CN114324271B - 自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统、其方法及显微镜 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，所述显微镜系统包括：飞秒激光前端模块、脉冲展宽放大模块、脉冲压缩模块、光谱展宽滤波模块和多光子显微镜模块。还提供了其方法及显微镜。本发明的基于自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统可将1040nm的脉冲波长转换到1110nm，实现多光子激发荧光(MPEF)、二倍频(SHG)和三倍频(THG)信号的同时收集，即实现对多种生物组织成分的同步成像，并且转换效率高，可获得的能量大，可以得到的脉冲通过色散补偿可压缩至近变换极限。同时本发明的基于自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统扩展性强，可以通过调节输入光纤能量的大小来调谐光源波长，以适合不同的样品成像。
Description
技术领域
本发明涉及超快激光技术领域，具体涉及自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统、其方法及显微镜。
背景技术
非线性光学显微镜(NLM)技术是成像领域最重要的发明之一，与线性技术相比，非线性光学显微镜在组织成像中有很多独特的优势，例如无标记成像、高对比度、高分辨率和较大的穿透深度等。NLM是一种激光扫描显微镜技术，超快激光器作为光源产生入射光，入射光与样品非线性相互作用产生光学信号，这些光学信号的大小跟入射光的光强成非线性关系，收集这些信号就能获得样品的多光子激发荧光(MPEF)、二倍频(SHG)和三倍频(THG)图像。现有一种非线性光学显微镜技术通过使用中心波长在1110nm的飞秒激光器作为驱动光源，结合多个信号检测通道，可以同时收集多光子激发荧光(MPEF)、二倍频(SHG)和三倍频(THG)信号，即实现对多种生物组织成分的同步成像，这种技术被称为无标记自发荧光多倍频显微镜(SLAM)技术。
想要获得中心波长在1110nm的飞秒激光器驱动SLAM，但是没有增益材料直接产生波长以1110nm为中心的飞秒脉冲。最常用的超快激光器比如钛宝石激光器、掺镱光纤激光器和掺铒光纤激光器，其脉冲分别在800nm、1μm和1.5μm。所以需要使用一些非线性技术将这些波长转换到1110nm，但是当前的波长转换技术有各自的缺陷。
现有波长转换技术的缺陷：
1.基于四波混频的波长转换技术，如光参量振荡器/光参量放大，转换效率非常低，并且对环境波动很敏感。
2.基于孤子自频移和超连续谱的波长转换技术输出脉冲能量都受限。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统、其方法及显微镜。本发明的显微镜系统基于自相位调制光谱选择(SESS)的超快光纤激光光源用来驱动SLAM系统，与当前常见的波长转换方法相比，此装置中使用的非线性波长转换技术SESS可以输出高转换效率和脉宽完全可压缩的脉冲。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“SLAM”是指：无标记自发荧光多倍频显微镜。
术语“MPEF”是指：多光子激发荧光。
术语“SHG”是指：二倍频。
术语“THG”是指：三倍频。
术语“LMA-8”是指：大模场光子晶体光纤-8。
术语“ESM-12”是指：单模光子晶体光纤-12。
术语“SESS”是指：自相位调制光谱选择。
术语“P偏振”是指：当光线以非垂直角度穿透光学元件(如分光镜)的表面时，反射和透射特性均依赖于偏振现象。这种情况下，使用的坐标系是用含有输入和反射光束的那个平面定义的。如果光线的偏振矢量在这个平面内，则称为P偏振。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，所述显微镜系统包括：飞秒激光前端模块、脉冲展宽放大模块、脉冲压缩模块、光谱展宽滤波模块和多光子显微镜模块，所述脉冲压缩模块包括第一脉冲压缩模块和第二脉冲压缩模块；其中，
所述飞秒激光前端模块的输出端与所述脉冲展宽放大模块的输入端相连，所述脉冲展宽放大模块的输出端与所述第一脉冲压缩模块的输入端相连，所述第一脉冲压缩模块输出端与所述光谱展宽滤波模块输入端相连，所述光谱展宽滤波模块的输出端与所述第二脉冲压缩模块的输入端相连，所述第二脉冲压缩模块的输出端与所述多光子显微镜模块的输入端相连；
