適な光スペクトル波形を得るための光フィルタが挿入されている。

図３は、短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数と平均光強度、パルス幅、光パルスの強度の尖頭値であるピーク光強度の関係を示すグラフである。ファイバ増幅器２４、２５の特性により、平均光強度は繰返し周波数の変化に対して略一定である。また、パルス幅（光パルスの時間幅）も繰返し周波数の変化に対して略一定である。パルス幅および平均出力が一定であれば、先に説明したように、多光子励起による蛍光強度は、光パルスの時間幅に反比例する。したがって、繰返し周波数が下がると光パルス当たりのエネルギーは大きくなり、ピーク光強度が高くなることになる。すなわち、ピーク光強度は繰返し周波数に対して反比例の関係となる。

図４は、短パルス光源２から出射する光パルスについて繰返し周波数に対するパルス波形の差異を説明するグラフである。図４において、横軸は時間であり縦軸は光強度である。グラフは、それぞれ繰返し周波数ｆｐがＡ、２Ａ、３Ａ、４Ａの場合の光パルス波形を示している。繰返し周波数（ｆｐ）が４Ａ、３Ａ、２Ａ、Ａと低くなるにつれて、各光パルスのピーク光強度は高くなる。すなわち、短パルス光源２は、光パルスの繰返し周波数を変更することで、平均照射エネルギー（平均光強度）を変えずに、ピーク光強度を変化させることができる。

本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１は、観測点のＺ軸方向の位置変化に応じて光パルスの繰返し周波数を変化させることにより、試料６の複数のＺ軸位置で輝度が略均一となるようにして、ＸＹ平面の観測画像を得るようにしたものである。以下に、図１、図５、図６を用いてその動作を説明する。

図５は、本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１を用いた、顕微鏡観測の手順を示すフローチャートである。この手順は、観測に先立ってＺ軸位置に応じた光パルスの繰返し周波数の情報設定を行うための設定段階（ステップＳ１〜Ｓ８）、および、この設定された情報に基づいて観測を行う観測段階（ステップＳ９〜Ｓ１５）を含む。

まず、設定段階において、使用者は、図１の試料６をステージ７に載置して、ステージ７上面のＺ軸位置を調整して、光パルスの集光点が試料６の最表面に位置するようにする（ステップＳ１）。このＺ軸方向の調整は、使用者が、モニタ８２に表示される入力用画面を参照しつつ、例えばキーボードやマウス等のインタフェース装置８４を介して、数値情報あるいは微動指令をコンピュータ８１に入力すること等により行う。数値情報または微動指令の入力を受けたコンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９を介してステージ７の駆動機構を動作させて、ステージ７のＺ軸位置を調整する。

次に、使用者は、繰返し周波数の調整を以下の要領で行う（ステップＳ２）。まず、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に２次元レーザ走査とモニタ８２への画像表示を指示する。この指示を受けたコンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９を介して、２次元走査手段４２を駆動させ、試料６の最表面であるＸＹ平面上でレーザ光の光パルスの集光点を走査させる。これによって、光パルスの集光点では、２光子吸収により励起された蛍光が発生する。この蛍光は対物レンズ４５を経てダイクロイックミラー４６で反射され、集光レンズ４７を透過して検知器４８で検出されて電気信号に変換され、外部入出力装置４９でデジタル数値化されてコンピュータ８１に送信される。コンピュータ８１では、集光点の現在のＸＹ平面での走査位置情報と検知器４８で検出された蛍光による電気信号とから所定の観察面の２次元画像を構成し、モニタ８２に表示する。

使用者は、最適な画像輝度となる繰返し周波数を探して設定するために、モニタ８２に表示される画像を見ながら、光パルスの繰返し周波数を順次変更する。この、繰返し周波数の変更は、上記と同様にインタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に数値情報あるいは微変動指令を入力することによって行う。コンピュータ８１は、入力された数値情報または微変動情報に応じて、レーザ制御装置８３に繰返し周波数の変更の命令を送信する。レーザ制御装置８３は、図２に示した短パルス光源２の電気パルス発生器２１を制御して、短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を所望の繰返し周波数に変更する。

前述のように、短パルス光源２は、繰返し周波数によらず略一定の平均光強度の光パルスを出力する一方、ピーク光強度は繰返し周波数に対して反比例の関係にある。このため、繰返し周波数を下げるとピーク光強度が高くなり、試料６においてより多くの多光子励起による蛍光が発生する。このため、コンピュータ８１が処理してモニタ８２に表示する画像の輝度も高くなる。使用者は、このような繰返し周波数の変更による画像の輝度の変化を観察し、例えば画像のコントラストなどの点で、最適な画像が得られる繰返し周波数を見つけて設定する。

