CN105929526B - 一种体全息还原扫描光束的sted超分辨显微系统及显微方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及方法，包括激发光记录装置，将激发光干涉信息记录于体全息材料上；消耗光记录装置，将消耗光干涉信息记录于体全息材料上；扫描光束还原装置，将记录于体全息材料上的激发光和消耗光的光信息还原；偏振组件，被还原的激发光和消耗光经过偏振组件成为线偏振光；第一光束输出组件，用于透射或反射光束；二维扫描振镜装置，使所述激发光和消耗光摆动，实现二维扫描；显微物镜，对样品进行成像；探测光路；显示与处理单元，用于显示样品图像和控制所述二维扫描振镜装置，采用本发明可解决现有的STED显微技术由于外界的震动、温差等因素导致激发光和消耗光的聚焦光斑重合度低的问题。

Description

一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及显微方法

技术领域

本发明涉及医疗器械，尤其涉及的是一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及显微方法。

背景技术

受激辐射消耗(Stimulated Emission Depletion,STED)显微技术是在共聚焦扫描显微术的基础上，引入0至2π涡旋相位调制的消耗光，在焦点形成中空型光斑并与激发光斑重合。通过受激辐射原理，消耗激发光斑边缘荧光，压缩荧光光斑面积，使得激发光斑尺寸突破衍射极限，实现超分辨。因此，同时具备远场超分辨和断层切片扫描成像特点的STED显微术，被广泛应用于生物科学等领域。由于STED显微技术需要激发光和消耗光的聚焦光斑在横向上和轴向上都高度重合，两聚焦光斑中心的错位会严重影响超分辨效果，因此，系统在搭建和调试过程中需要引入精密的角度调节器件，并且调试过程繁琐，并使用前仍需要手动或利用自动模块来检验和调整两光斑的重合度，外界的震动、温差等因素都会造成两光束光斑的不重合。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及显微方法，解决如下技术问题：1、现有的STED显微技术由于外界的震动、温差等因素导致激发光和消耗光的聚焦光斑重合度低。2、STED显微系统在搭建和调试过程中需要引入精密的角度调节器件，并且调试过程繁琐，使用前仍需要手动或利用自动模块来检验和调整两光斑的重合度。

本发明的技术方案如下：

一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，包括激发光记录装置，发射激发光并将激发光干涉信息记录于体全息材料上；

消耗光记录装置，发射激发光和消耗光并将两束光的干涉信息记录于体全息材料上；(体全息材料上是同一位置上，依次记录了两束光)

扫描光束还原装置，发射激发光和消耗光将记录于体全息材料上的激发光和消耗光的光信息还原；

偏振组件，被还原的激发光和消耗光经过偏振组件成为线偏振光；

第一光束输出组件，用于透射或反射光束；

二维扫描振镜装置，使所述激发光和消耗光摆动，实现对样品的二维扫描；

显微物镜，将激发光和消耗光聚焦于样品上；

探测光路，包括一光电探测器，把从样品返回的样品光的光信号转换成电信号；

显示与处理单元，用于显示样品图像和控制所述二维扫描振镜装置以实现对样品的二维扫描。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述激发光记录装置包括激发光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器、分束组件、反射组件和体全息记录板，所述激发光发射器发出激发光束，激发光束经过所述第二光束输出组件透射后被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的激发光束经过光纤准直器准直后被所述分束组件部分反射部分透射，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述消耗光记录装置包括消耗光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器、分束组件、反射组件、0至2π涡旋相位板和体全息记录板，所述消耗光发射器发出消耗光束，消耗光束经过所述第二光束输出组件反射后被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的消耗光束经过光纤准直器准直后被分束组件部分反射部分透射，透射光束光束经过0至2π涡旋相位板形成相位调制光束，反射光束光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述扫描光束还原装置包括激发光发射器、消耗光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器和体全息记录板，激发光发射器和消耗光发射器同时发光，激发光束和消耗光束经过所述第二光束输出组件后被合并，合并后的光束被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的光束经过光纤准直器准直后照射所述体全息记录板。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述二维扫描振镜装置包括X轴扫描振镜、Y轴扫描振镜和一振镜控制器，所述振镜控制器控制所述X轴扫描振镜绕X轴方向摆动，控制Y轴扫描振镜绕Y轴方向摆动以实现对样品的二维扫描。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，还包括中继光路，所述中继光路包括第一透镜和第二透镜，所述第一透镜的像方焦点与所述第二透镜的物方焦点重合。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述第一光束输出组件和所述二维扫描振镜装置之间还设置有消色差二分之一波片，所述第二透镜和所述显微物镜之间设置有消色差四分之一波片。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述第一光束输出组件为荧光二向色镜。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述第二光束输出组件为二向色镜。

