CN110567927B - 双光子显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种双光子显微成像系统，所述双光子显微成像系统包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，所述二次谐波产生装置位于所述激光器与所述双光子显微成像装置之间；所述二次谐波产生装置用于对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，所述二次谐波产生装置包括依次设置于所述激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质。本发明通过非线性介质对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，大大简化了整个系统的结构、降低了整个系统的成本，且非线性介质受环境干扰较小，从而提升了整个系统的稳定性。此外，本发明不需要采用结构复杂且价格昂贵的锁模钛蓝宝石激光器作为泵浦光源，进一步降低了成本。

Description

双光子显微成像系统
技术领域
本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及一种双光子显微成像系统。
背景技术
双光子荧光显微成像技术利用非线性激发原理，将有效激发体积限制在物镜焦点，因而极大提高了普通单光子荧光光学显微镜的成像分辨率，具有优秀的三维扫描层析能力。双光子显微成像技术对散射生物样品具有亚细胞的分辨率，在生物活体组织荧光成像领域，尤其是脑、皮肤等高散射组织的体成像中，已成为一种必不可少的成像工具。
常用的双光子显微镜通过使用锁模钛蓝宝石激光器作为激发光源，发射波长为650nm～1050nm，这些激光器结构复杂、价格昂贵，且钛蓝宝石的增益最大值在800nm处，当接近680nm时增益曲线快速下降，从而限制了低于680nm处可获得的功率。然而在一些生物应用领域只有短波长光源才能激发出荧光信号，例如：红细胞无标记荧光成像领域，且短波长光源相对于长波长光源具有更高的荧光激发效率。现有的采用680nm以下激发光源的双光子显微镜通过以下两种方式实现：一种是通过将钛蓝宝石发射的红色激光导入一段特殊设计的光子晶体光纤中，使其波长由于非线性效应发生频率上转换；另一种是通过将单一中心波长在1000nm左右的近红外飞秒光纤激光器发射的长波长激光导入光参量振荡器(OPO)中，实现飞秒激光波长的转换。利用光子晶体光纤或光参量振荡技术均具有较高的理论门槛，实施起来比较困难。另外，非线性光纤技术仍然需要钛蓝宝石这样复杂且昂贵的激光器作为泵浦光源，且光子晶体光纤对环境条件(如温度、泵浦功率等)比较敏感；光参量振荡技术虽然可以采用性价比较高的光纤飞秒激光器作为原始光源，但是光参量振荡器结构比较复杂，调节也比较麻烦。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种双光子显微成像系统，能够简化结构、降低成本、提升整个系统的稳定性。
本发明提出的具体技术方案为：提供一种双光子显微成像系统，所述双光子显微成像系统包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，所述二次谐波产生装置位于所述激光器与所述双光子显微成像装置之间；所述二次谐波产生装置用于对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，所述二次谐波产生装置包括依次设置于所述激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质。
进一步地，所述非线性介质的材质为三硼酸锂晶体、偏硼酸钡晶体、磷酸钛氧钾晶体中的一种，和/或所述非线性介质的厚度为0.5mm～5mm。
进一步地，所述二次谐波产生装置还包括第一聚焦透镜和第一准直透镜，所述第一聚焦透镜设置于所述相位延迟片与所述非线性介质之间，所述第一准直透镜设置于所述非线性介质与所述反射器之间；所述第一聚焦透镜的后焦平面与所述第一准直透镜的前焦平面重合，所述非线性介质位于所述第一聚焦透镜的后焦平面上。