使用者が最適な繰返し周波数を設定すると、コンピュータ８１は、この時のステージ７の位置を示すＺ軸位置情報と、繰返し周波数情報とをコンピュータ８１内のメモリに記憶する（ステップＳ３）。

次に、使用者は、ステップＳ１と同様の操作によって、試料６の観察をしたい領域の最深部に光パルスの集光点が位置するようにステージ７を移動させる（ステップＳ４）。そして、ステップＳ２における最表面の場合と同様にして、ステップＳ２の場合と略等しい画像輝度が得られる最適な光パルスの繰返し周波数を設定する（ステップＳ５）。コンピュータ８１は、この時のＺ軸位置情報と繰返し周波数情報とをステップＳ３と同様に、コンピュータ８１のメモリに記憶する（ステップＳ６）。

一般に、試料６の最表面から深部へと多光子励起を行う観測面が移動すると、試料媒質での散乱や吸収により光強度が減衰する。また、多光子励起で試料６から発生した蛍光などの信号光も同様に減衰する。したがって、最深部における光パルスの繰返し周波数は、最表面の場合と比較してより低い設定値となる。

次に、使用者は、観測するＺ軸の範囲とこのＺ軸の範囲でのＺ軸方向の分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する（ステップＳ７）。これらの値が入力されると、前述した最表面と最深部とにおける最適な繰返し周波数に基づき、コンピュータ８１は、観測する各Ｚ軸位置を示す数値と各Ｚ軸位置での繰り返し周波数とを含むテーブルを作成して、コンピュータ８１のメモリに格納する（ステップＳ８）。

図６は、Ｚ軸位置と繰返し周波数との関係を示すテーブルの作成方法を説明するグラフである。図６において、上述したステップＳ３およびステップＳ６で記憶した最表面および最深部についてのＺ軸位置と繰返し周波数とのデータをプロットすると、グラフ上の２点のデータとなる。試料６の特性等に応じて、線形近似、対数近似、累乗近似、または、指数近似などにより、この２点を通る近似式を導出し、この近似式に当てはめて各Ｚ軸位置に対する繰返し周波数を求め、この繰返し周波数をＺ軸位置情報とともに格納したテーブルを生成する。

次に、本実施の形態の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１を用いた顕微鏡観測の観測段階（ステップＳ９〜Ｓ１５）について説明する。

使用者が観測開始の指令を、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に入力すると（ステップＳ９）、図１に示すコンピュータ８１は観測中であることをモニタ８２に表示するとともに、前述の繰返し周波数をＺ軸位置情報とともに格納したテーブルの先頭から、例えば最表面のＺ軸位置とこのＺ軸位置に対応する繰返し周波数とを読み出す。その後、コンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入出力装置４９にステージ７の設定位置として読み出したＺ軸位置を指示し、外部入出力装置４９はステージ７の駆動装置を制御してステージ７をこのＺ軸位置に移動させる（ステップＳ１０）。

移動が完了すると、ステージ７は完了信号を外部入出力４９に出力する。外部入出力装置４９は、これを受け取ると完了信号をコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１はこの完了信号を受け取ると、ステージ７のＺ軸位置に対応する繰返し周波数をレーザ制御装置８３に出力する。レーザ制御装置８３は、コンピュータ８１から入力された繰返し周波数に従い短パルス光源２が動作するように信号パルスを短パルス光源２に出力する。これにより、短パルス光源２は指示された繰返し周波数で光パルスを発振する（ステップＳ１１）。

コンピュータ８１がレーザ制御装置８３へ繰返し周波数を出力した時点から、実際に短パルス光源２が設定された繰返し周波数で動作するのに要する所定の時間が経過すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に２次元走査手段４２の走査開始信号を出力する。外部入出力装置４９は、この信号を受け取ると２次元走査手段４２に走査開始信号を出力する。この２次元走査手段４２は走査開始信号を受け取ると走査を開始するとともに（ステップＳ１２）、試料上の集光点のＸＹ平面内における位置を示す走査位置情報を、外部入出力装置４９に出力する。また、外部入出力装置４９は、パルス光の集光点の２次元走査による多光子励起により発生した蛍光を検出して検出器４８が出力する検出信号を受け取るともにデジタル数値化し、２次元走査手段４２が出力する走査位置情報とともに、外部入出力装置４９内のメモリ上に設けたテーブルに格納する。（ステップＳ１３）。

２次元走査手段４２は、所定の走査を完了すると（ステップＳ１４）完了信号を外部入出力装置４９に出力し、外部入出力装置４９はこの信号を受け取るとコンピュータ８１にこの完了信号を出力するとともに、走査位置情報と検出信号とのテーブルを出力する。コンピュータ８１は、走査位置と検出信号とのテーブルを記憶するとともに、これから観測画像を作成し、モニタ８２に表示させる（ステップＳ１５）。

