CN114813695A - 基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统、方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，实现同时获取拉曼散射光谱和相位的成像方法以及该系统在单细胞生化表征的应用。通过共聚焦拉曼光谱仪光路上有机融合相位成像的干涉光路，可以同时且同位获取单细胞增强的拉曼特征谱和折射率所代表的双模态信息，能够从分子成分的角度解析细胞在不同生化过程中不同物质的类别，浓度以及空间的分布，实现单独分别使用这两种技术所不能实现的功能，是一种快速，无损，无标记的多维信息获取方法，对揭示细胞的生命活动机理具有重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及光学测量领域，具体涉及一种光谱和光学相位同时同位测量的方法和系统。
背景技术
生命科学的快速发展，尤其是单细胞的生化过程信息的表征与获取，对多模态功能光学仪器和方法提出了迫切的需求。定量相位成像技术对细胞分化过程的相位(折射率)成像取得了富有成效的成果，为细胞的生化过程提供了实时动态的细胞形貌，大小，高度等信息。另一方面，拉曼散射光谱成像技术能够对细胞微量的生化物质进行特异性识别，从另一个维度提供了细胞生化过程的物质变化及空间分布信息。然而，单独使用或者联合起来先后使用这两种技术获得的信息，对于理解复杂的细胞生化过程，都是远远不够的，因此，多维度生物信息，特别是在同一空间和时间上获取的多模态生物信息，可以展示细胞物质的转化过程及空间分布，揭示更深层次的细胞生化机理。有鉴于此，本发明提供一种拉曼散射光谱与定量相位有机融合的双模态成像系统、方法以及在单细胞物质成分的时间、空间分布测量的应用。
发明内容
本发明为了解决识别单细胞体内不同物质成分以及物质成分的类别，浓度和分布问题，提供了一种拉曼散射光谱/定量相位成像双模态系统，方法和应用。其中包括将拉曼信号进行增强，同时且同位地获取拉曼光谱和相位成像的双模态信号，实现两种信号的时间和空间精确匹配，进而解析出单模态信号无法解析的信息。
一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，包括一个配置激光器的共聚焦拉曼光谱仪；一个设置在所述共聚焦拉曼光谱仪输出端激发光路上的半反半透镜，用于将激发光分成两部分，其中反射部分输入拉曼散射光谱成像系统，用于激发和收集拉曼信号，透射部分用于形成相位成像的参考光；设置在所述拉曼散射光谱成像系统焦平面处的载玻片系统，用于承载细胞样品并增强细胞样品的拉曼散射信号；设置在所述载玻片系统后方的相位成像系统，将透过载玻片系统的物光输入合束器，所述合束器将所述参考光和所述物光进行合束干涉形成干涉图，并将干涉光输入图像传感器，收集干涉图用于后期计算形成定量相位分布图；所述拉曼散射光谱/定量相位双模态成像系统，还包括由计算机组成的控制采集系统，用于控制所述拉曼散射光谱成像系统和所述相位成像系统同时进行数据采集与计算。
由于经过所述载玻片系统反射的拉曼信号和经过所述载玻片系统透射的物光信号都来自于细胞的同一位置，因此，所获得的光谱空间分布和相位空间分布是一一对应的，大大降低了将两种模态的信号进行空间匹配的难度，甚至无需进行匹配。同时，这两种模态的信号是在同一时间上获取的，时间维度上的精准匹配，可以更准确地解析细胞不同阶段的生理机理。
优选地，所述载玻片系统是一个亚波长周期的金属光栅或者金属超表面，用于将所述的金属光栅表面或所述金属超表面附近的电场进行增强，进而增强细胞样品的拉曼信号，同时一部分携带了待测细胞相位的光透射所述金属光栅，形成物光。
优选地，所述拉曼散射光谱成像系统和所述相位成像系统使用放大倍率相同的物镜。
优选地，所述激光器是一个单纵模单横模线偏振激光器。
一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像方法，包括如下步骤：
1.搭建共聚焦拉曼显微成像系统；
2.在所述共聚焦拉曼显微成像系统的激发光路上加入半反半透元件，将反射部分的光作为定量相位成像系统的物光，与所述共聚焦拉曼显微成像系统的激发光路重合形成重合光路；将透射部分的光作为定量相位成像系统的参考光；
3.在所述重合光路上加入载玻片系统，使得透过细胞并携带细胞相位信息的物光可以透过所述载玻片系统，同时，将被激发的细胞的拉曼信号反射，进入所述共聚焦显微拉曼光谱仪进行光谱测量或者光谱成像；
4.使用合束元件，将所述物光与所述参考光合并，形成干涉图；
5.使用计算机控制双模态系统同时采集拉曼散射光谱和干涉图，形成拉曼光谱的空间分布图，同时对所述干涉图使用相位恢复算法，获得相位的空间分布图。至此，获得细胞同一时间和同一空间上的拉曼光谱成像和相位成像。
优选地，步骤3所述的载玻片系统可以是亚波长周期的金属光栅或者金属超表面，用于增强细胞样品的拉曼信号，同时透射携带了待测细胞相位的物光。
一种应用所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统同时且同位测量细胞的成分和形貌(折射率)分布的方法，包括如下步骤：
1.搭建所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统；
2.将细胞连同培养液滴加在所述载玻片系统上，或将所述载玻片系统放置在透明细胞培养皿底部，然后调整所述光谱成像物镜和所述相位成像物镜，使细胞能够清晰成像；