进一步地，所述双光子显微成像装置包括反射器、分光器、显微成像结构、载物台、双光子荧光激发检测结构及处理器，所述反射器位于所述激光器的出射光路上，所述分光器位于所述反射器的反射光路上，所述显微成像结构、载物台依次设置于所述分光器的透射光路上，所述双光子荧光激发检测结构设置于所述分光器的反射光路上，或者所述显微成像结构、载物台依次设置于所述分光器的反射光路上，所述双光子荧光激发检测结构设置于所述分光器的透射光路上，所述处理器与所述双光子荧光激发检测结构连接。
进一步地，所述双光子荧光激发检测结构包括依次设置于所述分光器的反射光路或透射光路上的第二聚焦透镜、滤光片及光电探测器，所述光电探测器位于所述第二聚焦透镜的后焦平面上，所述光电探测器与所述处理器连接。
进一步地，所述反射器为振镜，所述反射器与所述处理器连接。
进一步地，所述双光子显微成像装置还包括设于所述反射器的反射光路上的扩束结构，所述扩束结构包括第二准直透镜和第三聚焦透镜，所述第二准直透镜位于所述分光器与所述第三聚焦透镜之间；所述第三聚焦透镜的后焦平面与所述第二准直透镜的前焦平面重合。
进一步地，所述显微成像结构包括物镜和驱动器，所述物镜设于所述分光器与所述载物台之间，所述驱动器分别与所述物镜、处理器连接。
进一步地，所述分光器为二向色镜。
进一步地，所述激光器为近红外锁模光纤激光器，所述近红外锁模光纤激光器的中心波长为1000nm～1100nm。
本发明提供的双光子显微成像系统包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，所述二次谐波产生装置包括依次设置于所述激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质，通过非线性介质对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，大大简化了整个系统的结构、降低了整个系统的成本，且非线性介质受环境干扰较小，从而提升了整个系统的稳定性。此外，本发明不需要采用结构复杂且价格昂贵的锁模钛蓝宝石激光器作为泵浦光源，进一步降低了成本。
附图说明
下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
图1为实施例一的双光子显微成像系统的结构示意图；
图2为实施例一的双光子显微成像系统的另一结构示意图；
图3为实施例二的双光子显微成像系统的结构示意图；
图4为实施例四的双光子显微成像系统的结构示意图。
具体实施方式
以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。在附图中，相同的标号将始终被用于表示相同的元件。
本申请提供的双光子显微成像系统包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，二次谐波产生装置位于激光器与双光子显微成像装置之间。二次谐波产生装置用于对激光器发出的激光的频率进行倍增，以获得波长为激光器发出的激光的波长的一半的短波长激发脉冲，双光子显微成像装置用于获取样品在激光器的激发下产生的荧光图像。其中，二次谐波产生装置包括依次设置于激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质。相位延迟片用于调节激光器发出的激光的相位，以获得具有预定偏振方向的激光，非线性介质用于对具有预定偏振方向的激光进行频率倍增，产生波长为激光器发出的激光的波长的一半的短波长激发脉冲。
本申请通过非线性介质对激光器发出的激光的频率进行倍增，大大简化了整个系统的结构、降低了整个系统的成本，且非线性介质受环境干扰较小，从而提升了整个系统的稳定性。此外，本申请不需要采用结构复杂且价格昂贵的锁模钛蓝宝石激光器作为泵浦光源，进一步降低了成本。
下面通过几个具体的实施例并结合附图来对本申请中的双光子显微成像系统的结构进行详细的描述。
实施例一