次に、コンピュータ８１は上述のステップＳ１０〜Ｓ１５の動作が完了すると、前述の繰返し周波数とＺ軸位置情報とを格納したテーブルから、次のＺ軸位置および繰返し周波数を読み出し、このＺ軸位置と繰返し周波数について、ステップＳ１０〜Ｓ１５の動作を行う。このようにして、順次のＺ軸位置に対する測定を行い、全てのＺ軸位置についての測定が完了すると、コンピュータ８１は測定を終了してモニタ８２にその旨を表示する（ステップＳ１６）。

このとき、Ｚ軸位置の変化に対して、図６に示したようにＺ軸位置が試料６の表面から深部へ変化するにつれて、光パルスの繰返し周波数を低く設定するので、光パルスのピーク強度は高くなり、ピーク光強度の二乗に比例する多光子励起効率を高くすることができるので、試料内の散乱・吸収による多光子励起光パルスや試料からの蛍光など信号光の低下を補償することができる。

以上説明したように、本実施の形態によれば、多光子励起による蛍光の顕微鏡観察において、平均光強度が略一定の短パルス光源２を用い、試料６のＺ軸位置に応じて短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を変化させるようにしたので、試料の深部を観測する場合においても光パルスによる過熱により試料を損傷することなく、測定位置の深さに依存せず略等しい輝度の画像を得ることができる。このことは、特に生細胞などを試料とした時に加熱による損傷を低減できるので有利である。また、利得スイッチ半導体レーザに印加するピコ秒からナノ秒の時間幅の電気パルスの繰返し周波数を変更するだけで、短パルス光源の繰返し周波数を瞬時かつ安定に制御することができる。

［第２実施の形態］
本発明の第２実施の形態では、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、試料のＸＹ方向の２次元平面に対して集光点を走査した時、測定する画像の平面内輝度を均一化する。このため、本実施の形態は、使用者によるインタフェース装置８４への入力動作、これに基づくコンピュータ８１によるレーザ制御装置８３を介した短パルス光源２、外部入出力装置４９、並びに、この外部入出力装置４９を介したステージ７および２次走査装置４２の制御の点において第１実施の形態と異なっている。

図７は、光軸からの距離と光パルスの最適な繰返し周波数との関係を説明するためのグラフである。まず、本実施の形態は、所定のＺ軸位置において、光軸と垂直なＸＹ平面を走査する際に、集光点の光軸からの距離に応じて短パルス光源２から出射される光パルスの繰返し周波数を変化させるように設定する。以下にこの繰返し周波数の設定方法について説明する。

図１に示した多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１のように、２次元走査手段４２により入射光パルスを偏向して２次元走査する場合、一般に、ＸＹ平面のほぼ中央である光軸上と、それ以外の点では対物レンズ等の透過光学部品の影響で収差が発生し、集光点の大きさが光軸上の場合と比較して大きくなる。多光子励起により発生する蛍光の強度は、照射される光パルスの光強度の二乗に比例するので集光点が大きくなると、単位面積当たりの光強度が低下して蛍光強度が減少する。

最適な繰返し周波数を求めるに当たり、まず、使用者は、第１実施の形態で説明した方法により、ステージ７を所望のＺ軸位置に調節する。次に、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に、光軸周辺の画像を表示させる命令を入力する。コンピュータ８１はこの命令を受けて、外部入力装置４９により２次元走査手段４２を制御して、光パルスの集光点をＸＹ平面上の光軸上位置の近傍領域のみを走査させる。これによって、当該領域の画像をモニタ８２に表示する。使用者はこの画像を見ながら光パルスの最適な繰返し周波数を設定する。２次元走査手段４２による集光点の走査から、当該領域をモニタへ表示するまでの各構成要素の動作、および、光パルスの最適な繰返し周波数の設定方法は、第１実施の形態と同様である。

その後、使用者は、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に命令を入力して、光パルスの集光点をＸＹ平面上の最外周における所望の点の近傍領域のみを走査させ、当該領域の画像をモニタ８２に表示させ、上記と同様に光パルスの最適な繰返し周波数を設定する。

次に、使用者は、観測するＸＹ平面の光軸からの距離による分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する。この値が入力されると、コンピュータ８１は、前述した中心軸および最外周における最適な繰返し周波数の２点のデータに基づき、試料６の特性等に応じて、線形近似や対数近似によってこの２点を通る近似式を導出し、この近似式に基づき、観測する各光軸からの距離を示す数値と各光軸からの距離に対応する繰り返し周波数とのテーブルを作成して、コンピュータ８１のメモリに格納する。

次に図１を参照して、本実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１の動作について説明する。使用者が、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に観測開始の指令を入力すると、コンピュータ８１は観測中であることをモニタ８２に表示するとともに、外部入出力装置４９に２次元走査手段４２によるＸＹ平面内の集光点の設定位置を指示し、外部入出力装置４９は２次元走査手段４２にこの設定位置へ集光点を移動させる移動指令を出力する。