优选地，所述飞秒激光前端模块用于输出超短脉冲序列，所述脉冲展宽放大模块用于对输入脉冲引入色散进行脉宽展宽然后进行功率放大，所述第一脉冲压缩模块用于对从脉冲展宽放大模块输出端输出的脉冲进行色散补偿，所述光谱展宽滤波模块用于对第一脉冲压缩模块输出的脉冲利用自相位调制效应展宽光谱然后对所需波段进行滤波，所述第二脉冲压缩模块用于对从光谱展宽滤波模块输出端输出的脉冲进行色散补偿，所述多光子显微镜模块被第二脉冲压缩模块输出的脉冲驱动用于对样品进行成像。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，所述飞秒激光前端模块包括振荡器；其中，
所述飞秒激光前端模块输出飞秒脉冲序列的重复频率为40～45MHz，最优选为43MHz；
所述飞秒激光前端模块中的振荡器发射的超短脉冲序列中心波长范围为1μm～1.06μm，最优选为1.04μm；和/或
所述振荡器为光纤激光振荡器或固态激光振荡器，优选为掺镱光纤激光振荡器，进一步优选为锁模的掺镱光纤激光振荡器；
优选地，所述锁模的方式选自以下一种或多种：半导体可饱和吸收镜、非线性偏振旋转、非线性光学环形镜，最优选为半导体可饱和吸收镜；
进一步优选地，所述锁模的掺镱光纤激光振荡器为基于半导体可饱和吸收镜锁模的掺镱光纤激光振荡器。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，所述脉冲展宽放大模块包括光纤隔离器、光纤展宽器、空间隔离器和两级光纤放大器；
优选地，所述脉冲展宽放大模块还包括泵浦激光源、波分复用器、准直器、半波片；和/或
优选地，所述飞秒激光前端模块发射的超短脉冲序列经过光纤展宽器和光纤放大器后脉冲平均功率被放大到5～7W，更优选为5～6W。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，所述脉冲压缩模块包括色散补偿器件；
优选地，所述色散补偿器件为光栅对和/或棱镜对，进一步优选为光栅对；
更优选地，所述脉冲压缩模块包括反射镜和透射光栅对；
进一步优选地，所述透射光栅对平行放置，并且其中一个透射光栅安装于可调位移平台上。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，经脉冲展宽放大模块输出的脉冲序列无阻挡的射向所述脉冲压缩模块的色散补偿器件，再经过第二平面反射镜折返并降低高度后再次透过所述色散补偿器件，在第一平面反射镜上反射输出压缩脉冲。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，所述的光谱展宽滤波模块包括：反射镜、半波片、挡光板、偏振分束器、非球面透镜、光谱旁瓣滤波光纤和光学滤波器；
优选地，所述光谱旁瓣滤波光纤为大模场光子晶体光纤或单模光子晶体光纤，进一步优选为大模场光子晶体光纤-8(LMA-8)或单模光子晶体光纤-12(ESM-12)，最优选为单模光子晶体光纤-12(ESM-12)；
更优选地，所述单模光子晶体光纤-12的长度为5～10cm，进一步优选为5～7cm，最优选为5.5cm。
根据本发明第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其中，所述多光子显微镜模块包括：半波片、挡光板、偏振分束器和多光子显微镜。
本发明的第二方面提供了一种驱动显微镜的方法，所述方法包括：使用第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统驱动显微镜。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述显微镜系统的飞秒激光前端发射超短脉冲序列，经所述脉冲展宽放大模块输出功率放大的超短脉冲序列，所述功率放大的超短脉冲序列经第一脉冲压缩模块输出压缩脉冲，所述压缩脉冲经光谱展宽滤波模块光谱被展宽并被调整为P偏振后，经滤波器过滤得到输出脉冲，所述输出脉冲经过第二脉冲压缩模块输出压缩脉冲，最后经多光子显微镜模块实现样品的成像。
本发明的第三方面提供了一种非线性光学显微镜，所述非线性光学显微镜包括第一方面的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统；
优选地，所述非线性光学显微镜选自以下一种或多种：无标记自发荧光多倍频显微镜、倍频显微镜、相干反斯托克斯拉曼散射显微镜、受激拉曼散射显微镜，进一步优选为无标记自发荧光多倍频显微镜。
本发明的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统可以具有但不限于以下有益效果：
1.本发明的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统采用自相位调制光谱选择(SESS)的方法将1040nm的脉冲波长转换到1110nm，实现多光子激发荧光(MPEF)、二倍频(SHG)和三倍频(THG)信号的同时收集，即实现对多种生物组织成分的同步成像。与其他波长转换的方法相比，转换效率高，可获得的能量大，并且得到的脉冲通过色散补偿可压缩至近变换极限。
