CN104614318A - 一种快速的超分辨显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速的超分辨显微成像方法，第一光束和第二光束通过相应的调制函数调制后经过分束棱镜合并成一路光，照射到样品表面，收集待测样品各扫描点发出的信号光，并将该信号光分成两束，其中，所述的第一光束和第二光束同时成像，控制第一光束的频率为v，并以频率v作为参考信号，根据该参考信号从其中一束信号光中提取第一光束对应的信号光强I₁(x，y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，另一束信号光强为I₀(x，y)，并算得第二光束对应的信号光强I₂(x，y)＝I₀(x，y)-I₁(x，y)，再利用最终的有效信号光强I(x,y)实现超分辨成像。本发明还公开了一种快速的超分辨显微成像装置。本发明将传统的空心斑和实心斑分别成像转化为成同时成像，在不改变横向分辨率的同时提高扫描速度。

Description

一种快速的超分辨显微成像方法和装置

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微领域，尤其涉及一种快速的超分辨显微成像方法和装置。

背景技术

长期以来，远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点，一直是生命科学中最常用的观测工具。但由于衍射极限的存在，使传统的光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和500nm。

为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求，在远场荧光显微镜的基础上，科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术，例如单分子荧光成像(PALM和STORM)，受激辐射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM和SSIM)，荧光辐射微分超分辨显微技术(FED)，但是这些技术都有一个共同的不足之处——成像速度较慢。

PALM和STORM需要采集大量的图像用于超分辨图像的重构，因此要完成重构算法进而得到一幅超分辨图像要花去大量的时间，尽管最近有文章表示已经成功地将STORM的速度提高至3秒/幅，但仍不能满足活细胞研究的需要。SIM和SSIM则需要依靠大量复杂数据的预处理，因而对CCD的信噪比有很高的要求，这样就大大增加了成像时间，并且搭建SIM成像系统的要花费较高的成本。STED的成像速度相对较快，但是STED可用的荧光染料非常有限，因为荧光染料的激发和损耗光谱要和激发光及灭、损耗光的波长相匹配。

2012年，荧光辐射微分超分辨显微技术(FED)问世，如专利申请号为201210227898.7的专利文献公开了一种超分辨显微方法和装置，FED使用两束光扫描样，两束激发光得到的图像相减得到高分辨率的图像。虽然FED具有相对较高的信噪比和成像速度，系统也较简单，易于实现，但是两束激发光交替成像的过程限制了FED的成像速度。

发明内容

本发明提供了一种快速的超分辨显微成像方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的分辨率，这种方法在保证分辨率的前提下，极大的提高了成像的速度，且系统结构简单；可以很好的应用在生物、医学等领域，用于观察荧光或非荧光样品，如活细胞等。

一种快速的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

1)将两个激光器同时发出的激光光束准直后转换为线偏振光，对于其中一束激光，通过锁相探测模块的信号发生装置对其频率进行调制；

2)对其中一束线偏振光进行相位调制，调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

3)将另一束光的调制函数换为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

4)两束相位调制的光通过分束棱镜分束成一路光，在经过聚焦和准直后转化为圆偏振光投射到带测样品上，实现对待测样品的二维扫描；

5)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光。将信号光分成两路，其中一束用锁相放大器提取经过其调制的激光扫描得到的信号光，得到光强I₁（x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标。收集另一束信号光得到光强I₀(x,y)。I₀(x,y)-I₁(x,y)＝I₁(x,y)，得到另一路信号光强I₂(x,y)；

6)根据公式I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)计算有效信号光强I(x,y)，并利用I(x,y)得到超分辨图像，其中， 为第一信号光强I₁(x,y)中的最大值，为第二信号光强I₂(x,y)中的最大值。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。

待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定，所述的有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。

本发明还提供了一种用于实现上述显微方法的装置，包括两个光源、承载待测样品的样平台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，所述光源与显微物镜之间依次设有：

用于将所述两个光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；

用于对所述线偏振光进行相位调制的空间光调制器；

用于将两束光合并成一路光的分束棱镜；

用于对光线进行光路偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，圆偏振光通过显微物镜投射到所述待测样品上；

