CN106124468A - 一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，包括：光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发的第二激光器，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光并具有阵列分布的亮斑和暗斑；成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。本发明还公开一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法。

Description

一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置

技术领域

本发明涉及光学超分辨显微领域，尤其涉及一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置。

背景技术

超分辨荧光显微成像作为一种具备纳米尺度成像能力的技术，在活细胞蛋白动力学领域有着不可替代的作用，是揭示生命基本活动现象和规律的重要手段。但目前的超分辨技术，受限于各种原理及技术因素，在活细胞超分辨成像方面，仍显不足。

目前，比较成功的超分辨荧光显微成像技术主要由以下几种：单分子荧光成像(PALM和STORM)，受激辐射损耗显微技术(STED)，结构光照明显微技术(SIM和SSIM)，荧光辐射微分超分辨显微技术(FED)。

STED技术是将一束空心光斑叠加在一个高斯光斑上，抑制了高斯光斑四周的荧光辐射，进而实现了超分辨成像，可以在小视场范围内得到较高的时间分辨率和空间分辨率，同时具有较高的成像深度，PALM和STORM采用随机光照明成像的方式结合光斑中心定位算法来实现超分辨成像。但他们的缺点也很明显：需要很强的激发光来照明样品。通常地球上的生物体受到的太阳辐射在0.1W/cm²，而STED和PALM/STORM通常需要的辐射在10³～10⁸W/cm²，在这种情况下，荧光蛋白/分子很容易被漂白，产生大量的自由基损伤活细胞样品。

另外，超分辨成像的核心在于ON-OFF，从这个角度来看，假设荧光光子数恒定，那么SIM成像的方法则是并行度最高的，最有效地利用荧光分子所发出的光子；也正因为并行度高，所以大大降低了其所需要的照明功率，在过去的几年里被证明成为活细胞超分辨率成像的利器。

但目前的SIM技术只能突破衍射极限两倍，以561nm激发光，NA＝1.49 物镜为例，其横向分辨率只能达到约100nm左右，仍显不足。SSIM虽然可以通过增大照明光功率的办法，将横向分辨率提升至100nm以内，但不可避免的带来了光漂白的问题，使其很难应用于活细胞超分辨成像领域。

因此，如何能够实现一种在不增加照明光功率的前提下，又可以达到100nm以内甚至更高的横向分辨率的结构光照明超分辨显微方法，将可以完美实现宽视场、超分辨、活细胞成像过程，具有重要的意义和应用价值。

发明内容

本发明提供了一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法及装置，可以同时兼顾宽视场、超分辨、活细胞成像等需求，且横向分辨率比传统SIM和SSIM更高，很好的服务于生物、医学等领域。

本发明的具体技术方案如下：

一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，包括：

光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器和用于荧光激发的第二激光器，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；

调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；

二向色镜，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光，所述网格状结构照明光具有阵列分布的亮斑和暗斑；

成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机。

其中，所述的选频切换模块为声光可调谐滤波器，光源模块在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过声光可调谐滤波器进行选频切换，以输出不同的激光光束。

优选的，所述的调制单元包括：位于光源模块出射光路上的第一二分之一波片和第一偏振分束立方体；位于第一偏振分束立方体透射光路上的第二二分之一波片和第二偏振分束立方体，所述第二偏振分束立方体出射 的第一p-偏振光和第一s-偏振光在所述二向色镜的表面产生水平干涉条纹；位于第一偏振分束立方体反射光路上的第三二分之一波片和第三偏振分束立方体，所述第三偏振分束立方体出射的第二p-偏振光和第二s-偏振光在所述二向色镜的表面产生垂直干涉条纹；所述的水平干涉条纹和垂直干涉条纹正交形成所述的网格状结构照明光。

进一步的，所述第一s-偏振光的光路上依次设置有第一四分之一波片和第一反射镜，穿过第一四分之一波片的第一s-偏振光由第一反射镜反射后再次通过第一四分之一波片形成第三p-偏振光；所述的第三p-偏振光和第一p-偏振光经第四偏振分束立方体光路重叠后在所述二向色镜的表面产生水平干涉条纹；所述第二p-偏振光的光路上设置有第四二分之一波片，由第四二分之一波片出射为第三s-偏振光；所述第二s-偏振光的光路上依次设置有第二四分之一波片和第五反射镜，穿过第二四分之一波片的第二s-偏振光经第五反射镜反射后再次通过第二四分之一波片形成第四p-偏振光；所述的第三s-偏振光和第四p-偏振光经第四偏振分束立方体光路重叠后在所述二向色镜的表面产生垂直干涉条纹。