2.扩展性强，本发明的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统可以通过调节输入光纤能量的大小来调谐光源波长，以适合不同的样品成像。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统的结构示意图。
附图标记说明：
1、飞秒激光前端模块；2、脉冲展宽放大模块；3、第一脉冲压缩模块；4、光谱展宽滤波模块；5、第二脉冲压缩模块；6、多光子显微镜模块；7、第一光纤隔离器；8、光纤展宽器；9、第一二极管泵浦激光源；10、第一波分复用器；11、第一光纤放大器；12、第二光纤隔离器；13、第二二极管泵浦激光源；14、第二波分复用器；15、第二光纤放大器；16、准直器；17、第一半波片；18、第一空间隔离器；19、第二半波片；20、第一平面反射镜；21、第一透射光栅；22、第二透射光栅；23、第二平面反射镜；24、第三平面反射镜；25、第三半波片；26、第一挡光板；27、第一偏振分束器；28、第一非球面透镜；29、光谱旁瓣滤波光纤；30、第二非球面透镜；31、第四半波片；32、第二偏振分束器；33、第二挡光板；34、光学滤波器；35、第四平面反射镜；36、第五平面反射镜；37、第三透射光栅；38、第四透射光栅；39、第六平面反射镜；40、第五半波片；41、第三挡光板；42、第三偏振分束器；43、多光子显微镜；
A、飞秒激光前端模块1发射的超短脉冲序列；B、脉冲A经过脉冲展宽放大模块2放大后的脉冲；C、脉冲B经过第一脉冲压缩模块3压缩后的脉冲；D、光谱展宽滤波模块4输出的脉冲；E、脉冲D经过第二脉冲压缩模块5压缩输出的超短飞秒脉冲。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1
本实施例用于说明本发明的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统的结构。
图1为基于自相位调制光谱选择驱动的无标记自发荧光多倍频显微镜系统。它包括：飞秒激光前端模块1；脉冲展宽放大模块2；第一脉冲压缩模块3；光谱展宽滤波模块4；第二脉冲压缩模块5；多光子显微镜模块6。在本实施例中，飞秒激光前端模块1采用半导体可保护吸收镜锁模的掺镱光纤振荡器，输出的超短脉冲序列A对应的参数为：中心波长1.04μm、光谱半高宽11.5nm，重复频率43MHz。
所述输出的超短脉冲序列A经过光纤展宽器8展宽及第一光纤放大器11和第二光纤放大器15放大后可以输出平均功率为6±1W的超短脉冲序列B。直接入射第一透射光栅21和第二透射光栅22组成的光栅对，第一透射光栅21和第二透射光栅22平行放置，且第二透射光栅22安装在精密可调位移平台上，可灵活控制光栅对间距，脉冲序列经过第二平面反射镜23向下折返并降低一定高度后再次返回并透过光栅对，最终在第一平面反射镜20上以45度角反射输出压缩脉冲C；
压缩脉冲C在第三平面反射镜24上以45度角反射，接着经过第三半波片25和第一偏振分束器27被调整为P偏振，然后脉冲C通过第一非球面透镜28被聚焦到光谱旁瓣滤波光纤29的纤芯，通过光谱旁瓣滤波光纤29脉冲光谱被展宽，接着经过第二非球面透镜30被准直，进一步通过第四半波片31和第二偏振分束器32被调整为P偏振，然后通过光学滤波器34滤出需要的光谱部分即输出脉冲D。
脉冲D在第四平面反射镜35上以45度角反射，然后入射第三透射光栅37和第四透射光栅38组成的光栅对，第三透射光栅37和第四透射光栅38平行放置，且第四透射光栅38安装在精密可调位移平台上，可灵活控制光栅对间距，脉冲序列经过第六平面反射镜39向下折返并降低一定高度后再次返回并透过光栅对，最终在第五平面反射镜36上以45度角反射输出压缩脉冲E；
压缩脉冲E通过第五半波片40和第三偏振分束器42调节功率，进而输出小功率的脉冲G，并入射到多光子显微镜43实现对生物样品的成像。
实施例2
本实施例用来说明本发明的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统的波长转换。
本实施例采用自相位调制光谱选择(SESS)的方法通过第一非球面透镜28将1040nm的脉冲聚焦到光谱旁瓣滤波光纤29中，高能量的窄带飞秒脉冲在长度为7.5±2.5cm的光纤内传输即可获得足够的光谱展宽，展宽光谱由一系列相互独立的光谱旁瓣构成，其中最左侧和最右侧的旁瓣包含大量的脉冲能量。光谱旁瓣滤波光纤29中传输的光通过第二非球面透镜30输出准直光，通过第四半波片31和第二偏振分束器32将输出准直光调节为P偏振，利用光学滤波器34滤出包含能量最多的最左/最右的光谱旁瓣，可以获得波长可大范围调谐的近变换极限飞秒脉冲进而实现波长转换。当光谱最右侧展宽到1110nm时，利用光学滤波器34滤出右旁瓣，即输出脉冲D。
