JP2013195522A - 多光子励起観察装置 - Google Patents

Abstract

【課題】ＡＯＭなどの調光部を設けることなく、標本に対して画像生成に寄与しない光パルスを照射せずに、各画素周期において均一な条件で標本からの反射光、蛍光または透過光を検出して、定量性のある画像を取得する。
【解決手段】多光子励起観察装置は、レーザ光源１１において、電気パルサーから出力される電気パルスにより半導体レーザを利得スイッチ発振させ、出射する光パルスに光増幅および非線形パルス圧縮を行い、出射される光パルスをスキャナ１３により標本Ａ上で走査させて、発生する標本Ａからの蛍光を、光検出部２５により光強度信号に光電変換して、画像情報生成部３３で画素周期中に得られる光強度信号を画素毎に加算して画像情報を生成する。制御部３２は、標本Ａに照射される光パルスが、画素周期毎に同数となるように、電気パルサーを制御する。
【選択図】図１

Description

本発明は、多光子励起観察装置に関するものである。

従来、チタンサファイアレーザなどのモードロックレーザを用い、高ピークパワーの超短パルス列のレーザ光を発生させ、このレーザ光をスキャナにより標本上で走査させることによって、標本から得られる蛍光を検出し画像情報を生成する多光子励起観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。

例えば、特許文献１に開示の多光子励起観察装置では、図１１に概略構成を示すように、チタンサファイアレーザのレーザ光源１１１から出射した光パルス列を、スキャナ１１３で走査し、対物レンズ１２３により標本Ａ上に照射している。そして、標本Ａ上へのレーザ光の照射によって生じる多光子蛍光を、光電変換素子１２５により電気信号に変換し得られる強度信号を、制御部１３２の制御に基づき光検出回路１３１で画素周期毎に積算し画像生成部１３３に出力している。

ここで、モードロックレーザは、連続光のノイズ成分がカーレンズ効果などにより選択的に増幅されることで短パルス列を発生させる受動モードロック方式であり、光パルス列の間隔は、選択的に増幅される光パルスの光共振器内の周回時間（光共振器の長さに対応）によって決まる。このため、外部から光パルスのタイミングや繰返し間隔（繰返し周波数）を制御することができない。また、共振ガルバノスキャナなどの２次元方向にレーザ光を走査させるスキャナでは、走査領域の端部で走査速度が遅く、中心部で走査速度が速くなる。したがって、必ずしも画素周期と光パルスの繰り返し周期とは同期せず、標本の走査領域の中心部では、端部と比べて照射される光パルスが少なくなる場合がある。このような場合に、画素周期ごとに光パルスに対応して発生する蛍光を全て積算すると、同質で均一な蛍光体であっても、画素毎に輝度が異なってしまい、明るさにむらが生じる。

そのため、特許文献１に開示の発明では、画像情報生成部１３３によって、画素周期毎に同数の光パルスに対応する蛍光のみの光強度信号を積算する方法や、レーザ光源１１１とスキャナ１１３との間に、高速に応答可能な音響光学素子（ＡＯＭ）により構成される調光部１１２を設けて光パルスを間引く方法を提案している。

特開２０１０−１１３０６２号公報

しかしながら、画像情報生成部１３３により画素周期毎に同数の光パルスに対応する蛍光のみの光強度信号を積算する方法では、標本に対して画像情報に寄与しない光パルスを照射することになり、これによる蛍光マーカの褪色など標本の劣化が発生し、長時間生細胞などの標本を観察することが困難であった。

一方、レーザ光源１１１とスキャナ１１３との間に調光部１１２を設け、光パルスを間引く方法では、標本に対して画像情報に寄与しない光パルスを照射することを避けることができる。しかし、図１２に示すように、音響光学素子（ＡＯＭ）を用いるために、一般的に小さいＡＯＭのビーム開口径とレーザ光源のビーム径とを合わせるために、第１のズーム光学系１１４を設ける必要がある。また、ＡＯＭを動作させるための高周波ドライバーが必要であり、高速応答させるために高価なドライバーを用いる必要がある。さらに、ＡＯＭのビーム開口径とスキャナ１１３（多光子励起観察装置）の瞳径を合わせるために、第２のズーム光学系１１５を設ける必要がある。このように、調光部１１２を設けると周辺要素も必要となり装置が大型且つ高価になり、またビームのアライメントも必要となるという課題があった。

したがって、これらの点に着目してなされた本発明の目的は、ＡＯＭなどの調光部を設けることなく、標本に対して画像生成に寄与しない光パルスを照射せずに、各画素周期において均一な条件で標本からの反射光、蛍光または透過光を検出して、定量性のある画像を取得することができる多光子励起観察装置を提供することにある。

上記目的を達成する第１の観点に係る多光子励起観察装置の発明は、
電気パルスを出力する第１の電気パルス発生器および該電気パルスにより利得スイッチ発振する半導体レーザを含み、該半導体レーザから出射される光パルスに光増幅および非線形パルス圧縮を行い第１の光パルスとして出射する第１のレーザ光源と、
該第１のレーザ光源から出射される前記第１の光パルスを被観察物上で走査させるスキャナと、
前記第１の光パルスの走査によって生じる被観察物からの反射光、蛍光または透過光を受け、光強度信号に光電変換する光検出部と、
画素周期中に得られる前記光強度信号を画素毎に加算して画像情報を生成する画像情報生成部と、
前記被観察物に照射される前記第１の光パルスが、前記画素周期毎に同数となるように、前記第１の電気パルス発生器を制御する制御部と
を備えることを特徴とするものである。