２次元走査手段４２は移動が完了すると完了信号を外部入出力４９に出力し、外部入出力装置４９はこれを受け取ると完了信号をコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１は、この完了信号を受信すると、２次元走査手段４２の設定位置に対応する短パルス光源２の繰返し周波数を上述のテーブルから読取り、これをレーザ制御装置８３に出力する。レーザ制御装置８３は、受け取った繰返し周波数で短パルス光源２が動作するよう信号パルスを短パルス光源２に出力する。これにより、短パルス光源２は指示された繰返し周波数で光パルスを発振する。

このコンピュータ８１からのレーザ制御装置８３への繰返し周波数が出力された時点から、実際に短パルス光源２が設定された繰返し周波数で動作するのに要する所定の時間が経過すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に検出器４８の信号取得指令を出力する。外部入出力装置４９は、この信号を受け取ると検出器４８が出力する検出信号を受け取るとともにデジタル数値化し、２次元走査手段４２が出力するＸＹ平面内での走査位置情報とともに、走査位置および検出信号のテーブルに蓄積する。外部入出力装置４９は、所望の設定位置の走査が完了するとコンピュータ８１に完了信号を出力し、コンピュータ８１は次の２次元走査手段４２の設定位置の測定へと移る。以下コンピュータ８１は各測定位置について上記と同様に測定とデータの蓄積を行う。

ＸＹ平面内の全ての測定位置の走査を完了すると、コンピュータ８１は外部入出力装置４９に完了信号を出力し、外部入出力装置４９は、走査位置情報と検出信号のテーブルとをコンピュータ８１に出力する。コンピュータ８１は、走査位置情報と検出信号とのテーブルを記憶するとともに、これから観測画像を生成するとともに、この画像および完了した旨の表示をモニタ８２に表示する。

以上説明したように、本実施の形態によれば、入射光パルスを偏向して試料を走査する多光子励起による蛍光の顕微鏡観察において、平均光強度が略一定の短パルス光源２を用い、集光点の走査による２次元平面内の観測時に、試料６の光軸からの距離に応じて短パルス光源２から出射する光パルスの繰返し周波数を変化させるようにしたので、試料の最外周を観測する場合においても、光パルスによる過熱により試料を損傷することなく、光学系の収差等による観測点の光量低下や集光点サイズの増大による、多光子励起の効率低下や試料からの蛍光の低下を補償し、測定位置の光軸からの距離に依存せず、観察する平面内で略等しい輝度の画像を得ることができる。このことは、第１実施の形態と同様に、生細胞を試料とするときに有利である。

［第３実施の形態］
本発明の第３実施の形態は、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、第１実施の形態と第２実施の形態とを組み合わせて、試料を３次元的に観測して画像化する際に、観測領域内である特定領域について強調した画像を得るものである。

このため、本実施の形態は、使用者によるインタフェース装置８４への入力動作、これに基づくコンピュータ８１によるレーザ制御装置８３を介した短パルス光源２、外部入出力装置４９、並びに、この外部入出力装置４９を介したステージ７および２次走査装置４２の制御の点において第１実施の形態および第２実施の形態と異なっている。

図８は、特定領域の設定方法を示す説明図である。本実施の形態では、三次元試料内の光軸と平行なＺ軸位置について少なくとも三点について、光軸と垂直なＸＹ軸平面についてレーザ走査による観測を行う。

まず、使用者は、所定の３つのＺ軸位置、例えば、所望の観察範囲におけるＺ軸方向の最表面（Ｚ１）、最深部（Ｚ３）、および、Ｚ１とＺ３との中間（Ｚ２）のそれぞれについて、第１実施の形態および第２実施の形態に記載した設定段階の動作と同様にして、光軸からの距離に応じた最適な繰返し周波数を決定するとともに、モニタ画像を参照しながら、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に特定領域設定コマンドを用いて領域を設定する。これにより、コンピュータ８１は、この設定した特定領域をＺ軸位置とともに記憶する。

次に、使用者は、所望の観察範囲におけるＺ軸方向の分割数を、インタフェース装置８４に数値入力することによって、コンピュータ８１に設定する。コンピュータ８１は、観測を行った最表面のＺ１から中間のＺ２を経て最深部のＺ３までの、Ｚ軸を設定された分割数により分割する。コンピュータ８１は、この分割した各Ｚ軸位置がＺ１とＺ２との間にあるときは、このＺ軸位置に対応するＸＹ平面上での特定領域を、Ｚ１およびＺ２の輪郭から内挿することによって設定し、また、Ｚ２とＺ３との間にあるときは、このＺ軸位置に対応するＸＹ平面上での特定領域を、Ｚ２およびＺ３の輪郭から内挿することによって設定する。