优选的，所述的第一反射镜安装在第一压电陶瓷上，所述的第一压电陶瓷用于移动第一反射镜以改变干涉相位差；所述的第五反射镜安装在第二压电陶瓷上，所述的第二压电陶瓷用于移动第五反射镜以改变干涉相位差。本发明中，采用p-偏振和s-偏振光进行干涉产生网格状结构照明光，因此干涉调制对比度

作为优选的，所述的汇聚模块具有沿二向色镜发射光路依次布置的镜筒透镜、第一四面体棱镜和活动安装的第二四面体棱镜，以使得聚焦至显微物镜后焦面处的四个光斑的相对位置可以调节，另外，在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过伺服电机带动第二四面体棱镜在光轴向前后移动，保持不同波长光源形成的干涉网格重合。

为以保证从第二四面体棱镜射出的四束光的主轴均平行于z轴，优选的，所述第一四面体棱镜的楔角Φ为30度，所述第二四面体棱镜的楔角Φ为24度。

优选的，所述的汇聚模块由伺服电机驱动并可绕光轴旋转。

同时，利用上述的超分辨荧光显微装置，本发明还提供了一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法，具体步骤如下：

1)由第一激光器发出激活光，在二向色镜处形成网格状结构激活光，并通过汇聚模块和显微物镜投射到样品上并激活荧光蛋白；

2)由选频切换模块切换为第二激光器发出激发荧光，在二向色镜处形成网格状结构激活光，并光轴向移动第二四面体棱镜，使得通过汇聚模块和显微物镜投射到样品并形成与激活光相同的结构光照明，使激活的荧光蛋白发出的激发荧光，并采集荧光图像；

3)利用激发光对样品进行宽场照明，淬灭剩余的激活荧光蛋白，使得整个样品上的荧光蛋白全部进入暗态；

4)利用第一压电陶瓷和第二压电陶瓷改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像D_n(x)；

5)驱动汇聚模块旋转45°，并利用第一压电陶瓷和第二压电陶瓷改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像

6)根据被激活的荧光蛋白分布、激发光的数学模型以及所采集到的荧光图像构建线性方程，以此解出图像中重叠的频域分量；

7)对重叠的频域分量进行重叠，得到最终的重构图像。

在步骤2)中，激活的荧光蛋白分布为：

其中，I_act(x)是激活光的空间分布，A[I_act(x)]是处于x处的荧光分子被激活光激活的相对概率；为激活光的峰值强度，i为虚数，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激活光波矢，并有 λ_act为激活光波长，NA为显微物镜的数值孔径，为激活光相位；

在步骤3)中，激发光的数学模型为：

其中，I_exc(x)是激活光的空间分布，E[I_exc(x)]是处于x处的荧光分子被激发光激发的相对概率；为激活光的峰值强度，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激发光波矢，并有 λ_exc为激活光波长，为激发光相位；

在步骤6)中，所述的线性方程为：

$\tilde{D}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=\left[\begin{array}{c}\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{2{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\tilde{S}\left(\stackrel{\→}{k}\right)\\ +\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-2{\mathrm{\φ}}_n^{exc}}\end{array}\right]\·O^{\det }\left(\stackrel{\→}{k}\right)$

其中，为被测样品的空间频率，n＝1,2，为移频后的被测样品的空间频率，即该样品的超分辨信息；

在步骤7)中，得到的重构图像为：

${\tilde{D}}_{total}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=\tilde{S}\left(\stackrel{\→}{k}\right)\·\underset{n=-2}{\overset{2}{\Σ}}{C}_n{O}_{Abbe}^{\det }(\stackrel{\→}{k}+n{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})$

其中，为最终重构得到的超分辨图像，C_n为权重系数，为系统的各光学传递函数分量。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)在保持了结构光照明显微系统宽视场、低光毒性以及高信噪比的优点的前提下，进一步突破了现有结构光照明显微的分辨率极限，在生物活细胞成像方面的应用潜力更大；