ここで、画素周期は、画像を形成する各画素に対応する標本上の領域の走査時間（あるいは、各画素のサンプリング可能な時間）を意味する。このようにすることによって、外部から第１の光パルスの出射タイミングが設定可能となり、調光部を設けて光パルスを間引いたり、画素情報に寄与しない光パルスの照射をしたりすること無く、各画素周期において均一な条件で標本からの蛍光を検出して、定量性のある画像を取得することが可能となる。

第２の観点に係る発明は、第１の観点に係る多光子励起観察装置において、前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器の出力する電気パルスの繰返し間隔および発振数を設定し、且つ、前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器に発振指令信号を送信し、前記設定された繰返し間隔および発振数に基づいて前記電気パルスを出力させることを特徴とするものである。

このようにすることによって、第１の観点に係る発明の効果に加え、例えば不定期間隔のピクセル同期信号を発振指令信号としても、各画素周期において均一な条件で標本からの蛍光を検出して、定量性のある画像を取得することが可能となる。

第３の観点に係る発明は、第２の観点に係る多光子励起観察装置において、
前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器の出力する電気パルスの、前記発振指令信号に対する遅延時間を設定することを特徴とするものである。

このようにすることによって、第２の観点に係る発明の効果に加え、第１の光パルスの発振指令信号を受けてからの出射のタイミングを制御することができる。

第４の観点に係る発明は、第１〜第３の観点に係る多光子励起観察装置において、
前記制御部は、前記スキャナが所定の被観察領域以外の領域を走査する状態にあるときは、前記発振指令信号を送信しないことを特徴とするものである。

このようにすることによって、第１〜第３の観点に係る発明の効果に加え、被観察領域以外の領域に、標本のダメージにつながる不要な光パルスを照射することを避けることができる。

第５の観点に係る発明は、第３の観点に係る多光子励起観察装置において、
第２の光パルスを出射する第２のレーザ光源と、前記第１の光パルスの光路および前記第２の光パルスの光路を前記スキャナの前段で結合させる光路結合手段とを備え、前記制御部は、前記第１の光パルスと前記第２の光パルスとが、同時に前記被観察物に照射されないように、前記遅延時間を設定することを特徴とするものである。

このようにすることによって、第３の観点に係る発明の効果に加え、複数のレーザ光源の異なる励起波長で異なるマーカを励起して観察する際に、各々の光パルス間隔を詳細に調整出来るようになることで、光パルスの同時照射による標本へのダメージを抑止し、且つ、標本のマーカ間の相互作用（光刺激）をより正確に観察することが出来る。

第６の観点に係る発明は、第５の観点に係る多光子励起観察装置において、
前記第２のレーザ光源は、前記第２の光パルスを生成するための第２の電気パルス発生器を備え、前記制御部は、前記第１の光パルスと前記第２の光パルスとが、略等しい繰返し間隔でタイミングをずらして出射されるように、前記第１の電気パルス発生器および前記第２の電気パルス発生器の発振指令信号からの遅延時間を設定することを特徴とするものである。

このようにすることによって、第５の観点に係る発明の効果に加え、第２のレーザ光源も電気パルス発生器により駆動されるので、第１および第２のレーザ光源を連動させて、光パルス出力の周期やタイミングをより精緻に制御することができる。

第７の観点に係る発明は、第５の観点に係る多光子励起観察装置において、
前記第２のレーザ光源は、モードロックレーザであることを特徴とするものである。

このようにすることによって、第５の観点に係る発明の効果に加え、免疫・発生分野などで多数のマーカを同時に長時間観察したいニーズに対して、複数の励起波長で同時に複数のマーカを観察する際、励起光パルスの一方に外部から光パルスのタイミングを制御不能なモードロックレーザを用いても、時間差を与えて照射でき、これにより標本ダメージ（褪色）を抑えて長時間観察が可能になる。

第８の観点に係る発明は、第１〜第７の観点の何れかに係る多光子励起観察装置において、
前記制御部は、前記電気パルスの発振数を、前記検出部により得られる前記光強度信号に基づいて設定することを特徴とするものである。

このようにすることによって、第１〜第７の観点に係る発明の効果に加え、高速繰返しが可能な利得スイッチ半導体レーザでは、数百ＭＨｚの光パルス間隔を電気パルス発生器の出力信号の設定で発振可能なので、この発振数を変更することで試料の各画素周期当たりに照射する光パルス数（照射強度）を、所望の強度信号が得られるように調整することができる。

本発明によれば、画素周期毎に、被観察物に照射される第１の光パルスが同数となるように、第１の電気パルス発生器を制御するようにしたので、高価かつアライメント調整を要するＡＯＭなどの調光部を設けることなく、標本に対して画像生成に寄与しない光パルスを照射せずに、各画素周期において均一な条件で標本からの反射光、蛍光または透過光を検出して、定量性のある画像を取得することができる。

第１実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。 図１の多光子励起観察装置のレーザ光源の概略構成を示す図である。 図１の多光子励起観察装置のピクセル同期信号と電気パルサーの出力パルスとの関係を説明する図である。 図１の多光子励起観察装置のガルバノ走査速度とピクセル同期信号と電気パルサーの出力信号との関係を説明する図である。 図１の多光子励起観察装置のピクセル同期信号と電気パルサーの出力パルス数による強度調整を説明する図である。 観察範囲のスキャナによる走査を説明する図である。 第２実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。 図７の多光子励起観察装置のピクセル同期信号と電気パルサーの出力パルスとの関係を説明する図である。 第３実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。 図９の多光子励起観察装置のピクセル同期信号と電気パルサーの出力パルスとの関係を説明する図である。 従来例に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。 従来例に係る多光子励起観察装置の調光部周辺の構成を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。

