CN108107034A - 基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法 - Google Patents

基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法 Download PDF

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Abstract

基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法，解决了现有技术中结构光超分辨荧光显微技术依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤，而拉曼超分辨显微成像技术又基于近场扫描的方式实现，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像的技术问题。本发明的成像系统包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置。该成像系统将结构光超分辨荧光显微技术与拉曼超分辨显微成像技术相结合，实现非标记的、全貌性的、快速超分辨成像，能用于细胞膜、人工磷脂膜、人工纳米孔、内吞/转运单个分子及颗粒体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程、纳米细胞相互作用及生物效应等研究方向。

Description

基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法
技术领域
本发明属于微观粒子超分辨成像技术领域，具体涉及一种基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法。
背景技术
在生命科学领域中，围绕活体细胞的超分辨成像一直是仪器开发的热点。近年来，几种远场荧光超分辨显微镜的出现，突破了光学衍射极限，成功地实现了生物样品的超分辨成像。其中，结构光超分辨荧光显微技术(SIM)对样品标记的要求较低，成像速度较快，可以实现活体细胞的超分辨成像。但由于其仍然依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤。
物质的拉曼散射信息具有“指纹特性”，基于拉曼散射的拉曼超分辨显微成像技术是一种非标记的物质分析方法。拉曼成像技术可对生物样品进行非标记的特异性成像，且能够避免水溶液的干扰，表面增强拉曼技术则可解决拉曼散射信号过于微弱的问题，实现快速成像，可对活体细胞进行实时分析。然而现有的拉曼超分辨显微成像技术多是基于近场扫描的方式实现的，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像。
有鉴于此，亟需提供一种特异性强、稳定性好，能够实现非标记的、全貌性的、快速的、超分辨的成像系统。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中结构光超分辨荧光显微技术依赖于荧光标记，特异性较差，长时间观察样品易发生荧光漂白和光损伤，而拉曼超分辨显微成像技术又基于近场扫描的方式实现的，稳定性较差，无法对样品进行全貌性快速成像的技术问题，提供一种基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下：
基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；
所述结构光发生装置包括激光器、激发滤光片、扩束镜组、PBS分束器、半波片、铁电液晶、偏振态调制组件、第一聚焦镜和掩模板；
激光器发出单色激发光，依次经激发滤光片滤光，扩束镜组扩束后，进入PBS分束器分束，S方向的偏振光经过半波片到达铁电液晶，经铁电液晶调制获得具有不同照明方向的衍射光，衍射光经半波片被调制为P方向的偏振光，透射光经过PBS分束器达到偏振态调制组件，经过偏振态调制组件调制为每个照明方向下光的偏振方向都垂直于光束所在的平面，调制后的光束经过第一聚焦镜会聚在掩模板处，生成±1级两束相干光；
所述拉曼散射信号激发装置包括准直镜、第二聚焦镜、长通短反二向色镜、物镜和伴有表面增强拉曼基底的样品；
掩模板生成的±1级两束相干光经准直镜准直后，在一次像面处发生干涉，然后经第二聚焦镜聚焦后到达长通短反二向色镜，反射后进入物镜，在伴有表面增强拉曼基底的样品处激发出的拉曼散射信号，拉曼散射信号经物镜透射后经过长通短反二向色镜，滤掉返回光路中的激发光以及瑞利散射光，得到无干扰的增强型拉曼散射信号；
所述一次性拉曼成像装置包括发射滤光片、反射镜、管镜、搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮和EMCCD，所述搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮的每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；
无干扰的增强型拉曼散射信号进入发射滤光片滤光后，经反射镜和管镜到达搭载不同中心波长的带通滤光片的电动转轮，通过依次调节不同中心波长的带通滤光片置于光传播路径中，依次将收集到的增强型拉曼散射信号按不同的拉曼峰值分别成像于EMCCD处，实现待成像样品中每种组分的单独成像。
进一步的，所述激光器为波长532nm的单纵模激光器。
进一步的，所述铁电液晶控制像素，实现三个不同照明方向0°、60°和120°，每个照明方向下三个不同相位0π、π/3和2π/3的结构光照明。
进一步的，所述偏振态调制组件由高速电光调制器和四分之一波片组成。
进一步的，还包括平面镜，调制后的光束经过平面镜折转进入第一聚焦镜。
进一步的，采用粒径为100nm的银溶胶作为表面增强拉曼基底。
含有上述基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的超分辨显微成像方法，步骤如下：
步骤一、采用高分辨率的单色仪在表面增强拉曼基底作用条件下，对待成像样品中的每种组分的拉曼标准谱进行标定；
步骤二、组装具有不同中心波长的带通滤光片的电动转轮，每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；
步骤三、依次搭建结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；