その後、コンピュータ８１は、特定領域外については、蛍光強度が低くなるように、例えば所定の１を超える係数を乗じることなどにより、繰返し周波数を高くした値を算出して、その値を当該測定位置の光パルスの繰返し周波数とする。図９の右側に示すグラフには、Ｚ１とＺ３とのＸＹ平面について、このようにして得られた光軸からの距離と光パルスの繰返し周波数との関係を示すグラフを表している。

コンピュータ８１は、これらの繰返し周波数を、Ｚ軸位置およびＸＹ平面内の位置情報とともに、コンピュータ８１内のメモリに設けられたテーブルに格納する。その後、使用者が、インタフェース装置８４を介してコンピュータ８１に観測開始の指令を入力すると、コンピュータ８１は、レーザ走査型顕微鏡４の外部入力装置４９を介して２次元走査手段４２にＸＹ平面内での走査を開始させるとともに、順次Ｚ軸位置を前述の分割した各Ｚ軸位置に移動させて、観測を行う。このとき、コンピュータ８１は、Ｚ軸位置およびＸＹ平面内の位置情報に基づいて、各観測点に対応した光パルスの繰返し周波数を前述のテーブルから読み出し、第１実施の形態および第２実施の形態で説明したように、レーザ制御装置８３を介して短パルス光源２からこの繰り返し周波数の光パルスを出射させる。

その後、第１実施の形態で説明したのと同様の動作により、コンピュータ８１は、外部入力装置４９からの各観測点の位置情報および検出信号を記憶するとともに、これから観測画像を作成しモニタ８２に表示する。このとき、特定領域には繰返し周波数が特定領域外よりも低く、ピーク光強度の高い光パルスが照射されるため、特定領域外の領域より輝度の高い画像が得られる。

以上説明したように、本実施の形態によれば、図１に示した構成の多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、第１実施の形態と第２実施の形態とを組み合わせて、試料６を３次元的に観測して画像化する際に、試料６の特定領域の繰返し周波数を特定領域外の繰返し周波数よりも低くして、試料６に光パルスを照射したので、試料内の特に強調して観測したい領域のみ多光子励起強度を高めて、試料からの強い信号光を得ることが可能となり、信号光の検出器感度の制御や、観測後の信号処理を加えることなく、試料内の特定領域を強調することが可能となる。

［第４実施の形態］
図１０は、本発明の第４実施の形態に係る多光子励起測定装置の概略構成図である。本実施の形態は、図１に示された第１〜第３実施形態における多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４とを光ファイバを用いて着脱可能に接続したものであり、その他の部分は第１〜第３実施の形態における構成と同様であるので、異なる部分のみ説明を行う。

このため、本実施の形態では、短パルス光源２には光パルスを出射させる光ファイバコネクタ３２を設け、レーザ走査型顕微鏡４にも光パルスを入射させる光ファイバコネクタ３３を設ける。さらに、光ファイバコネクタ３２と３３との間は、シングルモード光ファイバ３１で接続する。また、レーザ走査型顕微鏡４には、光ファイバコネクタ３３を出射した光パルスを略平行光にするコリメートレンズ５１が設けられる。シングルモード光ファイバ３１は光パルスの波長に対して損失が小さく、長さは１ｍから５ｍの範囲が望ましく、例えば本実施の形態では、長さを１．５ｍとする。

以上のような構成によって、短パルス光源２から出射する光パルスは、シングルモード光ファイバ３１でレーザ走査型顕微鏡４に入射する。この様な構成によっても、第１〜第３実施の形態で示した多光子励起による蛍光顕微鏡観測が可能となる。

以上説明したように、本実施の形態によれば、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４とを、光ファイバを介して着脱可能に接続したので、短パルス光源２とレーザ走査型顕微鏡４との光学的接続が容易となり、顕微鏡システムのレイアウトの自由度を高めることができる。

［第５実施の形態］
図１１は、本発明の第５実施の形態に係る多光子励起測定装置の概略構成図である。本実施の形態は、図１０に示した多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、シングルモード光ファイバ３１と協働して、光パルスの時間幅を圧縮する機構を設けたものである。

このため、本実施の形態では、レーザ走査型顕微鏡４に、負の分散補償装置５３と、コリメートレンズ５１を出射した光パルスを反射して上述の負の分散補償装置５３に入射させるミラー５２と、この負の分散補償装置５３から出射した光パルスをミラー４１へ入射させるミラー５４とをさらに設ける。

負の分散補償装置５３は、２枚の回折格子５５、５６およびミラー５７を含み、ミラー５２で反射された光パルスを２枚の回折格子５５、５６で回折をさせて反射した後、ミラー５７でその光軸を紙面と垂直方向に折り返し、再び２枚の回折格子５５，５６で回折させ反射してミラー５４へ出射させる。このように、ミラー５７で反射させ、回折格子５５、５６を往復させることにより、光パルスは、入射時とほぼ同じ円形の空間分布で負の分散補償装置５３を出射することができる。