脉冲D在第四平面反射镜35上以45度角反射，然后入射第三透射光栅37和第四透射光栅38组成的光栅对，第三透射光栅37和第四透射光栅38平行放置，且第四透射光栅38安装在精密可调位移平台上，可灵活控制光栅对间距，脉冲序列经过第六平面反射镜39向下折返并降低一定高度后再次返回并透过光栅对，最终在第五平面反射镜36上以45度角反射输出压缩脉冲E。最终压缩脉冲E即为中心波长在1110nm、平均功率550mW、脉宽48fs的超短脉冲。
使用脉冲E驱动多光子显微镜43可以同时对发射光谱重叠的荧光团成像，并高效激发倍频信号，接着通过结合多个信号检测通道即可实现多光子激发荧光(MPEF)、二倍频(SHG)和三倍频(THG)信号的同时收集。本发明可以轻松实现波长转换，获得适合多光子显微镜成像的波长。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (26)
1.一种自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述显微镜系统包括：飞秒激光前端模块、脉冲展宽放大模块、脉冲压缩模块、光谱展宽滤波模块和多光子显微镜模块，所述脉冲压缩模块包括第一脉冲压缩模块和第二脉冲压缩模块；其中，
所述飞秒激光前端模块的输出端与所述脉冲展宽放大模块的输入端相连，所述脉冲展宽放大模块的输出端与所述第一脉冲压缩模块的输入端相连，所述第一脉冲压缩模块输出端与所述光谱展宽滤波模块输入端相连，所述光谱展宽滤波模块的输出端与所述第二脉冲压缩模块的输入端相连，所述第二脉冲压缩模块的输出端与所述多光子显微镜模块的输入端相连；
所述飞秒激光前端模块用于输出超短脉冲序列，所述脉冲展宽放大模块用于对输入脉冲引入色散进行脉宽展宽然后进行功率放大，所述第一脉冲压缩模块用于对从脉冲展宽放大模块输出端输出的脉冲进行色散补偿，所述光谱展宽滤波模块用于对第一脉冲压缩模块输出的脉冲利用自相位调制效应展宽光谱然后对所需波段进行滤波，所述第二脉冲压缩模块用于对从光谱展宽滤波模块输出端输出的脉冲进行色散补偿，所述多光子显微镜模块被第二脉冲压缩模块输出的脉冲驱动用于对样品进行成像；
所述的光谱展宽滤波模块包括：反射镜、半波片、挡光板、偏振分束器、非球面透镜、光谱旁瓣滤波光纤和光学滤波器；其中，压缩脉冲在所述反射镜上反射，接着经过所述半波片和所述偏振分束器被调整为P偏振，然后所述压缩脉冲通过所述非球面透镜被聚焦到所述光谱旁瓣滤波光纤的纤芯，通过所述光谱旁瓣滤波光纤所述压缩脉冲的光谱被展宽，接着经过所述非球面透镜被准直，进一步通过所述半波片和所述偏振分束器被调整为P偏振，然后通过所述光学滤波器滤出需要的光谱部分即输出脉冲；
所述脉冲压缩模块包括色散补偿器件；
经所述脉冲展宽放大模块输出的脉冲序列无阻挡的射向所述脉冲压缩模块的色散补偿器件，再经过第二平面反射镜折返并降低高度后再次透过所述色散补偿器件，在第一平面反射镜上反射输出压缩脉冲。
2.根据权利要求1所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于：所述飞秒激光前端模块包括振荡器；其中，
所述飞秒激光前端模块输出飞秒脉冲序列的重复频率为40～45MHz；
所述飞秒激光前端模块中的振荡器发射的超短脉冲序列中心波长范围为1μm～1.06μm；和/或
所述振荡器选为光纤激光振荡器或固态激光振荡器。
3.根据权利要求2所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于：
所述飞秒激光前端模块输出飞秒脉冲序列的重复频率为43MHz；
所述飞秒激光前端模块中的振荡器发射的超短脉冲序列中心波长范围为1.04μm；和/或
所述振荡器选为掺镱光纤激光振荡器。
4.根据权利要求3所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述振荡器选为锁模的掺镱光纤激光振荡器。
5.根据权利要求4所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述锁模的方式选自以下一种或多种：半导体可饱和吸收镜、非线性偏振旋转、非线性光学环形镜。
6.根据权利要求5所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述锁模的方式为半导体可饱和吸收镜。