（第１実施の形態）
図１は、第１実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。多光子励起観察装置１は、この場合レーザ走査型顕微鏡であり、レーザ光を射出するレーザ光源装置２と、レーザ光源装置２からのレーザ光を標本Ａ（被観察物）に照射して標本Ａを観察するための顕微鏡本体３と、レーザ光源装置２および顕微鏡本体３を制御する制御装置４とを主な構成要素として備えている。

レーザ光源装置２は、レーザ光を射出するレーザ光源１１（第１のレーザ光源）と、レーザ光源１１から出射されたレーザ光を走査するスキャナ１３とを備えている。スキャナ１３は、例えば、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、音響光学偏向素子等が用いられる。図示のスキャナ１３は、アルミコートされた一対のガルバノミラー１５ａ，１５ｂを有しており、制御装置４からの指示により、ガルバノミラー１５ａ，１５ｂの角度を変化させ、ラスタスキャン方式で駆動されるようになっている。これにより、レーザ光源１１からのレーザ光を標本Ａ上において２次元的に走査させることができるようになっている。

顕微鏡本体３は、レーザ光源１１から射出されスキャナ１３により走査されたレーザ光を対物レンズ２３へリレーするレンズ２２，レンズ２４と、レーザ光源１１からのレーザ光を標本Ａに照射する一方、標本Ａから戻る反射光または蛍光を集光する対物レンズ２３と、レーザ光の光路と標本Ａからの反射光または蛍光の光路とを分岐するダイクロイックミラー２１と、ダイクロイックミラー２１により分岐された標本Ａからの反射光または蛍光を検出する光電変換素子（光検出部）２５とを備えている。

ダイクロイックミラー２１は、レーザ光源装置２からのレーザ光を対物レンズ２３に向けて反射させる一方、対物レンズ２３により集光された標本Ａからの反射光または蛍光を透過させることで、照明光としてのレーザ光の光路から標本Ａからの反射光または蛍光の光路を分岐するようになっている。なお、以降では説明を簡略化するために、ダイクロイックミラー２１は、標本Ａからの蛍光のみを透過させ、標本Ａからの反射光については透過させないこととし、標本Ａからの蛍光を観察する場合を例として説明する。

光電変換素子２５は、例えばＰＭＴ（Photo Multiplier Tube）やＡＰＤ（Avalanche Photo Diode）であり、ダイクロイックミラー２１を透過してきた標本Ａからの蛍光を光電変換し、得られた光強度信号を制御装置４に出力するようになっている。

制御装置４は、光電変換素子２５からの光強度信号にＡ／Ｄ変換等の処理を施す光検出回路３１と、Ａ／Ｄ変換された光強度信号から画像情報を生成する画像情報生成部３３と、画像情報生成部３３により生成された画像情報を画面に表示する表示モニタ３４と、多光子励起観察装置１の各部を制御する制御部３２とを備えている。

次に、レーザ光源１１について図２を用いて説明する。図２は、レーザ光源１１の概略構成を示す図である。レーザ光源１１は、電気パルサー（第１の電気パルス発生器）４０、半導体レーザ４１、分散補償ファイバ４２、第１の光アンプ４３、光フィルタ４４、第２の光アンプ４５およびパルス圧縮部４６を備える。

電気パルサー４０は、外部入力信号に基づいて、１ナノ秒以下の電気パルスを生成し、半導体レーザ４１に印加する。半導体レーザ４１は、電気パルサー４０からの電気パルスを受けて、利得スイッチ動作により短波長成分が先行するチャープした、時間幅数十ピコ秒で光スペクトル幅が０．５ナノメートルから数ナノメートルの光パルスを発振する。半導体レーザ４１としては、分布帰還型半導体レーザ（ＤＦＢ−ＬＤ）や面発光半導体レーザ（ＶＣＳＥＬ）、量子ドット半導体レーザ（ＱＤ−ＬＤ）が使用可能であり、望ましくはＶＣＳＥＬである。ＶＣＳＥＬは、発振する光パルスの空間への発散角が水平方向と垂直方向で同一であり、光ファイバとの結合が容易かつ高効率で可能である。

分散補償ファイバ４２は半導体レーザ４１の発振波長に対してシングルモードのみ伝播するファイバである。シングルクラッドファイバや、フォトニック結晶ファイバ（ＰＣＦ）が使用可能である。分散補償ファイバ４２の長さは，半導体レーザ４１が発振する光パルスのチャープ量（フーリエ限界との差）を補償するように設定され、数百メートルから１キロメートル程度である。半導体レーザ４１から出射したチャープした光パルスは、正常分散を持つ分散補償ファイバ４２でチャープが補償され、フーリエ限界（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｌｉｍｉｔ：ＴＬ）パルスである、数ピコ秒の光パルスとなる。

半導体レーザ４１の利得スイッチ動作で発振する光パルスの強度は、サブピコジュールから数ピコジュールであり、多光子励起観察装置で必要とされるパルスの強度である数十ナノジュールと比べて４桁以上微弱である。この微弱な光パルスを４桁以上増幅するために、第１の光アンプ４３と第２の光アンプ４５とが設けられる。

第１の光アンプ４３としては、利得媒質として希土類元素（Ｙｂ，Ｅｒ，Ｐｒ，Ｈｏなどの単体か混合）が添加されたシングルモードの光のみを伝搬するシングルモード光ファイバ増幅器を用いることができる。分散補償ファイバ４２から第１の光アンプ４３に入射した光パルスは、第１の光アンプ４３内でパルスエネルギーを１０倍以上光増幅される。