并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

探测系统包括：

布置在空间光调制器和扫描振镜系统的分束镜，所述分束镜在待测样品为荧光样品时应选用二色镜，当待测样品为非荧光样品时应选用偏振分光棱镜；

用于滤去分束镜出射的信号光中的杂散光的带通滤波片，所述带通滤波片在待测样品为非荧光样品时可以省略；

用于探测信号光束的光强信号的探测器，包括由信号发生装置和锁相发达器组成的锁相探测模块和点光源探测器；点光源探测器选用光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)；

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜；

用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器，其位于所述聚焦透镜的焦平面处，所述空间滤波器可以采用针孔或多模光纤，若采用针孔，所用针孔的直径应小于一个艾里斑直径。

所述光源与起偏器之间依次设有用于对所述激光光束进行滤波和准直的单模光纤和准直透镜。

锁相放大器调制的和接手的是同一激光器发出的激光。

优选的，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

在上述的装置中，空间光调制器可相应的涡旋位相板替换，该涡旋位相板的调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

本文发明的原理如下：

在光学系统中，由于衍射现象的存在，光源发出的平行照明光通过显微物镜聚焦到待测样品上的光斑并非是一个理想的点，实际上是一个具有一定尺寸的衍射光斑。待测样品上在此光斑范围内的样品均会发出信号光，从而使得在衍射光斑范围内的样品细节无法被分辨，进而限制了显微系统的分辨率。这种现象通常称为衍射极限，所以为了提高分辨率，必须打破这种极限，因而必须减小样品表面聚焦光斑的面积。

根据德拜积分计算可知，用调制函数的空间光调制器调制光束后，其在显微物镜的后焦面上形成实心光斑，该实心光斑的尺寸与常规光学显微术中所用照明光束聚焦所成衍射斑的尺寸相同。当空间光调制器的调制函数为时，由德拜积分计算可得，调制后光束经显微物镜聚焦后在样品上所成光斑为一个面包圈型的空心光斑。德拜积分的具体形式如下：

$\stackrel{\→}{E}(r_2,{\mathrm{\φ}}_2,z_2)=\mathrm{iC}\∫{\∫}_{\mathrm{\Ω}}\sin \left(\text{\θ}\right){\·A}_1(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·A_2(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]\·e^{\mathrm{ikn}(z_2\cos \mathrm{\θ}+r_2\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_2))}\mathrm{d\θd\φ}$

式中，是以显微物镜的焦点位置为原点的柱坐标系，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，是入射光的振幅分布，表征了显微物镜的结构， $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]$ 则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

用一特定频率信号调制形成空心光斑的光束的激光器，使其发出的第一光束的频率为v，并用此频率信号作为锁相放大器的参考信号。第一光束和第二光束通过相应的调制函数调制后经过分束棱镜合并成一路光，光轴重合，通过显微物镜照射到样品表面。在被光斑照射的范围内样品所发出的信号光通过分光棱镜分成两束，其中一束由锁相放大器探测。锁相放大器根据参考信号v，从两束信号光中提取其被调制过的第一光束对应的空心斑信号光强I₂(x,y)。由分光棱镜分出的另一束光被探测器收集，得到实心板和空心斑叠加的信号光强I₀(x,y)，计算得到实心斑信号光强I₀(x,y)-I₂(x,y)＝I₁(x,y)，再利用公式I(x,y)＝I₁(x,y)-II₂(x,y)计算得到I(x,y)。显然I(x,y)所对应的各扫描点处的有效信号光发光面积将小于I₁(x,y)所对应的各扫描点处的第一信号光发光面积。因此，与常规光学显微方法相比，本发明减小了有效信号光的发光面积，从而可以实现超衍射极限的分辨率。

本发明提供的另外两种装置无需振镜扫描，将上述两种装置的平台更换为2维平移样品台，并增加样品台控制系统，即为本发明提供的第3种和第4中装置。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)将传统的空心斑和实心斑分别成像转化为成同时成像，在不改变横向分辨率的同时提高扫描速度；