所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，所述探测光路还包括只让返回样品光通过的滤光片和将返回样品光耦合进多模光纤的第三透镜，返回样品光被耦合进多模光纤后被传输至所述光电探测器。

一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微方法，其中，包括以下步骤：

步骤A00:记录激发光,激发光发射器发出激发光束，激发光束经过第二光束输出组件透射后被所述耦合组件耦合进单模光纤内传输，单模光纤出射端的激发光束经过光纤准直器准直后被所述分束组件部分反射部分透射，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上；

步骤B00：记录消耗光，消耗光发射器发出消耗光束，消耗光束经过第二光束输出组件反射后被耦合组件耦合进单模光纤内传输，单模光纤出射端的消耗光束经过光纤准直器准直后被分束组件部分反射部分透射，透射光束经过0至2π涡旋相位板形成相位调制光束，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上；

步骤C00：扫描光束还原，激发光发射器和消耗光发射器同时发光，激发光束和消耗光束经过所述第二光束输出组件后被合并，合并后的光束被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的光束经过光纤准直器准直后照射记录有激发光和消耗光信息的体全息记录板；

步骤D00：被还原的准直的激发光和经过0至2π涡旋相位板调制的消耗光经过偏振组件后透射进第一光束输出组件，被X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射后经过中继光路放大，通过消色差四分之一波片后经显微物镜照射样品；

步骤E00：样品反射的荧光信号被显微物镜收集后，按原光路返回，依次通过消色差四分之一波片、第二透镜、第一透镜、Y轴扫描振镜、X轴扫描振镜和消色差二分之一波片后，经第一光束输出组件反射进入探测光路，荧光信号通过滤光片后，经第三透镜聚焦并耦合到多模光纤中，荧光从多模光纤出射端出射，并被光电探测器探测，光电探测器将光信号转换成电信号后传输至显示与处理单元。

本发明的有益效果：本发明通过提供一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及方法，利用体全息技术，把已高度重合的激发光束和0～2π相位调制后的消耗光束记录在体全息材料上，利用参考光反向入射体全息材料时，即可将两光束还原，被还原的两光束高度重合，很好地解决了由于外界振动、温度差带来的光束漂移导致重合度低的问题，免去了使用前的检验和调整两光斑的重合度的步骤，系统使用更简单，效率更高。

附图说明

图1是本发明中激发光记录装置的结构示意图。

图2是本发明中消耗光记录装置的结构示意图。

图3是本发明的结构示意图。

图4是激发光斑和中空型消耗光斑叠加形成压缩的荧光光斑的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。

参阅图1至图3，本发明提供一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其中，包括激发光记录装置1，发射激发光并将激发光干涉信息记录于体全息材料上；消耗光记录装置2，发射消耗光并将消耗光干涉信息记录于体全息材料上；扫描光束还原装置3，发射激发光和消耗光将记录于体全息材料上的激发光和消耗光的光信息还原；偏振组件4，被还原的激发光和消耗光经过偏振组件4成为线偏振光；第一光束输出组件5，用于透射或反射光束；二维扫描振镜装置7，使所述激发光和消耗光摆动，实现对样品的二维扫描；显微物镜200，聚焦激发光和消耗光；探测光路300，包括一光电探测器301，把从样品返回的样品光的光信号转换成电信号；显示与处理单元400，用于显示样品图像和控制所述二维扫描振镜装置7以实现对样品的二维扫描。