步骤四、旋转具有不同中心波长的带通滤光片的电动转轮，分别使不同中心波长的带通滤光片置于光传输路径上，完成样品中的每种组分的单独成像。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统将结构光超分辨技术与拉曼显微技术相结合，结构简单、稳定，样品中不同目标组分可通过与其相对应的带通滤光片位置的确定，实现各自的非标记的、全貌性的、快速超分辨成像。
本发明的成像方法，采用单色结构光激发样品，获得带有结构光信息的拉曼散射信号，实现非标记的远场超分辨成像，对样品中各组分一次性单独成像，进而实现具有高稳定性的快速超分辨拉曼成像，以银溶胶作为增强基底，获取增强型拉曼散射信号，实现高灵敏度的快速超分辨拉曼成像。
本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统及成像方法可以实现亚衍射极限的超分辨成像，它对样品制备的要求较低，成像速度快，较适用于活体细胞的观察研究，能用于细胞膜、人工磷脂膜、人工纳米孔、内吞单个分子及颗粒的体系、转运单个分子及颗粒的体系、病毒进入细胞机理、活细胞内分子的动态过程、纳米细胞相互作用及生物效应等研究方向。
附图说明
图1为本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的结构光发生装置的光路示意图；
图2为本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的拉曼信号激发装置的光路示意图；
图3为本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的一次性拉曼成像装置的光路示意图；
图4为本发明提供的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮的结构示意图；
图5为用光学设计软件Zemax模拟的本发明的超分辨显微成像系统的整体光路的平面图；
图6为在一次像面处获得的干涉条纹；
图中，1、激光器，2、激发滤光片，3、扩束镜组，4、PBS分束器，5、半波片，6、铁电液晶，7、偏振态调制组件，8、第一聚焦镜，9、掩模板，10、准直镜，11、一次像面，12、第二聚焦镜，13、长通短反二向色镜，14、物镜，15、伴有表面增强拉曼基底的样品，16、发射滤光片，17、反射镜，18、管镜，19、搭载不同中心波长的带通滤光片的电动转轮，20、EMCCD。
具体实施方式
下面结合附图1～6对本发明作进一步详细说明。
如图5所示，基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置。
其中，如图1所示，结构光发生装置包括激光器1、激发滤光片2、扩束镜组3、PBS分束器4、半波片5、铁电液晶6、偏振态调制组件7、第一聚焦镜8和掩模板9。激光器1发出单色激发光，依次经激发滤光片2滤光，扩束镜组3扩束后，进入PBS分束器4分束，S方向的偏振光经过半波片5到达铁电液晶6，经铁电液晶6调制获得具有不同照明方向衍射光，衍射光经半波片5被调制为P方向的偏振光，透射光经过PBS分束器4达到偏振态调制组件7，经过偏振态调制组件7调制使光束的偏振方向垂直于光束所在的平面，调制后的光束经过第一聚焦镜8会聚在掩模板9处，掩模板9可视为一个空间滤波器，仅保留照明所需的±1级两束相干光。
结构光发生装置中，为了获得样品较高精度的拉曼峰值，选择波长为532nm的单纵模激光器作为激发光源；通过对铁电液晶6像素的控制，实现三个不同照明方向(0°、60°、120°)，每个照明方向下三个不同相位(0π、π/3、2π/3)的结构光照明；偏振态调制组件7由高速电光调制器和四分之一波片组成，使每一个照明方向下光的偏振方向都垂直于光束所在的平面，以获得样品处对比度较高的干涉条纹。为了使得整体光路看起来更加紧凑，结构光发生装置中，还可以包括平面镜21，调制后的光束经过平面镜21折转进入第一聚焦镜8。
如图2所示，拉曼散射信号激发装置包括准直镜10、第二聚焦镜12、长通短反二向色镜13、物镜14、伴有表面增强拉曼基底的样品15。掩模板9生成的±1级两束相干光，经准直镜10准直后，在一次像面11处发生干涉，然后经第二聚焦镜12聚焦后到达长通短反二向色镜13，反射后进入物镜14，在伴有表面增强拉曼基底的样品15处激发出拉曼散射信号，拉曼散射信号经物镜14透射后经过长通短反二向色镜13，滤掉返回光路中的激发光以及瑞利散射光，得到无干扰的增强型拉曼散射信号。
拉曼散射信号激发装置中，为了获取较好的生物兼容性和较高的拉曼散射增强效应，采用粒径为100nm的银溶胶作为表面增强拉曼基底。用CCD相机在一次像面11处探测成像，可获得图6所示的干涉条纹。
如图3所示，一次性拉曼成像装置包括发射滤光片16、反射镜17、管镜18、搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮19和EMCCD 20，搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮19，每个中心波长的带通滤光片允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过，如图4所示，为a～f六个不同中心波长的带通滤光片，即对应着待成像样品中的六种不同组分的拉曼峰值的通过。无干扰的增强型拉曼散射信号进入发射滤光片16滤光后，经反射镜17和管镜18到达搭载不同中心波长的带通滤光片的电动转轮19，通过依次调节不同中心波长的带通滤光片置于光传播路径中，依次将收集到的增强型拉曼散射信号按不同的拉曼峰值分别成像于EMCCD 20处，实现待成像样品中每种组分的单独成像。
含有上述基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的超分辨显微成像方法，步骤如下：
步骤一、采用高光谱分辨率的单色仪在表面增强拉曼基底作用条件下，对待成像样品中的每种组分的拉曼标准谱进行标定；
步骤二、组装具有不同中心波长带通滤光片的电动转轮，每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；
步骤三、依次搭建结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；
步骤四、旋转电动转轮分别使不同中心波长的带通滤光片置于光传输路径中，完成样品中的每种组分的单独成像。