(2)利用光激活荧光蛋白作为标记物，避免了之前饱和辐射结构光照明显微系统导致的光漂白问题；

(3)网格状结构光照明条纹，比现有SIM系统多一个维度的结构条纹，使得成像所需要的条纹方向改变次数少了一半，配合四面体棱镜结构，使得系统的响应速度极大的提升，提高了拍摄速度，更加适合生物活细胞成像。

附图说明

图1为基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置的示意图。

图2为光源模块的结构示意图。

图3是本发明中汇聚模块27的结构示意图。

图4为四面体棱镜前后相对运动的示意图。

图5为本发明中第一压电陶瓷25在垂直方向反射光路的示意图。

图6为本发明中第三反射镜18在垂直方向反射光路的示意图。

图7为本发明中由第二偏振分束立方体11为核心的垂直方向光束分路并汇聚的立体示意图。

图8位本发明中四面体棱镜示意图。

图9为基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置的工作流程图。

图10(a)为初始网格状结构光照明在29上的效果图。

图10(b)为旋转45°后网格状结构光照明在29上的效果图。

图11(a)为超分辨率靶图像。

图11(b)为宽场显微镜镜下得到的图像分辨率。

图11(c)为现有SIM系统得到的超分辨图像。

图11(d)为本发明专利所述系统得到的超分辨图像。

图12中的(a)、(b)和(c)图分别为宽场、现有SIM系统以及本发明专利的光学传递函数(OTF)示意图。

具体实施方式

如图1所示：一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，包括：

光源模块1，以及光源模块1光路依次布置的单模光纤2、准直透镜3、第一平面反射镜4和第二平面反射镜5；

调制单元包括第一二分之一波片6和第一偏振分束立方体7；位于第一偏振分束立方体7透射光路上的第二二分之一波片8、第二偏振分束立方体11、第一四分之一波片12、第一反射镜15、第一压电陶瓷25、第二 反射镜16、第三反射镜18和第四反射镜20；位于第一偏振分束立方体7反射光路上的第三二分之一波片9、第三偏振分束立方体10、第二四分之一波片13、第五反射镜14、第二压电陶瓷24、第六反射镜17、第七反射镜19、第八反射镜21、第四二分之一波片22和第四偏振分束立方体23；

第一二向色镜26，由调制单元出射的两组光束在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的结构散斑照明光，结构散斑照明光具有阵列间隔分布的亮斑；

成像单元，包含汇聚模块27、显微物镜29、成像透镜30和相机31；

以及上位机32，与相机31、第二压电陶瓷24和第一压电陶瓷25连接，用于压电陶瓷的触发和图像处理。

如图2所示，光源模块1包括用于光激活的第一激光器1(a)和用于荧光激发的第二激光器1(b)，由第九反射镜39、第十反射镜41以及第二二向色镜40将第一激光器1(a)和第二激光器1(b)发出的两束激光传播路径调整重叠，并由声光可调谐滤波器(AOTF)产生的声光衍射机制，进行选频，最后通过第十一反射镜44和第十二反射镜45，将出射光耦合进单模光纤2中。光源模块1在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过AOTF模块42进行选频切换，43位挡光板，用于遮挡0级衍射光。

如图3所示，汇聚模块27由镜筒透镜35结合第一四面体棱镜36和第二四面体棱镜37构成，以使得聚焦至显微物镜后焦面33处的四个光斑的相对位置可以调节。其中，镜筒透镜35为f＝200mm的消色差透镜，第一四面体棱镜36和第二四面体棱镜37的楔角分别为30°和24°，见图8中的φ，以保证从37射出的四束光的主轴均平行于z轴。

宽场照明单元主要由分光镜46和带电动旋转功能的反射镜47构成，如图1所示，在结构光照明时，47旋转至48所示虚线位置，宽场照明时，47回到图1所示位置。

如图4所示，上述的第一四面体棱镜36和第二四面体棱镜37，在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过伺服电机带动第二四面体棱镜37前后移动，以改变488nm干涉网格的间距，保证其与405nm干涉网格重合，以保证两束光在视场内形成一组空间不变的重叠网格，即： 且二者的相位也应当相等，有：式中。