进一步地，激发光记录装置1包括激发光发射器10、第二光束输出组件11、耦合组件12、单模光纤13、光纤准直器14、分束组件15、反射组件16和体全息记录板17，在本实施例中，激发光发射器10为蓝光激光器，激发光发射器10发出蓝光激发光束，激发光束经过所述第二光束输出组件11透射后被所述耦合组件12耦合进所述单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的激发光束经过光纤准直器14准直后被所述分束组件15部分反射部分透射，分束组件15为半透半反镜，对光束一半透射一半反射，反射光束被反射组件16再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板17上。

进一步地，所述消耗光记录装置2包括消耗光发射器20、第二光束输出组件11、耦合组件12、单模光纤13、光纤准直器14、分束组件15、反射组件16、0至2π涡旋相位板21和体全息记录板17，在本实施例中，消耗光发射器20为红光激光器，消耗光发射器20发出红光消耗光束，消耗光束经过所述第二光束输出组件11反射后被所述耦合组件12耦合进所述单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的消耗光束经过光纤准直器14准直后被分束组件15部分反射部分透射，透射光束经过0至2π涡旋相位板21形成相位调制光束，反射光束被反射组件16再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板17上，此时体全息记录板17记录了激发光束的干涉信息和经过0至2π涡旋相位板21调制的消耗光的干涉信息。

激发光束和消耗光束都是从单模光纤13出射并通过光纤准直器14准直，可以认为是两个位置一致的点光源发出的光束，两光束在记录过程中可以保持高度重合。

进一步地，所述扫描光束还原装置3包括激发光发射器10、消耗光发射器20、第二光束输出组件11、耦合组件12、单模光纤13、光纤准直器14和体全息记录板17，激发光发射器10和消耗光发射器20同时发光，激发光束和消耗光束经过所述第二光束输出组件11后被合并，合并后的光束组成还原光束，被所述耦合组件12耦合进所述单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的光束经过光纤准直器14准直后照射所述体全息记录板17，还原光束入射方向和激发光记录装置1、消耗光记录装置2中的光束入射方向相反。体全息技术具有波长选择性，入射特定波长的还原光只能还原对应波长的光，激发光和消耗光分别还原出准直的激发光和经过0至2π涡旋相位板21调制的消耗光，还原的两光束可保持高度的重合。

进一步地，所述二维扫描振镜装置7包括X轴扫描振镜71、Y轴扫描振镜72和一振镜控制器73，所述振镜控制器73控制所述X轴扫描振镜71绕X轴方向摆动，控制Y轴扫描振镜72绕Y轴方向摆动以实现对样品的二维扫描。振镜控制器73连接所述显示与处理单元400，显示与处理单元400控制振镜控制器73驱动X轴扫描振镜71和Y轴扫描振镜72按规律摆动激发光束和消耗光束。在本实施例中，显示与处理单元400为计算机。

在本实施例中，还包括中继光路8，所述中继光路8包括第一透镜81和第二透镜82，所述第一透镜81的像方焦点与所述第二透镜82的物方焦点重合，X轴扫描振镜71反射面中点与第一透镜81的物方焦点重合，第一透镜2-13与第二透镜2-14焦距之比为：

f2/f1＝D/d

其中，f1为第一透镜81焦距，f2为第二透镜82焦距，D为显微物镜200入瞳直径，d为激发光和消耗光光束直径，为了充分利用显微物镜200的分辨能力，入射光束应尽可能充满显微物镜整个入瞳部，需要对激发光和消耗光光束进行放大，设置包括第一透镜81和第二透镜82的中继光路8，令f2/f1＝D/d，可有效放大激发光和消耗光光束的直径，使其充满显微物镜整个入瞳部以充分利用显微物镜200的分辨能力。

进一步地，所述第一光束输出组件5和所述二维扫描振镜装置7之间还设置有消色差二分之一波片6，所述第二透镜82和所述显微物镜200之间设置有消色差四分之一波片9，通过调整消色差二分之一波片6和消色差四分之一波片9使激发光和消耗光转换成理想的圆偏光，激发光斑样品荧光，中空型消耗光斑通过受激辐射消耗光斑边沿荧光，如图4所示，荧光光斑被压缩，使光斑尺寸突破衍射极限，实现超分辨。