光フィルタ４４は、光学基板上に誘電体多層膜を多数成膜しており各層の屈折率に応じて厚さが設計されており、特定の波長帯で設計した帯域を透過し、その他の帯域は反射する特性を有する。第１の光アンプ４３を出射した光パルスは、フィルタ４４でその光スペクトルの短波長側と長波長側の両方が除去される。これにより、半導体レーザ４１の利得スイッチ動作で発生した光パルスのペデスタル（時間波形上のゆっくりと光強度がゼロに落ちていく波尾成分）や、サブパルス（時間波形上に意図した光パルスとは時間間隔があり更に微弱な光パルス）を除去し、理想的な光パルスとすることができる。透過する帯域は１ナノメール以下であり、半導体レーザ４１の利得スイッチ動作で発振した光パルスの光スペクトル幅が約１．５ナノメートルの時、フィルタ４４を透過する帯域は約０．６ナノメートル程度である。

第２の光アンプ４５は、ダブルクラッドファイバを用いた光ファイバ増幅器を用いることができる。ダブルクラッドファイバの利得ファイバを用いることで、光増幅される信号光を利得媒質である希土類が添加されたコアに伝播させ、励起光をインナークラッドに伝播させることができる。インナークラッドはマルチモードの光が伝播するので、シングルモードファイバを用いた光増幅器の場合のシングルモード半導体レーザでなく、マルチモード半導体レーザを励起光源として使用することができる。マルチモード半導体レーザは、数十ワット以上の出力が容易に得られる。これによって、光フィルタ４４を透過した約数百ピコジュールの光パルスは、第２の光アンプ４５に入射し、光パルスエネルギーが数十ナノジュール台（光強度で数ワット台）に更に光増幅される。なお、ダブルクラッドファイバのコア径はシングルモードファイバのコア径より大きいが、開口数をシングルモードファイバのコアより小さくすることでシングルモードが優先的に伝播するよう設計されている。

なお、シングルクラッドの光ファイバ増幅器およびダブルクラッドの光ファイバ増幅器は公知であるため、それらの詳細な構成の説明は省略する。

パルス圧縮部４６は、例えば、シングルモードファイバ４７とレンズ４８と回折格子対４９とから構成され、第２の光アンプ４５から出射した光パルスを、非線形パルス圧縮にてピコ秒からフェムト秒にパルス圧縮する。非線形パルス圧縮は、以下の書籍にて紹介されている。
「超高速光エレクトロニクス」 培風館（１９９１） Ｐ．４７
「Ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ Ｌａｓｅｒ Ｐｕｌｓｅ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ

第１の光アンプ４３および第２の光アンプ４５により増幅され、高エネルギー且つ高ピークパワーとなった光パルスは、シングルモードファイバ４７を伝播することにより、非線形光学効果の自己位相変調を受け光スペクトル幅が拡大し、且つ、シングルモードファイバの正常分散によりチャープが加わる。シングルモードファイバ４７を出射した光パルスは、レンズ４８により空間ビームとして出力され、図示しないフィルタで自然放出光が除去され図示しない空間アイソレータを透過した後、回折格子対４９でパルス圧縮され、フェムト秒の光パルスとなる。

シングルモードファイバ４７は、非線形パルス圧縮で最短の時間幅と最高のピーク光強度が得られるように、パルス光のエネルギーと時間幅（光スペクトル幅）に応じて最適な光スペクトル幅とチャープが加わる長さに調節する。通常、シングルモードファイバ４７の長さは、数十ナノジュールの光パルスの場合は、数メートルから１０メートル程度である。回折格子対４９は異常分散を発生する機能を有している。このようにして、１００フェムト秒から２００フェムト秒のパルス幅である短パルス光を生成することができる。

なお、異常分散を与えるために回折格子対４９を用いたが、望ましくは透過型回折格子であると良く、反射型回折格子やプリズム、グリズム、偏波保持の異常分散中空コアフォトニックバンドギャップファイバとしても良い。

以上のように、レーザ光源１１は半導体レーザ４１で利得スイッチ動作によって発振した種パルスに、光増幅と非線形パルス圧縮を行いレーザ光を生成しており、モードロック方式のような帰還機構を有していない。すなわち、半導体レーザ４１を利得スイッチ動作させる電気パルスを発生する電気パルサー４０により、ほぼ自由にレーザ光生成のタイミングと光パルス間隔と光パルス数とを制御することが可能である。

次に、制御装置４において実行される処理について図１、図３および図４を用いて説明する。

制御部３２は、画像情報生成部３３からスキャナ１３の走査速度や解像度等の走査条件を受信し、この走査条件に基づいて画像を形成する各画素に対応する標本上の領域の走査時間（あるいは、各画素のサンプリング可能な時間）である画素周期を算出する。さらに、制御部３２は、最小の画素周期（最小画素周期）に収まるように射出する光パルスの数と間隔とを決定し、場合によって、遅延時間を設定する。制御部３２は、これらパルス数、間隔および遅延時間の情報を電気パルス設定信号として電気パルサー４０に送信する。そして、光パルスの走査時に、走査される画素ごとに、画素周期の開始のタイミングを決定するピクセル同期信号（発振指令信号）を生成し、電気パルサー４０に送信する。電気パルサー４０は、図３のようにピクセル同期信号を受信すると、設定された遅延時間を待って設定数の電気パルスを設定間隔で発生する。なお、電気パルス設定信号は、光パルスの走査前に送信されるが、光パルスの走査中に設定条件を更新して送信することも可能である。

このように、電気パルサー４０から、設定された数、間隔および遅延時間の電気パルスを出力することにより、電気パルスに応じてレーザ光源１１から光パルスが出射されるので、標本Ａの画素周期毎に同数の光パルスが照射可能になる。例えば、スキャナ１３としてＸ方向に共振振動する共振ガルバノスキャナを用いた場合、図４のように走査速度の遅い両端部と逆に速い中心部とでは、ピクセル同期信号の間隔が異なるが、画素周期ごとに同数の光パルスを照射することができる。