また、本実施の形態におけるシングルモード光ファイバ３１の長さは、例えば１５ｍである。

図１１において、短パルス光源２からシングルモード光ファイバ３１に入射した光パルスは、シングルモード光ファイバ３１内で非線形光学現象である自己位相変調（ＳＰＭ）により光スペクトルが拡大し、同時に、正の群速度分散（ＧＶＤ）により長波長から短波長に時間的にチャープされた数十ピコ秒の光パルスとなる。

この光パルスはレーザ走査型顕微鏡４に入射し、コリメートレンズ５２で略平行光化された後、ミラー５２により反射される。その後、光パルスは負の分散補償装置５３に入射し、ここで負の群速度分散を受ける。シングルモード光ファイバ３１の正のＧＶＤで生じたチャープは、負の分散補償装置５３で逆のＧＶＤを受けチャープが補償される。また、シングルモード光ファイバ３１でのＳＰＭにより光スペクトルが拡大しているので、短パルス光源２から出力された数ピコ秒幅の光パルスは、数百フェムト秒の光パルスに圧縮される。

時間幅が圧縮された光パルスは、負の分散補償装置５３を出射して、ミラー５４で反射され、ミラー４１に入射する。その後の光パルスの光路は、第１〜第４実施の形態と同様である。

以上説明したように、本実施の形態によれば、シングルモード光ファイバと負の分散補償装置とを設けて光パルスを圧縮するようにしたので、第４実施の形態の効果に加え、数ピコ秒の光パルスを発振する短パルス光源２を使用しながら、非線形パルス圧縮によりこの短パルス光源２から出射する光パルスを圧縮することで、より高い効率の多光子励起が可能なよりピーク光強度の高いフェムト秒の光パルスを試料に照射することが可能となる。また、より安定な数ピコ秒の光パルスを発振する短パルス光源２を用いながら、高価で不安定なフェムト秒の光パルスを発振する短パルス光源を用いた場合と同様の効果を得ることができる。

［第６実施の形態］
本発明の第６実施の形態は、上述した、第１〜第５実施の形態における多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム１において、短パルス光源２を、半導体レーザ２２を用いずに、能動モードロックファイバリングレーザ９を用いて構成したものである。

図１２は、第６実施の形態に係る短パルス光源２の概略構成図である。この短パルス光源２は、能動モードロックファイバリングレーザ９と、この能動モードロックファイバリングレーザ９から出射した光パルスを増幅するファイバ増幅器２４、２５とから構成する。ファイバ増幅器２４、２５は、図２を参照して第１実施の形態で説明した短パルス光源２の増幅器２４、２５と同様の特性を有する。

能動モードロックファイバリングレーザ９は、分岐カプラ９１、利得部９２、バンドパスフィルタ９３、アイソレータ９６および分散補償手段９７を含んで構成し、これら光学部品の間はシングルモード光ファイバ９４によりリング状に接続する。さらに、能動モードロックファイバリングレーザ９は、利得部９２に接続された信号発生器９５を備える。

利得部９２は、希土類添加ファイバにより成る利得媒質とＬＮ（ＬｉＮｂＯ_３）変調器より成る強度変調器とから構成する。ここで、希土類添加ファイバは、Ｙｂが添加されたシングルモード光ファイバである。この希土類添加ファイバには図示しないＷＤＭ（波長分割多重）カプラを接続し、このＷＤＭカプラの合波側には図示しない励起用光源である半導体レーザを光学的に接続する。ここでは半導体レーザは連続発振をする波長９１５ｎｍのレーザであり、この半導体レーザからの光がＷＤＭカプラによりＹｂ添加ファイバに吸収されることにより９８０ｎｍ帯の利得が発生するように構成する。

分岐カプラ９１は入射した光を設定した比率により分岐するものであり、シングルモード光ファイバ９４に分岐する比率を反射率と呼び、ファイバ増幅器２４への分岐比率を透過率と呼ぶ。

分散補償手段９７は負の分散量を持ち、シングルモード光ファイバ９４および利得部９２の利得媒質が有する正の分散を相殺して、能動モードロックファイバリングレーザ９のリング部分全体としてゼロ分散状態となるようにして、波長により周回速度が異ならないようにする。

アイソレータ９６は一方向にのみ光を伝播させる。本実施の形態では、図１２において順時計方向、すなわち、分散補償手段９７からの光をバンドパスフィルタ９３の方向にのみ伝播させ、その逆方向の光は透過させない。

バンドパスフィルタ９３は特定の波長帯域にのみ透過特性を持つものであり、これにより広帯域な波長帯である自然放出光を透過させるとともに、これと異なる波長の光により発振が生じることを抑止する。