在本实施例中，所述第一光束输出组件5为荧光二向色镜，荧光二向色镜透射蓝光和红光，反射从样品出返回的荧光。

在本实施例中，所述第二光束输出组件11为二向色镜，透射蓝光，反射红光。

进一步地，所述探测光路300还包括只让返回样品光通过的滤光片303和将返回样品光耦合进多模光纤的第三透镜302，返回样品光被耦合进多模光纤后被传输至所述光电探测器301，光电探测器301连接所述显示与处理单元400，显示与处理单元400实时显示样品图像。

本发明还提供一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微方法，其中，包括以下步骤：

步骤A00:记录激发光,激发光发射器10发出激发光束，激发光束经过第二光束输出组件11透射后被所述耦合组件12耦合进单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的激发光束经过光纤准直器14准直后被所述分束组件15部分反射部分透射，反射光束被反射组件16再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上；

步骤B00：记录消耗光，消耗光发射器20发出消耗光束，消耗光束经过第二光束输出组件11反射后被耦合组件12耦合进单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的消耗光束经过光纤准直器14准直后被分束组件15部分反射部分透射，透射光束经过0至2π涡旋相位板21形成相位调制光束，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板17上；

步骤C00：扫描光束还原，激发光发射器10和消耗光发射器20同时发光，激发光束和消耗光束经过所述第二光束输出组件11后被合并，合并后的光束被所述耦合组件12耦合进所述单模光纤13内传输，单模光纤13出射端的光束经过光纤准直器14准直后照射记录有激发光和消耗光信息的体全息记录板17；

步骤D00：体全息记录板17可以还原出先前被记录的准直的激发光和经过0至2π涡旋相位板调制的消耗光，被还原的准直的激发光和经过0至2π涡旋相位板调制的消耗光经过偏振组件4后透射进第一光束输出组件5，被X轴扫描振镜71和Y轴扫描振镜72反射后经过中继光路8放大，通过消色差四分之一波片9后经显微物镜200后形成激发光斑和中空型消耗光斑，中空型消耗光斑通过受激辐射消耗光斑边沿荧光，形成更小荧光光斑；

步骤E00：样品反射的荧光信号被显微物镜200收集后，按原光路返回，依次通过消色差四分之一波片9、第二透镜82、第一透镜81、Y轴扫描振镜72、X轴扫描振镜71和消色差二分之一波片6后，经第一光束输出组件5反射进入探测光路300，荧光信号通过滤光片303后，经第三透镜302聚焦并耦合到多模光纤中，荧光从多模光纤出射端出射，并被光电探测器301探测，光电探测器301将光信号转换成电信号后传输至显示与处理单元400。

本发明通过提供一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统及方法，利用体全息技术，把已高度重合的激发光束和0～2π相位调制后的消耗光束记录在体全息材料上，利用参考光反向入射体全息材料时，即可将两光束还原，被还原的两光束高度重合，高度重合的两光束通过受激辐射原理，消耗激发光斑边沿荧光，压缩荧光光斑的尺寸，实现超分辨显微，很好地解决了由于外界振动、温度差带来的光束漂移导致重合度低的问题，免去了使用前的检验和调整两光斑的重合度的步骤，系统使用更简单，效率更高。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，包括

激发光记录装置，发射激发光并将激发光干涉信息记录于体全息材料上；

消耗光记录装置，发射消耗光并将消耗光干涉信息记录于体全息材料上；

扫描光束还原装置，发射激发光和消耗光将记录于体全息材料上的激发光和消耗光的光信息还原；

偏振组件，被还原的激发光和消耗光经过偏振组件成为线偏振光；

第一光束输出组件，用于透射或反射光束；

二维扫描振镜装置，使所述激发光和消耗光摆动，实现对样品的二维扫描；

显微物镜，将激发光和消耗光聚焦于样品上；

探测光路，包括一光电探测器，把从样品返回的样品光的光信号转换成电信号；

显示与处理单元，用于显示样品图像和控制所述二维扫描振镜装置以实现对样品的二维扫描。

2.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述激发光记录装置包括激发光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器、分束组件、反射组件和体全息记录板，所述激发光发射器发出激发光束，激发光束经过所述第二光束输出组件透射后被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的激发光束经过光纤准直器准直后被所述分束组件部分反射部分透射，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上。