参照图1、图2，本实施例中的双光子显微成像系统包括激光器1、二次谐波产生装置2及双光子显微成像装置3。为了描述方便，以下将激光器1发出的激光简称为原始激光，二次谐波产生装置2位于激光器1与双光子显微成像装置3之间。二次谐波产生装置2用于对原始激光的频率进行倍增，以获得短波长激发脉冲，其中，短波长激发脉冲的波长为原始激光的波长的一半。双光子显微成像装置3用于获取样品在激光器的激发下产生的荧光图像。二次谐波产生装置2包括依次设置于激光器1的出射光路上的相位延迟片21、非线性介质22。相位延迟片21用于调节原始激光的相位，以获得具有预定偏振方向的激光，非线性介质22用于对具有预定偏振方向的激光进行频率倍增，以产生波长为原始激光的波长的一半的短波长激发脉冲。具体地，相位延迟片21为二分之一波片，经过相位延迟片21后的激光与原始激光的相位差为180°，即当一束线偏振光以与二分之一波片的晶轴成α角入射至二分之一波片后，从二分之一波片出射的线偏振光的偏振方向与原线偏振光的偏振方向之间的夹角为2α，入射光偏振态不变，通过改变二分之一波片晶轴角度，从而得到具有预定偏振方向的激光。
非线性介质22的材质为三硼酸锂(LBO)晶体、偏硼酸钡(BBO)晶体、磷酸钛氧钾(KTP)晶体中的一种，非线性介质22的厚度为0.5mm～5mm，当然，本实施例中的非线性介质22的材质也可以选择其他非线性光学晶体，这里不做限制。本实施例中可以根据非线性介质22的材质以及需要获得的短波长激发脉冲的中心波长的大小来确定非线性介质22的厚度及切割属性，例如，需要获得的短波长激发脉冲的中心波长的520nm，厚度为2mm的LBO晶体，其切割角为θ＝90°，φ＝0°。双光子显微成像装置3包括反射器31、分光器32、显微成像结构33、载物台34、双光子荧光激发检测结构35及处理器36。反射器31位于激光器1的出射光路上，其用于将入射到其上的激光反射至分光器32上。分光器32位于反射器31的反射光路上。较佳地，本实施例中的分光器32为二向色镜，其根据波长对光束进行透射或反射。
如图1所示，显微成像结构33、载物台34依次设置于分光器32的透射光路上，双光子荧光激发检测结构35设置于分光器32的反射光路上，处理器36与双光子荧光激发检测结构35连接。
载物台34用于承载样品，原始激光通过二次谐波产生装置2后产生短波长激发脉冲并入射到反射器31，反射器31将其反射至分光器32上，分光器32对短波长激发脉冲进行透射并入射至显微成像结构33上，显微成像结构33将短波长激发脉冲聚焦至样品上并激发样品产生荧光，样品产生的荧光经过显微成像结构33后入射至分光器32上，分光器32将荧光反射至双光子荧光激发检测结构35。
如图2所示，在本实施例的另一实施方式中，显微成像结构33、载物台34依次设置于分光器32的反射光路上，双光子荧光激发检测结构35设置于分光器32的透射光路上。
原始激光通过二次谐波产生装置2后产生短波长激发脉冲并入射到反射器31，反射器31将其反射至分光器32上，分光器32对短波长激发脉冲反射至显微成像结构33上，显微成像结构33将短波长激发脉冲聚焦至样品上并激发样品产生荧光，样品产生的荧光经过显微成像结构33后入射至分光器32上，分光器32将荧光透射至双光子荧光激发检测结构35。
本实施例中的双光子荧光激发检测结构35包括依次设置于分光器32的反射光路上的第二聚焦透镜351、滤光片352及光电探测器353，光电探测器353位于第二聚焦透镜351的后焦平面上，光电探测器353与处理器36连接。其中，滤光片352用于对荧光进行过滤，滤除分光器32反射的激发光和自然光。
较佳地，光电探测器353为光电倍增管，第二聚焦透镜351用于将分光器32反射的荧光聚焦至光电探测器353上，光电探测器353将接收的荧光所对应的光信号转换为电信号后发送给处理器36，处理器36对电信号进行图像处理并对处理后的图像进行显示、存储。较佳地，本实施例中的反射器31为振镜，振镜与处理器36连接，通过处理器36来控制振镜的偏转角度和位置，以使得振镜以特定角度将短波长激发脉冲反射至分光器32上。具体地，振镜包括X轴方向电机、Y轴方向电机以及两个反射镜，X轴方向电机、Y轴方向电机分别与其中一个反射镜连接，且X轴方向电机、Y轴方向电机分别与处理器36连接，通过处理器36控制X轴方向电机、Y轴方向电机转动来控制两个反射镜的偏转方向，从而实现短波长激发脉冲的偏转，以使得振镜以特定角度将短波长激发脉冲反射至分光器32上。