例如，以显微物镜NA＝1.49的数值孔径，入瞳直径10mm为例，405nm激光的干涉条纹间距为Λ_act＝λ_act/2NA＝135.9nm，488nm的干涉条纹间距为Λ_exc＝λ_exc/2NA＝163.8nm，在使用不同光源对荧光蛋白进行激活/淬灭时，需要通过伺服电机带动第二四面体棱镜37前后移动L＝0.7/tan24°＝1.6mm，以改变405nm干涉网格的间距，保证其与488nm干涉网格重合，以保证两束光在视场内形成一组空间不变的重叠网格。

第六反射镜17所摆放位置应与x轴成44°角，第五反射镜14应与z轴成1°角，以保证由第三偏振分束立方体10分出的两束光左右对称；第一反射镜15和第二反射镜16应与y轴成±1°角，以保证由第二偏振分束立方体11分出的两束光上下对称；四束光与其中心轴各成1°角的方式传输并汇聚至第一二向色镜26处。

第四反射镜20为D型反射镜，并以上下方式放置，以保证经第三反射镜18反射的光束不被遮挡，同时有效的将经第一反射镜15反射出的光束反射至第一二向色镜26处；第八反射镜21为D型反射镜，并以左右方式放置，以保证经第七反射镜19反射的光束不被遮挡，同时有效的将经第五反射镜14反射出的光束反射至第一二向色镜26处。

在本实施案例中，采用p-偏振和s-偏振光进行干涉产生网格状结构照明光，因此干涉调制对比度

在本实施案例中，第一二分之一波片6、第二二分之一波片8、第三二分之一波片9的快轴必须与入射偏振光成22.5°夹角，以使得出射的偏振光与水平面成45°角；第一四分之一波片12、第二四分之一波片13的快轴必须与入射的s-偏振光成22.5°夹角，以使得出射的偏振光变成p-偏振。

第五反射镜14应倾斜放置，并与y-z面成一定夹角，第六反射镜17应与45°面成一定夹角，且二者倾斜角度应相等，第七反射镜19和第八反射镜21应成45°角，以使得两束光在汇聚的过程中光程保持相等。

第一反射镜15应倾斜放置，并与z-x面成一定角度，第二反射镜16应与z-x面成大小相同但方向相反的倾斜角度，第三反射镜18和第四反射镜20应按45°角放置，以使得两束光在汇聚的过程中光程保持相等。

第三偏振分束立方体10和第二偏振分束立方体11以及相应的反射镜、波片构成的子分束系统必须相对于第一偏振分束立方体7和第四偏振分束立方体23的连线对称分布于两侧，以保证四束光的光程相等。

第五反射镜14、第一反射镜15应分别固定在第二压电陶瓷24、第一压电陶瓷25上，以保证系统可以由压电陶瓷的步进移动产生干涉相位的改变。

汇聚模块27的前焦面与入瞳28重合，以保证四束偏振光经过显微物镜29后，以平行光的方式在成像透镜30表面汇聚，并干涉产生网格状结构照明。

上述的超分辨荧光显微装置的具体操作过程如下：

光源模块1出射光经过单模光纤2传输至准直透镜3的焦点处，形成准直光束，通过第一平面反射镜4、第二平面反射镜5反射后，进入第一第一二分之一波片6形成与水平面夹角45°偏振光束，经由第一偏振分束立方体7分成p-偏振和s-偏振两束平行光；

p-偏振光通过第二二分之一波片8生成与水平面夹角45°偏振光束，经由第二偏振分束立方体11分为两束p-偏振和s-偏振两束平行光；

s-偏振光通过第三二分之一波片9生成与水平面夹角45°偏振光束，经由第三偏振分束立方体10分为两束p-偏振和s-偏振两束平行光；

如图5、图6和图7所示，由第二偏振分束立方体11产生的s-偏振光经由第一反射镜15两次通过第一四分之一波片12，进而变成p-偏振光，再透射通过第二偏振分束立方体11，到达第四反射镜20处，再由第四反射镜20反射并透射通过第四偏振分束立方体23，直至第一二向色镜26表面；

由第二偏振分束立方体11产生的p-偏振光经由第二反射镜16、第三反射镜18反射，透射通过第四偏振分束立方体23，到达第一二向色镜26表面，两束光在第一二向色镜26表面产生水平干涉条纹；

由第三偏振分束立方体10产生的s-偏振光经由第五反射镜14两次通过第二四分之一波片13，进而变成p-偏振光，再透射通过第三偏振分束立方体10，到达第八反射镜21处，再由第八反射镜21反射至第四二分之一波片22；