信号発生器９５は、利得部９２の強度変調器に接続されており、レーザ制御装置８３からの指令により、この利得部の時間的な透過特性を変調することができる。

以上のような構成により、利得部９２から発した自然放出光は、シングルモード光ファイバ９４を介して分岐カプラ９１で一部がファイバ増幅器２４へ分岐し、残りの部分が分散補償手段９７、アイソレータ９６、バンドパスフィルタ９３の順に伝播し、再び利得部９２のＹｂ添加ファイバに到達し増幅される。利得部９２による利得が、分岐カプラ９１の透過率とその他損失の合計を上回ると、この自然放出光がこのリング状の経路の伝播過程を繰り返すことにより増幅され、レーザ発振する。

ここで、利得部９２の利得発生の時間幅とタイミングが、利得発生時に自然放出光がシングルモード光ファイバ９４で接続されたリング状の経路を周回して、再び利得部９２に到達する時間間隔に一致するように、図示しない強度変調器に接続された信号発生器９５の信号発生周波数を設定することにより、モードロック状態が達成される。この場合、分岐カプラ９１からファイバ増幅器２４に出射するレーザ光は、信号発生器９５の信号発生周波数と同じ繰返し周波数を有するパルス光となる。

さらに、上記リング状の経路の周回を繰り返すことによって、能動モードロックファイバリングレーザ９から発振するレーザ光の光パルスの時間幅を数ピコ秒の短パルス光とすることが可能となる。また、このモードロック状態は、シングルモード光ファイバ９４で接続されたリング状の経路内に１個の光パルスが存在する場合を基本状態とし、２個以上の光パルスが存在するようにもできる。これは、信号発生器９５の周波数を基本状態の整数倍に設定することにより可能となる。これによって、基本状態における光パルスの周波数の整数倍の値に、光パルスの繰返し周波数を調整することができる。

このようにして、能動モードロックファイバリングレーザ９から出射した短パルス光は、２つのファイバ増幅器２４、２５で数十ｍＷから数Ｗの平均光強度（平均出力）に増幅され、短パルス光源２から出力される。このようにして出射された光パルスを用いることで、第１〜第５実施の形態に記載したと同様な観測を行うことができる。

以上説明したように、本実施の形態によれば、短パルス光源２に能動モードロックファイバリングレーザ９を用いたので、能動モードロックファイバリングレーザ９の強度変調器に印加する変調電気信号の繰返し時間間隔を変更するだけで、短パルス光源２の繰返し周波数を瞬時かつ安定に制御することが可能となる。

以上，本発明の実施の形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこれらの実施の形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で幾多の変形または変更が可能である。

例えば、多光子励起測定装置として多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを例として説明を行ったが、多光子励起（非線形励起）を伴う他の顕微鏡システムにも適用が可能である。また、試料としては主として生細胞を対象として説明を行ったが、半導体材料など他の試料に対しても適用可能である。

図２を用いて第１実施の形態で説明した半導体レーザ２２は、面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）に限られず、量子井戸分布帰還型レーザダイオード（ＱＷＤＦＢＬＤ）や量子ドット分布帰還型レーザダイオード（ＱＤＤＦＢＬＤ）等が使用可能である。また、ファイバ増幅器２４、２５は、半導体レーザで励起されるＹｂがドープされたシングルクラッド光ファイバであるとしたが、これに限られない。ファイバ増幅器の増幅にはファイバレーザを用いても良く、被励起媒質はＮｄやＴｍやＥｒがドープされたシングルクラッドまたはダブルクラッド、断面に空孔がある光ファイバ等を用いても良い。

また、本発明の第１実施の形態では光軸に平行なＺ軸上のＺ軸位置について、最表面と最深部の２点のデータから近似を行ったが、３つ以上のＺ軸位置について測定を行い３点以上から近似を行っても良い。

さらに、第２実施例においては、光軸上と最外周における２点のデータから近似を行ったが、３つ以上の光軸からの距離の位置で測定を行い３点以上から近似を行っても良い。また収差の場合、光学シミュレーションの結果と実際の結果は比較的一致するので、測定は光軸上の１点とし、光学シミュレーションによる近似式にこの測定結果を代入して用いる近似式としても良い。

第３実施の形態では、図８において特定領域を円で設定しているが、三角形、四角形または多角形であっても良い。また、測定するＺ軸位置を３点としたが、より多くの位置で測定をすることが望ましい。さらに、第３実施の形態では、特定領域の内外で繰り返し周波数を変更する例を示したが、照明光学系と平行なＺ方向および光軸と垂直なＸＹ面内の任意の組合せの座標に相当する観測点において、照明用光源と観察点とを結ぶ直線距離が遠いほど繰返し周波数を低くするような制御を行って、３次元的に一定の蛍光輝度を得るようにしても良い。