较佳地，显微成像结构33包括物镜331和驱动器332，物镜331设于分光器32与载物台34之间。驱动器332分别与物镜331、处理器36连接，通过处理器36控制驱动器332的运动进而带动物镜331在轴向上移动，从而获得样品在不同成像深度上的荧光图像。
本实施例中的反射器31为振镜以及显微成像结构33包括物镜331和驱动器332可以实现样本三维成像。具体地，通过处理器36控制振镜的位置来进行横向扫描，获得多个横向荧光图像，通过处理器36控制驱动器332来带动物镜331在轴向上移动，从而获得样品在不同成像深度上的多个轴向荧光图像，处理器36再将多个横向荧光图像和多个轴向荧光图像进行处理便可以获得样本的三维图像。
本实施例中的激光器1为近红外锁模光纤激光器，较佳地，近红外锁模光纤激光器的中心波长为1000nm～1100nm，近红外锁模光纤激光器发出的激光通过二次谐波产生装置2倍频后产生中心波长位于绿光波段(500nm～550nm)的短波长激发脉冲。
当然，本实施例中激光器1的波长不限于上面所列举的范围，也可以是中心波长为1100nm～1600nm的光纤激光器，例如，中心波长为1300nm或1310nm的锁模光纤激光器，也可以是中心波长为900nm～1000nm的光纤激光器，例如，中心波长为980nm或920nm的锁模光纤激光器。
实施例二
参照图3，本实施例与实施例一的不同之处在于，本实施例中的二次谐波产生装置2还包括第一聚焦透镜23和第一准直透镜24，第一聚焦透镜23设置于相位延迟片21与非线性介质22之间，第一准直透镜24设置于非线性介质22与反射器31之间。第一聚焦透镜23的后焦平面与第一准直透镜24的前焦平面重合，非线性介质22位于第一聚焦透镜23的后焦平面上。第一聚焦透镜23用于将透过相位延迟片21的激光聚焦至非线性介质22上，第一准直透镜24用于将透过非线性介质22的激光进行准直，通过第一聚焦透镜23和第一准直透镜24可以对短波长激发脉冲进行扩束，增加短波长激发脉冲的光斑尺寸。
本实施例中的双光子显微成像装置3还包括设于反射器31与分光器32之间的扩束结构37，扩束结构37包括第二准直透镜371和第三聚焦透镜372，第二准直透镜371位于分光器32与第三聚焦透镜372之间，第三聚焦透镜372的后焦平面与第二准直透镜371的前焦平面重合。第三聚焦透镜372用于将反射器31反射的激光聚焦至第三聚焦透镜372的后焦平面，第一准直透镜24用于将从第三聚焦透镜372的后焦平面出射的激光进行准直后入射至分光器32上，通过第二准直透镜371和第三聚焦透镜372可以进一步对短波长激发脉冲进行扩束。
实施例三
参照图4，本实施例与实施例二的不同之处在于，本实施例中的反射器31为普通反射镜。本实施例中的双光子显微成像装置3还包括设于扩束结构37与分光器32之间的柱面透镜39，第二准直透镜371出射的沿X轴方向的平行光束聚焦至显微成像结构33只包括物镜331，载物台34包括样品架341和驱动器342，驱动器342分别与样品架341、处理器36连接，通过处理器36控制驱动器342的运动进而带动样品架341在Y轴方向上移动(Y轴方向为垂直于X、Z所在平面的方向)，从而获得样品在不同切面上的荧光图像，处理器36再将多个不同切面上的荧光图像进行处理便可以获得样本的三维图像。
本实施例中的双光子荧光激发检测结构35也与实施例二不同，本实施例中的双光子荧光激发检测结构35包括依次设置于样品的荧光出射光路上的荧光收集物镜354、荧光准直透镜355、荧光分光器356、荧光滤光片357、荧光探测器358。荧光收集物镜354的后背孔径与荧光准直透镜355的前焦面重合，荧光收集物镜354将样品发射的平面荧光信号聚焦至荧光准直透镜355的前焦面，荧光准直透镜355用于将该聚焦后的荧光信号准直后出射至荧光分光器356上，荧光分光器356用于透射一部分荧光至荧光滤光片357上并通过荧光滤光片357进一步过滤后到达荧光探测器358。较佳地，本实施例中的荧光探测器358也为CCD相机。其中，本实施例中的荧光分光器356用于分离荧光中的激光成分，荧光滤光片357用于滤除其他荧光成分。