由第三偏振分束立方体10产生的p-偏振光经由第六反射镜17、第七反射镜19反射，到达第四二分之一波片22，两束光通过第四二分之一波片22后，变成s-偏振光，再通过第四偏振分束立方体23的反射至第一二向色镜26处，并在第一二向色镜26表面产生垂直干涉条纹；进而在第一二向色镜26表面产生一幅二维正交的网格状结构照明光；

样品受激辐射的荧光通过汇聚模块27、第一二向色镜26以及成像透镜30构成的显微镜系统成像到相机31上；通过第二压电陶瓷24、第一压电陶瓷25分别带动第五反射镜14、第一反射镜15移动，改变干涉相位差，实现不同相位的结构光照明，每次照明，相机31都将记录一张宽场低分辨率图像，并由上位机32记录并保存，通过相应的图像重构算法，实现宽场超分辨图像。

如图9所示，整个超分辨显微图像采集及图像重构如下：

(1)利用具有光激活性质的荧光蛋白Skylan-NS将被测细胞进行染色后，放置在载物台上，通过1.0W/cm²的λ_act＝405nm激光激活，并由λ_exc＝488nm，功率100W/cm²的激光淬灭，淬灭过程，便是SCOMS收集荧光信号的过程。

(2)利用声光可调谐滤波器(AOTF)进行选频，使能405nm激活光；

(3)利用上述系统在第一二向色镜26处先产生一幅网格状激活光，通过汇聚模块27和显微物镜29构成的成像系统将其映射至样品上，激活荧光蛋白，如图10(a)所示，被激活的荧光蛋白分布为：

展开有：

其中，I_act(x)是激活光的空间分布，A[I_act(x)]是处于x处的荧光分子被激活光激活的相对概率；为激活光的峰值强度，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激活光波矢，并有λ_act为激活光波长，NA为显微物镜的数值孔径，为激活光相位；

(4)将100W/cm²的488nm激发光以同样的网格间距照射在激活后的荧光蛋白处，读取激活的荧光蛋白发出的激发荧光，读取时间为1ms，并用SCMOS记录荧光图像D₁(x)，其激发光的数学模型为：

展开有：

其中，I_exc(x)是激活光的空间分布，E[I_exc(x)]是处于x处的荧光分子被激发光激发的相对概率；为激活光的峰值强度，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激发光波矢，并有 λ_exc为激活光波长，为激发光相位；

(5)反射镜由图1中48所示虚线位置，由电机控制旋转45°，到达图1所示47所示实线位置，此时，系统变成宽场488nm均匀照明光对样品进行照明，淬灭剩余的激活荧光蛋白，使得整个样品上的荧光蛋白全部进入暗态；

(6)通过第二压电陶瓷24、第一压电陶瓷25的一次步进Δ＝nλ_act/5，改变网格状结构光的相位n＝-2,-1,0,1,2；

(7)重复(1)-(5)的过程，获得不同相位下的多幅荧光图像D_n(x)，其对应的频域图像由傅里叶变换得到，记为

(8)伺服电机38带动汇聚模块27整体绕z轴旋转45°，使网格状结构照明光产生相应的45°旋转，如图10(b)所示；

(9)重复(1)-(5)的过程，获得不同相位下的多幅荧光图像

(10)在傅里叶域，整个系统的采集过程可用如下数学公式表述：

$\tilde{D}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=FT\{A\[I_{act}\left(x\right)\]\·E\[I_{exc}\left(x\right)\]\}\·O_{\det }\left(\stackrel{\→}{k}\right)$

其中，为拍摄到的频域图像，为被测样品频域分布函数，FT{}为傅里叶变换；代入过程(3)和(4)中的结构光数学模型，所采集到的序列图像可以构成如下线性方程：

$\tilde{D}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=\left[\begin{array}{c}\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{2{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\tilde{S}\left(\stackrel{\→}{k}\right)\\ +\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-2{\mathrm{\φ}}_n^{exc}}\end{array}\right]\·O^{\det }\left(\stackrel{\→}{k}\right)$

其中，其中，为被测样品的空间频率，n＝1,2，为移频后的被测样品的空间频率，即该样品的超分辨信息；重叠的频率部分 可以通过n＝-2,-1,0,1,2构成的线性方程组来逐一解出；