Claims (7)

1.基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，包括结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；
所述结构光发生装置包括激光器(1)、激发滤光片(2)、扩束镜组(3)、PBS分束器(4)、半波片(5)、铁电液晶(6)、偏振态调制组件(7)、第一聚焦镜(8)和掩模板(9)；
激光器(1)发出单色激发光，依次经激发滤光片(2)滤光，扩束镜组(3)扩束后，进入PBS分束器(4)分束，S方向的偏振光经过半波片(5)到达铁电液晶(6)，经铁电液晶(6)调制获得具有不同照明方向的衍射光，衍射光经半波片(5)被调制为P方向的偏振光，透射光经过PBS分束器(4)达到偏振态调制组件(7)，经过偏振态调制组件(7)调制为每个照明方向下光的偏振方向都垂直于光束所在的平面，调制后的光束经过第一聚焦镜(8)会聚在掩模板(9)处，生成±1级两束相干光；
所述拉曼散射信号激发装置包括准直镜(10)、第二聚焦镜(12)、长通短反二向色镜(13)、物镜(14)和伴有表面增强拉曼基底的样品(15)；
掩模板(9)生成的±1级两束相干光经准直镜(10)准直后，在一次像面(11)处发生干涉，然后经第二聚焦镜(12)聚焦后到达长通短反二向色镜(13)，反射后进入物镜(14)，在伴有表面增强拉曼基底的样品(15)处激发出的拉曼散射信号，拉曼散射信号经物镜(14)透射后经过长通短反二向色镜(13)，滤掉返回光路中的激发光以及瑞利散射光，得到无干扰的增强型拉曼散射信号；
所述一次性拉曼成像装置包括发射滤光片(16)、反射镜(17)、管镜(18)、搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮(19)和EMCCD(20)，所述搭载不同中心波长带通滤光片的电动转轮(19)的每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；
无干扰的增强型拉曼散射信号进入发射滤光片(16)滤光后，经反射镜(17)和管镜(18)到达搭载不同中心波长的带通滤光片的电动转轮(19)，通过依次调节不同中心波长的带通滤光片置于光传播路径中，依次将收集到的增强型拉曼散射信号按不同的拉曼峰值分别成像于EMCCD(20)处，实现待成像样品中每种组分的单独成像。
2.根据权利要求1所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，所述激光器(1)为波长532nm的单纵模激光器。
3.根据权利要求1所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，所述铁电液晶(6)控制像素，实现三个不同照明方向0°、60°和120°，每个照明方向下三个不同相位0π、π/3和2π/3的结构光照明。
4.根据权利要求1所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，所述偏振态调制组件(7)由高速电光调制器和四分之一波片组成。
5.根据权利要求1所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，还包括平面镜(21)，调制后的光束经过平面镜(21)折转进入第一聚焦镜(8)。
6.根据权利要求1所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统，其特征在于，采用粒径为100nm的银溶胶作为表面增强拉曼基底。
7.含有权利要求1～6任何一项所述的基于结构光照明的拉曼超分辨显微成像系统的超分辨显微成像方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、采用高分辨率的单色仪在表面增强拉曼基底作用条件下，对待成像样品中的每种组分的拉曼标准谱进行标定；
步骤二、组装具有不同中心波长的带通滤光片的电动转轮(19)，每个中心波长的带通滤光片分别允许待成像样品中一个组分的拉曼峰值通过；
步骤三、依次搭建结构光发生装置、拉曼信号激发装置和一次性拉曼成像装置；
步骤四、旋转具有不同中心波长的带通滤光片的电动转轮(19)，分别使不同中心波长的带通滤光片置于光传输路径上，完成样品中的每种组分的单独成像。
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