(2)横向分辨率显著提高，横向分辨率可以达到200nm以下；

(3)装置结构简洁。

附图说明

图1为本发明一种快速的超分辨显微成像装置的示意图。

图2为本发明中所成空心光斑的归一化光强分布曲线。

图3为本发明中所成实心光斑的归一化光强分布曲线。

图4为本发明中有效信号光光斑与常规光学显微术中信号光光斑的归一化光强分布比较曲线。

图5为本发明中第二种快速的超分辨显微成像装置示意图。

图6为本发明中第三种快速的超分辨显微成像装置示意图。

图7为本发明中第四种快速的超分辨显微成像装置示意图。

图8为本发明的第一种装置在测试非荧光样品时的装置示意图。

图9为本发明的第二种装置在测试非荧光样品时的装置示意图。

图10为本发明的第三种装置在测试非荧光样品时的装置示意图。

图11为本发明的第四种装置在测试非荧光样品时的装置示意图。

具体实施方式

如图1所示，一种快速的超分辨显微成像装置，包括：激光器1、激光器10，单模光纤2、单模光纤9，准直透镜3、准直透镜8，起偏器4、起偏器7，空间光调制器5，分束棱镜6，锁相探测模块11(包括参考信号发生装置及锁相放大器)，探测器12、探测器26，针孔13、针孔25，聚焦透镜14、聚焦透镜24，分束棱镜15，带通滤波片16，二色镜17，扫描振镜系统18，扫描透镜19，场镜20，1/4波片21，显微物镜22，样品台23，控制器27。

单模光纤2、准直透镜3、起偏器4、空间光调制器5依次位于激光器1出射光束的光轴上，起偏器4的透光轴与水平方向平行，激光器1连接锁相探测模块，由参考信号v对光束进行调制。

单模光纤9、准直透镜8、起偏器7、分束棱镜6位于激光器10的光轴上。另外激光器1的光轴通过空间光调制器5后与激光器10在经过分束棱镜6后重合。

扫描透镜19、场镜20、1/4波片21、显微物镜22、样品台23依次位于扫描振镜系统18出射光束的光轴上，样品台23位于显微物镜22的焦平面附近。

带通滤波片16，分束棱镜15，聚焦透镜14，针孔13，探测器12位于二色镜17反射信号光束的光轴上，针孔13位于聚焦透镜的焦面处。聚焦透镜24，针孔25，探测器26位于分束棱镜分束光路的光轴上；针孔25位于聚焦透镜24的焦面上。

控制器27与探测器26、锁相探测模块11、空间光调制器5以及振镜扫描系统18相连，用于保存和处理探测器26及锁相探测模块11收集的信号并控制参考信号发生装置对第一光源进行调制；控制器还用于控制空间光调制器5和振镜扫描系统18。

上述装置中，显微物镜22的数值孔径NA＝1.4；所用针孔13、针孔25的直径为0.73个艾里斑直径，探测器11、26为雪崩光电二极管(APD)。

采用图1所示的装置进行超分辨显微的方法如下：

由控制器27对锁相探测模块11进行控制，利用参考信号v对激光器1的光束进行频率调制。从激光器1发出的激光光束直接被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的激光光束，经过准直透镜3完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器4转换为线偏振光，之后入射到空间光调制器5进行相位调制。

利用控制器27对空间光调制器5进行控制，使其相位调制函数切换为

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

此时，经空间光调制器5进行相位调制之后，出射光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到空间光调制器5上的光束在处的电矢量强度，为经过空间光调制器5相位调制后的出射光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

由空间光调制器5出射的光束经过分束棱镜6，之后入射到振镜扫描系统18上。经扫描振镜系统18出射的光束依次被扫描透镜19聚焦、场镜20准直，之后通过1/4波片21转换为圆偏振光。圆偏振光束经显微物镜22投射到位于样品台23上的待测样品之上。