由上式可以看出，与现有SIM相比，本发明除了具备现有SIM方法中的基频和一倍频(即：超分辨信息)外，还额外增加了2倍频成分(即：更高的超分辨信息)，因此最终图像重构后的分辨率将明显优于现有SIM系统；

(11)将这些原本重叠的频域分量进行重叠，最终得到的重构图像为：

其中，为最终重构得到的超分辨图像，C_n为权重系数，为系统的各光学传递函数分量。

其中，C_n是比例系数，根据实际经验，一般有：C₀＝1，C_±1＝0.495，C_±2＝0.14，总OTF可以表达为：如图12中的(a)、(b)和(c)图所示，可以看出，本发明显微系统的OTF明显大于现有SIM系统，因而可以收集到更多的高频成分，从而实现更高的图像分 辨率。

为显示本实施案例的最终效果，采用图11(a)为原始分辨率靶，将该目标放置在载物台上，重复(1)-(11)的超分辨信息采集及图像重构过程，最后生成超分辨图像及其与宽场显微镜以及现有SIM显微镜所获得图像的对比实验，分别如图11(b)、11(c)以及11(d)所示，可以看出，本发明的超分辨荧光显微方法及装置，在没有使用很高的激发光强的前提下，依然可以实现优于现有SIM方法的图像分辨率。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微装置，其特征在于，包括：

光源模块，具有用于荧光激活的第一激光器(1(a))和用于荧光激发的第二激光器(1(b))，以及用于在两激光器之间切换的选频切换模块；

调制单元，将光源模块输出的光束调制为可发生干涉的两束p偏振光和两束s偏振光，并用于改变两组光束的干涉相位差；

二向色镜(26)，两束p偏振光和两束s偏振光在其表面形成干涉条纹，并由其反射作为照射样品的网格状结构照明光，所述网格状结构照明光具有阵列分布的亮斑和暗斑；

成像单元，包括用于改变干涉条纹间距的汇聚模块(27)，将所述汇聚模块出射的光束投影到样品的显微物镜(29)，以及用于对样品受激辐射荧光成像的相机(31)。

2.如权利要求1所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的选频切换模块为声光可调谐滤波器。

3.如权利要求1所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的调制单元包括：

位于光源模块出射光路上的第一二分之一波片(6)和第一偏振分束立方体(7)；

位于第一偏振分束立方体(7)透射光路上的第二二分之一波片(8)和第二偏振分束立方体(11)，所述第二偏振分束立方体(11)出射的第一p-偏振光和第一s-偏振光在所述二向色镜(26)的表面产生水平干涉条纹；

位于第一偏振分束立方体(7)反射光路上的第三二分之一波片(9)和第三偏振分束立方体(10)，所述第三偏振分束立方体(10)出射的第二p-偏振光和第二s-偏振光在所述二向色镜(26)的表面产生垂直干涉条纹；

所述的水平干涉条纹和垂直干涉条纹正交形成所述的网格状结构照明光。

4.如权利要求3所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述第一s-偏振光的光路上依次设置有第一四分之一波片(12)和第一反射镜(15)，穿过第一四分之一波片(12)的第一s-偏振光由第一反射镜(15)反射后再次通过第一四分之一波片(12)形成第三p-偏振光；

所述的第三p-偏振光和第一p-偏振光经第四偏振分束立方体(23)光路重叠后在所述二向色镜(26)的表面产生水平干涉条纹；

所述第二p-偏振光的光路上设置有第四二分之一波片(22)，由第四二分之一波片(22)出射为第三s-偏振光；

所述第二s-偏振光的光路上依次设置有第二四分之一波片(13)和第五反射镜(14)，穿过第二四分之一波片(13)的第二s-偏振光经第五反射镜(14)反射后再次通过第二四分之一波片(13)形成第四p-偏振光；

所述的第三s-偏振光和第四p-偏振光经第四偏振分束立方体(23)光路重叠后在所述二向色镜(26)的表面产生垂直干涉条纹。

5.如权利要求4所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的第一反射镜(15)安装在第一压电陶瓷(25)上，所述的第一压电陶瓷(25)用于移动第一反射镜(15)以改变干涉相位差；