光検出回路３１は、制御部３２の制御のもとで、ピクセル同期信号により光電変換素子２５内のコンデンサに検出光量に相当する電荷を蓄積させ、一定時間経過後にこの電荷量を読み取ることにより光強度信号を取得する。光検出回路３１は、光強度信号を画像情報生成部３３に送信し、画像情報生成部３３はこれを画像化し表示モニタ３４に画像を表示する。光検出回路３１による電荷量の読み取りは、制御部３２から光電変換信号２５の取込信号を送信して行う。なお、光検出回路３１は、あるクロック周期で光電変換素子２５の瞬時の検出光量を読取り、この検出光量のピクセル同期信号によるある時間内での積算量（総合計量）を光強度信号として取得するように構成することもできる。

画像情報生成部３３は、例えばＰＣ（Personal Computer）であり、レーザ光の標本Ａ面上での集光位置の座標と光検出回路３１からの光強度信号とを対応付けて記憶するとともに、記憶した光強度信号を画素周期毎に積算して画像情報を生成し表示モニタ３４に表示するようになっている。また、画像情報生成部３３は、スキャナ１３の走査条件等の入力を受けることができる。すなわち、多光子励起観察装置１の使用者は、表示モニタ３４を見ながら走査速度や解像度などの条件を入力部（図示せず）から入力し、これらの条件は画像情報生成部３３に設定される。

上記構成を有する多光子励起観察装置１の作用について以下に説明する。

多光子励起観察装置１が駆動されると、制御部３２は、画像情報生成部３３に設定されている走査条件に基づいて最小画素周期を算出する。そして、最小画素周期に収まるように射出する光パルスの数、間隔および必要に応じて遅延時間を決定する。制御部３２は、これらを電気パルス設定信号として、電気パルサー４０に送信し、電気パルサー４０は、これをメモリに格納することにより電気パルスの発信条件を記憶する。これによって、最小画素周期から、蛍光取り込み範囲およびサンプリング有効範囲が設定される。

例えば、スキャナ１３として８ｋＨｚの共振ガルバノを使用し、ＸＹ観測面を５１２×５１２画素としＸ方向にのみ共振ガルバノを用いた場合、最小画素周期は６８ｎｓ、最大画素周期は１０５ｎｓとなる。レーザ光源１１の光パルス繰返し周期を８０ＭＨｚとすると、最小画素周期で５パルス（５．５パルス）、最大画素周期で８パルス（８．４パルス）となる。従って、電気パルサー４０にはパルス繰返し間隔を１２．５ｎｓ（８０ＭＨｚ）、パルス数を５と設定する。ここでは遅延時間はゼロとした。そして、蛍光取り込み範囲およびサンプリング有効範囲は６２．５ｎｓ（１２．５ｎｓ／パルス×５パルス）が設定される。

次に、スキャナ１３の動作（例えば、ガルバノミラーの揺動）が開始され、制御部３２は画素周期の開始タイミングに合せてピクセル同期信号を生成し、電気パルサー４０に送信する。電気パルサー４０は、ピクセル同期信号を受信すると、記憶している発振条件に従って電気パルスを半導体レーザ４１に出力する。これによって、既に説明したように、レーザ光源１１からピーク光強度が高く時間幅の短い光パルスのレーザ光が出射される。

レーザ光源１１から射出されたレーザ光は、スキャナ１３を通り、レンズ２４を透過してダイクロイックミラー２１により反射され、レンズ２２を透過した後に、対物レンズ２３により標本Ａ上に照射される。スキャナ１３の動作により、レーザ光は標本Ａ上において２次元的に走査されるが、各画素周期では上記設定された数の光パルスが照射される。

レーザ光の照射を受けた標本Ａ上の対物レンズ２３の焦点位置では、光子密度が高くなり、多光子励起効果により標本Ａ内の蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光は、対物レンズ２３により集光され、レンズ２４およびダイクロイックミラー２１を透過して光電変換素子２５に導光される。光電変換素子２５では、設定されたサンプリング有効範囲の間に標本Ａから得られた各画素に対応する蛍光が、光電変換されて光強度信号が生成される。生成された光強度信号は、光検出回路３１によりＡ／Ｄ変換され、１画素の輝度データとして画像情報生成部３３に出力される。

画像情報生成部３３では、レーザ光の標本Ａ面上での集光位置の座標と、光電変換素子２５により検出された蛍光の光強度とを対応付けて画像情報が生成される。このように蛍光のパルス数が各画素周期において同数となるように生成された画像情報は、画像として図示しない記憶部に記憶するとともに、表示モニタ３４に表示される。

以上のように、本実施形態に係る多光子励起観察装置１では、制御部３２により設定された光パルスの数に対応する蛍光が、各画素周期において同数ずつ積算される。これにより、本実施形態に係る多光子励起観察装置１によれば、様々な周辺要素やビームアライメントが必要な調光部を設けることなく、画素情報に寄与しない光パルスの照射を無くし、かつ全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。

また、調光部を設けないので、制御部３２にかかる負荷を低くすることができる。さらに、観察に必要となる光パルスの数しか、レーザ光源１１を発振させないので、画像情報生成部３３で演算に用いる光パルスを限定する方法や、調光部で光パルスを間引く方法と比べ、エネルギーの利用効率を高めることができる。