3.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述消耗光记录装置包括消耗光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器、分束组件、反射组件、0至2π涡旋相位板和体全息记录板，所述消耗光发射器发出消耗光束，消耗光束经过所述第二光束输出组件反射后被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的消耗光束经过光纤准直器准直后被分束组件部分反射部分透射，透射光束经过0至2π涡旋相位板形成相位调制光束，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于所述体全息记录板上。

4.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述扫描光束还原装置包括激发光发射器、消耗光发射器、第二光束输出组件、耦合组件、单模光纤、光纤准直器和体全息记录板，激发光发射器和消耗光发射器同时发光，激发光束和消耗光束经过所述第二光束输出组件后被合并，合并后的光束被所述耦合组件耦合进所述单模光纤内传输，单模光纤出射端的光束经过光纤准直器准直后照射所述体全息记录板。

5.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述二维扫描振镜装置包括X轴扫描振镜、Y轴扫描振镜和一振镜控制器，所述振镜控制器控制所述X轴扫描振镜绕X轴方向摆动，控制Y轴扫描振镜绕Y轴方向摆动以实现对样品的二维扫描。

6.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，还包括中继光路，所述中继光路包括第一透镜和第二透镜，所述第一透镜的像方焦点与所述第二透镜的物方焦点重合。

7.根据权利要求6所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述第一光束输出组件和所述二维扫描振镜装置之间还设置有消色差二分之一波片，所述第二透镜和所述显微物镜之间设置有消色差四分之一波片。

8.根据权利要求4所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述第一光束输出组件为荧光二向色镜，所述第二光束输出组件为二向色镜。

9.根据权利要求1所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统，其特征在于，所述探测光路还包括只让返回样品光通过的滤光片和将返回样品光耦合进多模光纤的第三透镜，返回样品光被耦合进多模光纤后被传输至所述光电探测器。

10.一种如权利要求2至9任一项所述的体全息还原扫描光束的STED超分辨显微系统的显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A00:记录激发光,激发光发射器发出激发光束，激发光束经过第二光束输出组件透射后被耦合组件耦合进单模光纤内传输，单模光纤出射端的激发光束经过光纤准直器准直后被分束组件部分反射部分透射，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于体全息记录板上；

步骤B00：记录消耗光，消耗光发射器发出消耗光束，消耗光束经过第二光束输出组件反射后被耦合组件耦合进单模光纤内传输，单模光纤出射端的消耗光束经过光纤准直器准直后被分束组件部分反射部分透射，透射光束经过0至2π涡旋相位板形成相位调制光束，反射光束被反射组件再次反射后与透射光束产生干涉，形成的干涉信息记录于体全息记录板上；

步骤C00：扫描光束还原，激发光发射器和消耗光发射器同时发光，激发光束和消耗光束经过第二光束输出组件后被合并，合并后的光束被耦合组件耦合进单模光纤内传输，单模光纤出射端的光束经过光纤准直器准直后照射记录有激发光和消耗光信息的体全息记录板；

步骤D00：被还原的准直的激发光和经过0至2π涡旋相位板调制的消耗光经过偏振组件后透射进第一光束输出组件，被X轴扫描振镜和Y轴扫描振镜反射后经过中继光路放大，通过消色差四分之一波片后经显微物镜照射样品；

步骤E00：样品反射的荧光信号被显微物镜收集后，按原光路返回，依次通过消色差四分之一波片、第二透镜、第一透镜、Y轴扫描振镜、X轴扫描振镜和消色差二分之一波片后，经第一光束输出组件反射进入探测光路，荧光信号通过滤光片后，经第三透镜聚焦并耦合到多模光纤中，荧光从多模光纤出射端出射，并被光电探测器探测，光电探测器将光信号转换成电信号后传输至显示与处理单元。