所述的第五反射镜(14)安装在第二压电陶瓷(24)上，所述的第二压电陶瓷(24)用于移动第五反射镜(14)以改变干涉相位差。

6.如权利要求1或5所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的汇聚模块(27)具有沿二向色镜(26)发射光路依次布置的镜筒透镜(35)、第一四面体棱镜(36)和活动安装的第二四面体棱镜(37)。

7.如权利要求6所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述第一四面体棱镜(36)的楔角为30度，所述第二四面体棱镜(37)的楔角为24度。

8.如权利要求7所述的超分辨荧光显微装置，其特征在于，所述的汇聚模块(27)由伺服电机驱动并可绕光轴旋转。

9.一种基于光激活及结构光照明的超分辨荧光显微方法，其特征在于，利用如权利要求8所述的超分辨荧光显微装置实现，具体步骤如下：

1)由第一激光器(1(a))发出激活光，在二向色镜(26)处形成网格状结构激活光，并通过汇聚模块(27)和显微物镜(29)投射到样品上并激活荧光蛋白；

2)由选频切换模块切换为第二激光器(1(b))发出激发荧光，在二向色镜(26)处形成网格状结构激活光，并光轴向移动第二四面体棱镜(37)，使得通过汇聚模块(27)和显微物镜(29)投射到样品并形成与激活光相同的结构光照明，使激活的荧光蛋白发出的激发荧光，并采集荧光图像；

3)利用激发光对样品进行宽场照明，淬灭剩余的激活荧光蛋白，使得整个样品上的荧光蛋白全部进入暗态；

4)利用第一压电陶瓷(25)和第二压电陶瓷(24)改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像D_n(x)；

5)驱动汇聚模块(27)旋转45°，并利用第一压电陶瓷(25)和第二压电陶瓷(24)改变网格状结构照明光的相位，重复步骤1)～步骤3)得到不同相位下的多幅荧光图像

6)根据被激活的荧光蛋白分布、激发光的数学模型以及所采集到的荧光图像构建线性方程，以此解出图像中重叠的频域分量；

7)对重叠的频域分量进行重叠，得到最终的重构图像。

10.如权利要求9所述的超分辨荧光显微方法，其特征在于，激活的荧光蛋白分布为：

其中，I_act(x)是激活光的空间分布，A[I_act(x)]是处于x处的荧光分子被激活光激活的相对概率；为激活光的峰值强度，i为虚数，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激活光波矢，并有λ_act为激活光波长，NA为显微物镜的数值孔径，为激活光相位；

激发光的数学模型为：

其中，I_exc(x)是激活光的空间分布，E[I_exc(x)]是处于x处的荧光分子被激发光激发的相对概率；为激活光的峰值强度，为干涉对比度，或称之为调制深度， 为激发光波矢，并有λ_exc为激活光波长，为激发光相位；

所述的系统采集过程数学公式为：

$\tilde{D}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=FT\{A\[I_{act}\left(x\right)\]\·E\[I_{exc}\left(x\right)\]\}\·O_{\det }\left(\stackrel{\→}{k}\right)$

其中，为拍摄到的频域图像，为系统的光学传递函数，FT{}为傅里叶变换；

所述的线性方程为：

$\tilde{D}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=\left[\begin{array}{c}\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{2{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}-{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\tilde{S}\left(\stackrel{\→}{k}\right)\\ +\frac{2}{3}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-{\mathrm{i\φ}}_n^{exc}}+\frac{1}{6}\tilde{S}(\stackrel{\→}{k}+2{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})e^{-2{\mathrm{\φ}}_n^{exc}}\end{array}\right]\·O^{\det }\left(\stackrel{\→}{k}\right)$

其中，为被测样品的空间频率，为移频后的被测样品的空间频率，即该样品的超分辨信息，通过n＝-2,-1,0,1,2构成的线性方程组来逐一解出；

得到的重构图像为：

${\tilde{D}}_{total}\left(\stackrel{\→}{k}\right)=\tilde{S}\left(\stackrel{\→}{k}\right)\·\underset{n=-2}{\overset{2}{\Σ}}{C}_n{O}^{\det }(\stackrel{\→}{k}+n{\stackrel{\→}{k}}_{Abbe}^{exc})$

其中，为最终重构得到的超分辨图像，C_n为权重系数，为系统的各光学传递函数分量。