なお、ここでは最小画素周期６８ｎｓに対して、光パルス間隔を１２．５ｎｓ（８０ＭＨｚ）、光パルス数を５パルスとする例を示したが、検出部２５から得られる強度信号に基づいて、制御部３２によりまたは使用者の操作により、図５のように照射する光パルス数を減らすことで標本Ａの蛍光マーカの褪色を減らし、必要な画像輝度に照射強度を変更することが出来る。また、光パルス間隔を１０ｎｓ（１００ＭＨｚ）とすると画素周期に収まる最大のパルス数は６パルス（６．４パルス）、同５ｎｓ（２００ＭＨｚ）とすると１３パルス（１３．７パルス）となり、光パルス間隔を短くすることで調整可能な光パルス数を大きくでき、光パルス数の調整による照射強度の調整範囲を大きくすることが可能となる。

また、共振ガルバノを用いたときの観察範囲の光走査の振る舞いは、図６のようになる。ここで、Ｘ方向には共振ガルバノが設置されており、Ｙ方向には非共振ガルバノが設置されている。Ｘ方向の走査をする共振ガルバノはその共振周波数でのみ動作することが可能であり、その振幅（触れ角）のみ調整可能である。このため、観測範囲のＸ方向には常に共振ガルバノの共振周波数（８ｋＨｚ）で走査されており、Ｙ方向には一定速度で非共振ガルバノが走査されている。このため、観測範囲の光走査は図６の（１）のようにジグザクの走査となる。そして、ジグザグの走査が終了した後、（２）の原点復帰のスキャンを行う。この時、画像取得を行う（１）のジグザグの走査ではピクセル同期信号により光パルスの照射が標本Ａに対して行われるが、画像取得を行わない（２）の原点復帰動作では光パルスの照射を停止する。こうすることで、不要な光パルスの照射による標本Ａの蛍光マーカの劣化（褪色）を発生しないようにすることができる。

さらに、上記は原点復帰する際に光パルスの照射を停止するとしたが、例えば、共振ガルバノを用いてＲＯＩスキャンやＰＡＮスキャン等を行う場合のように、標本Ａ上の共振ガルバノの走査領域のうち一部の領域のみを観察対象の領域（被観察領域）とする場合、制御部３２はピクセル同期信号を送信しないことにより、観察対象以外の領域への光パルスの照射を停止させることができる。従来であれば、ＲＯＩスキャンやＰＡＮスキャンにおいて、被観察領域以外に光パルスを照射しないようにするには、独立して制御可能な駆動機構や、ＡＯＭ等の高速変調素子が必要だが、本実施の形態によれば、そのような追加の構成を設ける必要がない。

（第２実施の形態）
本発明の第２実施の形態に係る多光子励起観察装置について、図面を参照して以下に説明する。本実施の形態に係る多光子励起観察装置は、波長の異なる光パルスを出射する複数のレーザ光源を用いて、複数の波長の光パルスにより標本Ａを観察する点で、第１実施の形態と異なっている。

図７は、第２実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。本実施の形態の多光子励起観察装置１は、レーザ光源装置２内に、レーザ光源（第１のレーザ光源）１１に加え、レーザ光源１１と同様に、図示しない電気パルサー（第２の電気パルス発生器）の電気パルスによる利得スイッチ動作によって発生した種パルスに、光増幅と非線形パルス圧縮を行い、レーザ光源１１とは異なる波長の光パルス（第２の光パルス）を出射するレーザ光源（第２のレーザ光源）１２を備える。さらに、レーザ光源装置２は、レーザ光源１１からのレーザの光路とレーザ光源１２からのレーザの光路とを結合させる光路結合手段１４を備える。この光路結合手段１４により、レーザ光源１１およびレーザ光源１２のそれぞれから出射される光パルスは同軸となり、スキャナ１３に入射するようになっている。

また、顕微鏡本体３の光電変換素子２５ａ〜２５ｃの直前にはダイクロイックミラー２１を透過した、標本Ａからの反射光または蛍光を波長毎に分岐する分光手段２６が設けられ、分光手段２６によって分岐された光路毎に光電変換素子２５ａ〜２５ｃが各々設けられている。

光路結合手段１４は、例えばダイクロイックミラーや光フィルタであり、レーザ光源１１からの光パルスを透過し、レーザ光源１２からの光パルスを反射することで、レーザ光源１１からの光パルスの光路とレーザ光源１２からの光パルスの光路とを同軸に結合させることができる。また、分光手段２６は、例えばダイクロイックミラーや光フィルタを含み、波長帯域により異なる透過特性と反射特性を用いて光路を分岐させる。あるいは、回折格子やプリズムを用いて、波長によって異なる角度に出力されることで光路を分岐させる。

レーザ光源１２は、レーザ光源１１と同様に制御部３２に電気的に接続されており、制御部３２は、レーザ光源１１およびレーザ光源１２を、第１実施の形態と同様に制御する。また、光電変換素子２５ａ〜２５ｃは光検出回路３１に接続されており、光検出回路３１は、光電変換素子２５ａ〜２５ｃの各々の光強度信号にＡ／Ｄ変換等の処理を施して、画像情報生成部３３に送信し、画像情報生成部３３は、各々の強度信号を、それぞれ第１実施の形態と同様に処理することができる。その他の構成は、第１実施の形態と同様なので、同一の構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。

次に、多光子励起観察装置１の作用について説明する。

多光子励起観察装置１が駆動されると、制御部３２は、画像情報生成部３３からスキャナ１３の走査速度や解像度等の走査条件を受信し、この走査条件に基づいて最小画素周期を算出し、最小画素周期に収まるように射出する光パルスの数と間隔を決定する。また、制御部３２は、レーザ光源１１からの光パルスとレーザ光源１２からの光パルスとを、同時刻に標本Ａに照射しないようにレーザ光源１１とレーザ光源１２との間に異なる遅延時間を設定する。例えば、第１実施の形態に記載した例と同様に、パルス繰返し間隔を１２．５ｎｓ（８０ＭＨｚ）でパルス数を５と設定した場合、レーザ光源１１の遅延時間をゼロ、レーザ光源１２の遅延時間を６．５ｎｓとする。