入射圆偏振光在显微物镜22的焦点附近所成的光场分布可由德拜积分确定，具体如下：

$\stackrel{\→}{E}(r_2,{\mathrm{\φ}}_2,z_2)=\mathrm{iC}\∫{\∫}_{\mathrm{\Ω}}\sin \left(\text{\θ}\right){\·A}_1(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·A_2(\mathrm{\θ},\mathrm{\φ})\·\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]\·e^{\mathrm{ikn}(z_2\cos \mathrm{\θ}+r_2\sin \mathrm{\θ}\cos (\mathrm{\φ}-{\mathrm{\φ}}_2))}\mathrm{d\θd\φ}$

式中，是以显微物镜22的焦点位置为原点的柱坐标系，代表了处的电矢量强度，i为虚数单位，C为归一化常数，θ为光束孔径角，为光束垂直Z轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角，A₁(θ,φ)是入射光的振幅分布，A₂(θ,φ)表征了显微物镜22的结构， $\left[\begin{array}{c}{p}_x\\ p_y\\ p_z\end{array}\right]$ 则表示了入射光的偏振信息，k＝2π/λ，n为介质折射率。

由上式计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜22聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个空心光斑，其具体光场分布归一化曲线如图2所示。

从激光器10发出的激光光束直接被导入单模光纤9，从单模光纤9出射的激光光束，经过准直透镜8完成准直。经过准直后的光束入射到起偏器7转换为线偏振光。该光束未经过空间光调制器，可以等同于经过一个调制函数为的空间光调制器，因此出射光束的电矢量强度可由下式表示：

其中，为入射到空间光调制器5上的光束在处的电矢量强度，为经过空间光调制器5相位调制后的出射光束在处的电矢量强度，i为虚数单位。

由偏振片7出射的线偏振光经分束棱镜6与空间光调制器5出射的光束合并为一束光，并入射到扫描振镜系统17上。经扫描振镜系统18出射的光束依次被扫描透镜19聚焦、场镜20准直，之后通过1/4波片21转换为圆偏振光，圆偏振光束经显微物镜22投射到位于样品台23上的待测样品之上。

入射圆偏振光在显微物镜22的焦点附近所成的光场分布同样可由德拜积分确定。通过计算可以发现，此时入射的圆偏振光经显微物镜22聚焦之后在待测样品上所成光斑为一个实心光斑，其具体光场分布归一化曲线如图3所示。

待测样品所出射的信号光被显微物镜22收集，之后依次通过1/4波片21、场镜20、扫描透镜19、扫描振镜系统18，最后被二色镜17反射。二色镜17反射的信号光束通过带通滤波片16滤去杂散光，之后经分束棱镜15、聚焦透镜14聚焦并通过针孔13进行空间滤波，最终被探测器12所探测并将其信号传递给锁相放大器11，由锁相放大器根据之前调制激光器1的频率探测由激光器1发出的光所产生的信号光的强度I₂(x,y)。由分束棱镜15分束得到另一束光经过聚焦透镜24、针孔25由探测器26进行接收，得到光强I₀(x,y)。由I₀(x,y)-I₂(x,y)＝I₁(x,y)计算得到激光器10发出的光所产生信号光的光强I₁(x,y)。

通过控制器27控制振镜扫描系统18，实现对待测样品的二维扫描，其中x,y为扫描点的二维坐标，记录各点的I₁(x,y)和I₂(x,y)。在由式I(x,y)＝I₁(x,y)-II₂(x,y)计算各扫描点处的有效信号光强I(x,y)，并最终得到超分辨显微图像。

本发明中有效信号光光斑与常规共聚焦显微方法中信号光光斑的归一化光强分布曲线比较如图4所示。由图4可以看出，本发明中有效信号光的光斑尺寸(半高全宽值为0.34个波长)较常规共聚焦显微方法中信号光光斑尺寸(半高全宽值为0.41个波长)有所减小，因此本发明方法可以实现超衍射极限的分辨率。

本文发明的快速的超分辨显微成像装置可以使用涡旋相位板(vortexphase plane—VPP)代替空间光调制器来实现，具体装置如图5所示。与使用空间光调制器相比，使用涡旋相位板来实现超分辨显微更加简洁，省去了空间光调制器及其控制系统。如图5所示，在激光器1的光路上增加涡旋相位板4，将空间光调制器换成平面反射镜6，将光线入射到分束棱镜7中，其他光路不变，如果实验条件允许，反射镜6也可省去，将光线直接入射到分束棱镜中，但这样系统所占空间将增大。