さらに、第５実施の形態において、負の分散補償装置５３としては、回折格子対に代えてプリズム対、グリズム対などを使用することもできる。

また、第６実施の形態において、利得部９２は、利得媒質である希土類添加ファイバと強度変調器との組合せのものを使用したが、これに限られない。例えば、利得媒質と変調手段を兼ねる半導体光増幅器を使用しても良い。

第１実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。 第１実施の形態に係る短パルス光源の概略構成図である。 短パルス光源から出射する光パルスの繰返し周波数と平均出力、パルス幅およびピーク光強度の関係を示すグラフである。 短パルス光源から出射する光パルスの繰返し周波数に対するパルス波形のグラフである。 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムを用いた顕微鏡観測の手順を示すフローチャートである。 Ｚ軸位置と繰返し周波数との関係を示すグラフである。 光軸からの距離と繰返し周波数との関係を示すグラフである。 特定領域の設定方法を示す説明図である。 特定領域内外での繰返し周波数の設定方法を説明する説明図である。 第４実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。 第５実施の形態に係る多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システムの概略構成図である。 第６実施の形態に係る短パルス光源の概略構成図である。 従来例の光子励起型顕微鏡システムの概略構成図である。

符号の説明

１ 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム
２ 短パルス光源
４ レーザ走査型顕微鏡
６ 試料
７ ステージ
９ 能動モードロックファイバリングレーザ
２１ 電気パルス発生器
２２ 半導体レーザ
２３ シングルモード光ファイバ
２４、２５ ファイバ増幅器
３１ シングルモード光ファイバ
３２、３３ 光ファイバコネクタ
４１ ミラー
４２ ２次元走査手段
４３ 瞳投影レンズ
４４ 結像レンズ
４５ 対物レンズ
４６ ダイクロイックミラー
４７ 集光レンズ
４８ 検出器
４９ 外部入出力装置
５１ コリメートレンズ
５２ ミラー
５３ 負の分散補償装置
５４ ミラー
５５、５６ 回折格子
５７ ミラー
８１ コンピュータ
８２ モニタ
８３ レーザ制御装置
８４ インタフェース装置
９１ 分岐カプラ
９２ 利得部
９３ バンドパスフィルタ
９４ シングルモード光ファイバ
９５ 信号発生器
９６ アイソレータ
９７ 分散補償手段
１０１ 多光子励起レーザ走査型蛍光顕微鏡システム
１０２ 光源装置
１０３ ２次元走査機構
１０４ ミラー
１０５ 対物レンズ
１０６ Ｚ軸方向駆動部
１０７ 試料
１０８ コンピュータ
１０９ レーザ制御装置
１１０ 走査制御装置
１１１ レーザパワーコントローラ
１１２ メモリ装置
１１３ モニタ

Claims (10)

1. 高強度の光パルスによる多光子吸収現象を用いて試料の測定を行う多光子励起測定装置であって、
   繰返し周波数が調整可能な光パルスを出射する短パルス光源と、
   前記短パルス光源から出射した光パルスを前記試料内の観測点に集光させて照射する照明光学系と、
   前記光パルスの照射により前記観測点から発生する多光子励起にともなう信号光を検出する検出器と、
   前記試料内の前記観測点の位置を変位させる観測点変位手段と、
   前記観測点変位手段による前記観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御する制御手段と、
   前記検出器により検出された前記信号光による信号を情報化して表示する表示手段と
   を備えたことを特徴とする多光子励起測定装置。
2. 前記短パルス光源は、出射する光パルスの強度の尖頭値を、前記繰返し周波数に応じて制御することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起測定装置。
3. 前記短パルス光源は、平均光強度が略一定の光パルスを出射することを特徴とする請求項１または２に記載の多光子励起測定装置。
4. 前記短パルス光源は、パルス幅が略一定の光パルスを出射することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
5. 前記観測点変位手段は、前記照明光学系と前記試料とを前記照明光学系の光軸方向に相対的に変位させるように構成し、
   前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と平行な方向における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
6. 前記観測点変位手段は、前記照明光学系の光軸に垂直な面内で、前記短パルス光源から出射した光パルスを２次元方向に偏向する２次元走査手段を有し、
   前記制御手段は、前記観測点変位手段による前記照明光学系の光軸と垂直な面内における観測点の位置に応じて、前記短パルス光源から出射される前記光パルスの繰返し周波数を制御することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
7. 前記短パルス光源は、光パルスを発生する光源と、該光源からの光パルスを増幅するファイバ増幅器とを有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。
8. 前記光源は、利得スイッチ半導体レーザを含んで構成されることを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。
9. 前記光源は、能動モードロックファイバリングレーザを含んで構成されることを特徴とする請求項７に記載の多光子励起測定装置。
10. 前記短パルス光源と前記照明光学系との間に、非線形パルス圧縮手段を備えたことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の多光子励起測定装置。

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