7.根据权利要求6所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述锁模的掺镱光纤激光振荡器为基于半导体可饱和吸收镜锁模的掺镱光纤激光振荡器。
8.根据权利要求1所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于：所述脉冲展宽放大模块包括光纤隔离器、光纤展宽器、空间隔离器和两级光纤放大器。
9.根据权利要求8所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于：
所述脉冲展宽放大模块还包括泵浦激光源、波分复用器、准直器、半波片；和/或
所述飞秒激光前端模块发射的超短脉冲序列经过所述光纤展宽器和所述两级光纤放大器后脉冲平均功率被放大到5～7W。
10.根据权利要求9所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述飞秒激光前端模块发射的超短脉冲序列经过所述光纤展宽器和所述两级光纤放大器后脉冲平均功率被放大到5～6W。
11.根据权利要求1所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述色散补偿器件为光栅对和/或棱镜对。
12.根据权利要求11所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述色散补偿器件为光栅对。
13.根据权利要求12所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述脉冲压缩模块包括反射镜和透射光栅对。
14.根据权利要求13所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述透射光栅对平行放置，并且其中一个透射光栅安装于可调位移平台上。
15.根据权利要求1所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述光谱旁瓣滤波光纤为大模场光子晶体光纤或单模光子晶体光纤。
16.根据权利要求15所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述光谱旁瓣滤波光纤为大模场光子晶体光纤-8或单模光子晶体光纤-12。
17.根据权利要求16所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述光谱旁瓣滤波光纤为单模光子晶体光纤-12。
18.根据权利要求17所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述单模光子晶体光纤-12的长度为5～10cm。
19.根据权利要求18所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述单模光子晶体光纤-12的长度为5～7cm。
20.根据权利要求19所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于，所述单模光子晶体光纤-12的长度为5.5cm。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统，其特征在于：所述多光子显微镜模块包括：半波片、挡光板、偏振分束器和多光子显微镜。
22.一种驱动显微镜的方法，其特征在于：所述方法包括：使用权利要求1至21中任一项所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统驱动显微镜。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述显微镜系统的飞秒激光前端模块发射超短脉冲序列，经所述脉冲展宽放大模块输出功率放大的超短脉冲序列，所述功率放大的超短脉冲序列经第一脉冲压缩模块输出压缩脉冲，所述压缩脉冲经光谱展宽滤波模块光谱被展宽并被调整为P偏振后，经光学滤波器过滤得到输出脉冲，所述输出脉冲经过第二脉冲压缩模块输出压缩脉冲，最后经多光子显微镜模块实现样品的成像。
24.一种非线性光学显微镜，其特征在于：所述非线性光学显微镜包括根据权利要求1至21中任一项所述的自相位调制光谱选择驱动的显微镜系统。
25.根据权利要求24所述的非线性光学显微镜，其特征在于，所述非线性光学显微镜选自以下一种或多种：无标记自发荧光多倍频显微镜、倍频显微镜、相干反斯托克斯拉曼散射显微镜、受激拉曼散射显微镜。
26.根据权利要求25所述的非线性光学显微镜，其特征在于，所述非线性光学显微镜为无标记自发荧光多倍频显微镜。
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