其中涡旋相位板5为0～2π涡旋位相板，其相位调制函数为：

其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，φ为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

采用图5进行超分辨显微方法和采用图1的方法基本一致，其中，省去了控制空间光调制器的步骤。

本文发明的快速的超分辨显微成像装置在上述装置的基础上还可以改为图6和图7所示的装置。图6和图7分别将图1和图5中的振镜扫描系统用二维平移样品台代替，省去振镜扫描系统，将二维平移样品台与控制器相连。采用图6和图7所示的装置进行超分辨显微方法和图1、图3所示装置基本一致。只是将振镜实现的光束二维扫描转变为样品台二维移动实现的扫描。

本文发明的快速的超分辨显微成像装置在测试非荧光样品的时候，图1、图5、图6、图7中的器件16、17改为分束棱镜31，图1、图5、图6、图7变为图8、图9、图10、图11所示。

另外本文发明的所有装置，锁相放大器也可以对激光器10进行调制，探测器11将探测由激光器10发出的光照射在样品上所发出的信号光，为一信号光，探测器26仍然探测总信号光，然后减去探测器11探测的信号光，得到另一信号光。装置如图1中虚线所示，其他装置图做同样修改。

Claims (10)

1.一种快速的超分辨显微成像方法，第一光束和第二光束通过相应的调制函数调制后经过分束棱镜合并成一路光，照射到样品表面，收集待测样品各扫描点发出的信号光，并将该信号光分成两束，其特征在于，所述的第一光束和第二光束同时成像，控制第一光束的频率为v，并以频率v作为参考信号，根据该参考信号从其中一束信号光中提取第一光束对应的信号光强I₁(x,y)，其中x,y为扫描点的二维坐标，另一束信号光强为I₀(x,y)，并算得第二光束对应的信号光强I₂(x,y)＝I₀(x,y)-I₁(x,y)，再利用最终的有效信号光强I(x,y)实现超分辨成像。

2.如权利要求1所述的快速的超分辨显微成像方法，其特征在于，第一光束的调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

3.如权利要求2所述的快速的超分辨显微成像方法，其特征在于，第二光束的调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

4.如权利要求1～3任一项所述的快速的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述的有效信号光强I(x,y)为：

I(x,y)＝I₁(x,y)-γI₂(x,y)

$\mathrm{\γ}=\frac{I_1^{\max }}{{2I}_2^{\max }}$

其中，为第一信号光强I₁(x,y)中的最大值，为第二信号光强I₂(x,y)中的最大值。

5.如权利要求4所述的快速的超分辨显微成像方法，其特征在于，所述有效信号光强值I(x,y)为负时，设置I(x,y)＝0。

6.一种快速的超分辨显微成像装置，包括第一光源和第二光源，承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，以及位于显微物镜所收集信号光光路上的分束棱镜和用于采集分束后信号光光强的第一探测器和第二探测器，其特征在于，所述的第一光源连接有用于调制光束频率的锁相探测模块，该锁相探测模块还用于控制第一探测器采集第一光源对应的信号光强I₁(x,u)；

所述的快速的超分辨显微成像装置还包括控制器，该控制器根据第二探测器采集的信号光强I₀(x,y)，计算第二光源对应的信号光强I₂(x,y)，并计算最终的效信号光强I(x,y)实现超分辨成像。

7.如权利要求6所述的快速的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第一光源和第二光源的光路上均设有起偏器和空间光调制器。

8.如权利要求7所述的快速的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第一光源的光路上空间光调制器的调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

9.如权利要求7所述的快速的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述第二光源的光路上空间光调制器的调制函数为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

10.如权利要求6所述的快速的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述的锁相探测模块包括用于对第一光源进行光束频率调制的参考信号发生装置，以及与根据参考信号发生装置发出的参考信号控制第一探测器采集的锁相放大器。