次に、スキャナ１３の走査開始後、制御部３２は、これら光パルスの数、パルス間隔および遅延時間を、レーザ光源１１の電気パルサーとレーザ光源１２の電気パルサーとに各々電気パルス設定信号として送信する。さらに、レーザ光源１１の電気パルサーとレーザ光源１２の電気パルサーとは、制御部３２から、図８のようにピクセル同期信号（発振指令信号）を受信すると、それぞれ設定された遅延時間が経過した後、設定数の電気パルスを設定間隔で発生する。これにより、レーザ光源１１の光パルスとレーザ光源１２の光パルスとが、設定された回数および間隔で、タイミングをずらして出射される。

レーザ光源１１およびとレーザ光源１２をそれぞれ出射した光パルスは、光路結合手段１４によって光路を結合され、第１実施の形態と同様に、標本Ａ上に照射され、スキャナ１３の動作により、レーザ光は標本Ａ上において２次元的に走査される。各画素周期の間、レーザ光源１１とレーザ光源１２とのそれぞれにより、標本Ａの各画素に対応する領域に、上記設定されたパルス数の光パルスが照射される。

光パルスが照射された標本Ａ上の対物レンズ２３の焦点位置においては、光パルスの光子密度が高くなり、多光子励起効果により標本Ａ内の蛍光物質が励起され蛍光が発生する。この時、標本Ａ内には少なくとも三種類の蛍光物質がそれぞれ注目する場所毎にマーキングされている。そして、これら蛍光物質を蛍光物質Ｐａ〜Ｐｃとすると，例えば蛍光物質Ｐａはレーザ光源１１の光パルスにより励起可能であり、蛍光物質ＰｂとＰｃとはレーザ光源１２の光パルスで励起可能となっている。また、蛍光物質Ｐａ〜Ｐｃは異なるピーク波長の蛍光を発する。発生した蛍光は、対物レンズ２３により集光され、レンズ２２およびダイクロイックミラー２１を透過して分光素子２６に導光され、蛍光物質毎に分光され、各々の光電変換素子２５ａ〜２５ｃに導光される。光電変換素子２５ａ〜２５ｃでは、標本Ａからの各々の蛍光物質の蛍光が光電変換されて光強度信号が生成される。生成されたそれぞれの光強度信号は、光検出回路３１によりＡ／Ｄ変換され、１画素の輝度データとして画像情報生成部３３に出力され、これから蛍光物質毎の画像情報が生成され、表示モニタ３４に表示される。

以上のように、本実施形態に係る多光子励起観察装置１では、第１実施の形態の多光子励起観察装置の有する効果に加え、波長の異なる複数のレーザ光源１１および１２を用いながら、それらレーザ光源１１および１２の光パルス間に遅延時間を設けたことで、標本Ａに光パルスが同時に照射されないので、同一の標本Ａの発する複数の蛍光の様子を並行して観察しながら、標本Ａの蛍光物質の劣化（褪色）を最小限に抑えることができ、これによって長時間標本を観測できる。

また、複数のレーザ光源１１および１２の異なる励起波長で異なるマーカを励起して観察する際に、各々の光パルス間隔を詳細に調整出来るようになることで標本のマーカ間の相互作用（光刺激）をより正確に観察することが出来る。

（第３実施の形態）
図９は、第３実施の形態に係る多光子励起観察装置の概略構成を示す図である。本実施の形態の多光子励起観察装置１は、レーザ光源装置２内に、レーザ光源（第１のレーザ光源）１１に加え、モードロックレーザであるレーザ光源（第２のレーザ光源）１６を備える。レーザ光源１６からの光パルスは調光部１７を介して光路結合手段１４に入射され、レーザ光源１１からの光パルスと光路が同軸となる。調光部１７は、例えば、音響光学素子（ＡＯＭ）、シャッター、減光フィルタ等であり、制御部３２からの指示により、スキャナ１３に入射させる光パルスを間引くことが可能になっている。

制御部３２は、画像情報生成部３３からスキャナ１３の走査速度や解像度等の走査条件を取得し、この走査条件に基づいて最小画素周期を算出する。そして、最小画素周期に収まるように、レーザ光源１１の光パルスの数と間隔を決定する。また、レーザ光源１６より光パルス同期信号を受信し、レーザ光源１１の光パルスとレーザ光源１６の光パルスとが同時刻に標本Ａに照射されないように光源間の遅延時間を設定する。そして、これら光パルスの数、パルス間隔および遅延時間を、レーザ光源１１の電気パルサーに送信する。

図１０は、図９の多光子励起観察装置のピクセル同期信号と電気パルサーの出力パルスとの関係を説明する図である。レーザ光源１１の電気パルサーは、ピクセル同期信号を受信すると、設定された遅延時間の経過後、設定数の電気パルスを設定間隔で発生する。また、制御部３２は、調光部１７に対して、ピクセル同期信号の送信後、レーザ光源１１の蛍光取り込み範囲に対応した所定時間だけレーザ光源１６からの光パルス（第２の光パルス）を透過させ、それ以降次のピクセル同期信号を受信するまで、レーザ光源１６からの光パルスを間引くように制御信号を送信する。その他の構成および作用は、第２実施の形態と同様なので、同一の構成要素には同一参照符号を付して説明を省略する。