本实施例到达样品的激发光束为一个薄的平面，因而激发的荧光信号为一个面的信息，这与实施例二中到达样品的激发光束为一个点不同。具体地，第二准直透镜371出射的沿X轴方向的平行光束聚焦至物镜331上，第二准直透镜371出射的沿Y轴方向的平行光束平行入射至物镜331上，从而获得位于X轴方向和Z轴方向上的平面激发光束。通过驱动器342带动样品架341沿Y轴移动样品，使激发光束入射至样品上并激发样品不同的平面，从而获得样品三维信息。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种双光子显微成像系统，其特征在于，包括激光器、二次谐波产生装置及双光子显微成像装置，所述二次谐波产生装置位于所述激光器与所述双光子显微成像装置之间；所述二次谐波产生装置用于对所述激光器发出的激光的频率进行倍增，所述二次谐波产生装置包括依次设置于所述激光器的出射光路上的相位延迟片、非线性介质，所述相位延迟片用于调节激光器发出的激光的相位，以获得具有预定偏振方向的激光，所述非线性介质用于对具有预定偏振方向的激光进行频率倍增，产生波长为激光器发出的激光的波长的一半的短波长激发脉冲；所述双光子显微成像装置包括反射器、分光器、显微成像结构、载物台、双光子荧光激发检测结构及处理器，所述反射器位于所述激光器的出射光路上，所述分光器位于所述反射器的反射光路上，所述显微成像结构、载物台依次设置于所述分光器的透射光路上，所述双光子荧光激发检测结构设置于所述分光器的反射光路上，或者所述显微成像结构、载物台依次设置于所述分光器的反射光路上，所述双光子荧光激发检测结构设置于所述分光器的透射光路上，所述处理器与所述双光子荧光激发检测结构连接；所述激光器为近红外锁模光纤激光器，所述近红外锁模光纤激光器的中心波长为1000nm～1100nm；所述相位延迟片为二分之一波片。
2.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述非线性介质的材质为三硼酸锂晶体、偏硼酸钡晶体、磷酸钛氧钾晶体中的一种，和/或所述非线性介质的厚度为0.5mm～5mm。
3.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述二次谐波产生装置还包括第一聚焦透镜和第一准直透镜，所述第一聚焦透镜设置于所述相位延迟片与所述非线性介质之间，所述第一准直透镜设置于所述非线性介质与所述反射器之间；所述第一聚焦透镜的后焦平面与所述第一准直透镜的前焦平面重合，所述非线性介质位于所述第一聚焦透镜的后焦平面上。
4.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述双光子荧光激发检测结构包括依次设置于所述分光器的反射光路或透射光路上的第二聚焦透镜、滤光片及光电探测器，所述光电探测器位于所述第二聚焦透镜的后焦平面上，所述光电探测器与所述处理器连接。
5.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述反射器为振镜，所述反射器与所述处理器连接。
6.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述双光子显微成像装置还包括设于所述反射器的反射光路上的扩束结构，所述扩束结构包括第二准直透镜和第三聚焦透镜，所述第二准直透镜位于所述分光器与所述第三聚焦透镜之间；所述第三聚焦透镜的后焦平面与所述第二准直透镜的前焦平面重合。
7.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述显微成像结构包括物镜和驱动器，所述物镜设于所述分光器与所述载物台之间，所述驱动器分别与所述物镜、处理器连接。
8.根据权利要求1所述的双光子显微成像系统，其特征在于，所述分光器为二向色镜。
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