このようにすることで、異なる波長の複数のレーザ光源の一方に光パルスのタイミング制御が不可能なモードロックレーザを用いながら、制御部３２により設定された光パルスの数に対応する蛍光が、各画素周期において同数ずつ積算される。これにより、画素情報に寄与しない光パルスの照射を無くし、全ての画素周期において均一な条件で画像情報を生成することができ、定量性のある画像を取得することが可能となる。また、波長の異なる複数のレーザ光源１１および１６を用いながら、それらレーザ光源１１および１６の光パルス間に遅延時間を設けたことで、標本Ａで光パルスが同時に照射されないようになり、同一の標本Ａの複数の蛍光を観察しながら、標本Ａの蛍光物質の劣化（褪色）を最小限に抑えることができる。これによって、長時間標本を観測できる。

さらに、本実施の形態の多光子励起観察装置１は、モードロックレーザであるレーザ光源１６を有する多光子励起観察装置に対して、レーザ光源１１および光路結合手段１４の部分を付加し、制御部３２の制御プログラムを拡張することによって、既存のシステムを拡張して構成することができるという利点も有している。

なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。
たとえば、ダイクロイックミラー２１は、標本Ａからの蛍光のみを透過させ、標本Ａからの反射光については透過させないこととして説明したが、標本Ａからの反射光についても透過させて、光電変換素子２５により検出することとしても良い。
また、標本Ａを透過した透過光を観察する場合には、光電変換素子を試料の透過側に配置して透過光を検出し、前述の各実施形態と同様の処理を行うことで、各画素周期において均一な条件で定量性のある画像を取得することができる。
さらに、第２および第３実施の形態では、２台のレーザ光源を用いる構成を例示したが、３台以上のレーザ光源を用いて、各レーザ光源からの光パルスの光路を結合して標本Ａ上を走査させるようにしても良い。また、光電変換素子は、１個または３個に限られず、種々の蛍光波長に対応して２個または４個以上の光電変換素子を用いて良い。

１ 多光子励起観察装置
２ レーザ光源装置
３ 顕微鏡本体
４ 制御装置
１１ レーザ光源（第１のレーザ光源）
１２ レーザ光源（第２のレーザ光源）
１３ スキャナ
１４ 光路結合手段
１５ａ，１５ｂ ガルバノミラー
１６ レーザ光源（第２のレーザ光源）
１７ 調光部
２１ ダイクロイックミラー
２２ レンズ
２３ 対物レンズ
２４ レンズ
２５，２５ａ，２５ｂ，２５ｃ 光電変換素子（光検出部）
２６ 分光手段
３１ 光検出回路
３２ 制御部
３３ 画像情報生成部
３４ 表示モニタ
４０ 電気パルサー（第１の電気パルス発生器）
４１ 半導体レーザ
４２ 分散補償ファイバ
４３ 第１の光アンプ
４４ 光フィルタ
４５ 第２の光アンプ
４６ パルス圧縮部
４７ シングルモードファイバ
４８ レンズ
４９ 回折格子対
Ａ 標本（被観察物）

Claims (8)

1. 電気パルスを出力する第１の電気パルス発生器および該電気パルスにより利得スイッチ発振する半導体レーザを含み、該半導体レーザから出射される光パルスに光増幅および非線形パルス圧縮を行い第１の光パルスとして出射する第１のレーザ光源と、
   該第１のレーザ光源から出射される前記第１の光パルスを被観察物上で走査させるスキャナと、
   前記第１の光パルスの走査によって生じる被観察物からの反射光、蛍光または透過光を受け、光強度信号に光電変換する光検出部と、
   画素周期中に得られる前記光強度信号を画素毎に加算して画像情報を生成する画像情報生成部と、
   前記被観察物に照射される前記第１の光パルスが、前記画素周期毎に同数となるように、前記第１の電気パルス発生器を制御する制御部と
   を備える多光子励起観察装置。
2. 前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器の出力する電気パルスの繰返し間隔および発振数を設定し、且つ、前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器に発振指令信号を送信し、前記設定された繰返し間隔および発振数に基づいて前記電気パルスを出力させることを特徴とする請求項１に記載の多光子励起観察装置。
3. 前記制御部は、前記第１の電気パルス発生器の出力する電気パルスの、前記発振指令信号に対する遅延時間を設定することを特徴とする請求項２に記載の多光子励起観察装置。
4. 前記制御部は、前記スキャナが所定の被観察領域以外の領域を走査する状態にあるときは、前記発振指令信号を送信しないことを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の多光子励起観察装置。
5. 第２の光パルスを出射する第２のレーザ光源と、前記第１の光パルスの光路および前記第２の光パルスの光路を前記スキャナの前段で結合させる光路結合手段とを備え、前記制御部は、前記第１の光パルスと前記第２の光パルスとが、同時に前記被観察物に照射されないように、前記遅延時間を設定することを特徴とする請求項３に記載の多光子励起観察装置。
6. 前記第２のレーザ光源は、前記第２の光パルスを生成するための第２の電気パルス発生器を備え、前記制御部は、前記第１の光パルスと前記第２の光パルスとが、略等しい繰返し間隔でタイミングをずらして出射されるように、前記第１の電気パルス発生器および前記第２の電気パルス発生器の発振指令信号からの遅延時間を設定することを特徴とする請求項５に記載の多光子励起観察装置。
7. 前記第２のレーザ光源は、モードロックレーザであることを特徴とする請求項５に記載の多光子励起観察装置。
8. 前記制御部は、前記電気パルスの発振数を、前記検出部により得られる前記光強度信号に基づいて設定することを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の多光子励起観察装置。

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