3.使用计算机控制双模态系统同时采集拉曼散射光谱和干涉图，形成拉曼光谱的空间分布图，同时使用相位恢复算法，获得相位的空间分布图。至此，获得细胞同一时间和同一空间上的相位成像和拉曼光谱成像；
4.利用相位空间分布，获取折射率，细胞形貌，细胞大小等参数，结合拉曼光谱空间分布代表的成分空间分布，利用这两种不同维度的信息，来分析细胞的生理机理。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本发明实施例所述的拉曼散射光谱/定量相位双模态成像系统。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。
本申请实施例中的术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。本申请的描述中，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列部件或单元的系统、产品或设备没有限定于已列出的部件或单元，而是可选地还包括没有列出的部件或单元，或可选地还包括对于这些产品或设备固有的其它部件或单元。本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
实施例1
本发明实施例提供一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，如图1所示。所述双模态成像系统使用一个单横模单纵模激光器101为光源，作为激发光用于激发拉曼散射和定量相位测量。所述光源发出的激光通过共聚焦拉曼光谱仪102后通过分束镜103的反射光路进入显微成像系统104作为拉曼信号的激发光路。同时所述显微成像系统104作为拉曼信号收集光路，用于收集拉曼信号形成拉曼光谱成像系统。所述显微成像系统设置有一个三维微位移台作为载物台，用于固定载玻片系统105。所述载玻片系统105由亚波长金属光栅或者金属超构表面构成，用于将垂直入射的激发光进行电场增强，进而增强待测细胞的拉曼信号。
所述相位成像系统与所述拉曼散射光谱成像系统共用所述分束镜103的反射光路和所述载玻片系统105，所述载玻片系统105同时还可以部分透射所述激发光，所述部分透射激发光作为携带有待测细胞相位信息的物光通过反射镜107进入合束器108，与经过所述分束器103并进入所述合束器108的透射光合束干涉，形成干涉图。
所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统还包括计算机控制与采集系统112，用于控制所述拉曼散射光谱成像系统和定量相位成像系统对细胞样品进行同时同位的信号采集。
作为一种优先的实施方式，所述载玻片系统是一块由亚波长周期的二维金属光栅组成，所述二维金属光栅由周期排列的纳米孔阵列构成，纳米孔的周期为300nm，孔的大小范围为200-300nm。
作为一种优先的实施方式，所述拉曼散射光谱成像系统104和所述相位成像系统106使用相同放大倍率的物镜。
本发明实施例还提供一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像方法，请参考图1，包括：
1.使用雷尼绍共聚焦拉曼光谱仪(型号：inVia)102，搭配使用线偏振的单横模单纵模激光器101作为光源，并使光源的偏振成水平方向；
2.将从所述共聚焦拉曼光谱仪102输出的光输入非偏振的半反半透镜103，其透射率和反射率比为1:9，将反射部分的光进入拉曼散射光谱的显微成像系统104，形成激发光，并使用所述显微成像系统104收集拉曼信号；
3.在所述的拉曼散射光谱显微成像系统的下方设置用于定量相位成像的相位成像系统，使该系统的焦平面和所述拉曼散射光谱成像系统的焦平面重合；
4.在所述拉曼散射光谱成像系统与所述相位成像系统的共同焦平面上设置载玻片系统，使所述载玻片系统中的光栅方向与激发光的偏振方向垂直，且使得所述拉曼光谱成像系统和所述相位成像系统能够同时清晰成像；所述载玻片系统可以增强细胞的拉曼信号，并将拉曼信号以反射的方式，沿着激发光反相输入共聚焦拉曼光谱仪；同时所述载玻片系统透射只携带了待测细胞相位信息的激发光，进入相位成像系统；
5.将相位成像系统输出的携带有待测细胞相位信息的光作为物光，输入合束光学元件，同时，将所述半反半透镜的透射部分光作为参考光，输入所述合束光学元件，所述物光与所述参考光在所述合束光学元件处形成干涉图；
6.将所述合束光学元件输出的干涉图输入图像传感器；
7.使用由计算机组成的控制和采集系统，控制拉曼散射光谱成像系统和相位成像系统同时同位地进行数据采集，获取一一匹配的拉曼光谱的空间分布和相位分布信息。
本发明实施例还提供应用所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统同时且同位测量细胞的成分和形貌(折射率)分布的方法，包括如下步骤：
1.搭建所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统；
2.将细胞连同培养液滴加在所述载玻片系统上，或将所述载玻片系统放置在透明细胞培养皿底部，然后调整所述光谱成像物镜和所述相位成像物镜，使细胞能够清晰成像；
3.使用计算机控制双模态系统同时采集拉曼散射光谱和干涉图，结合共聚焦的纵向分辨能力，形成三维的拉曼光谱空间分布图，同时使用相位恢复算法，获得三维的相位空间分布图。至此，获得细胞同一时间和同一空间上的拉曼光谱成像和相位成像；
4.利用所述相位空间分布图，获取折射率，细胞形貌，细胞大小等参数，结合所述的与之一一对应的拉曼光谱空间分布代表的细胞成分空间分布，利用这两种不同维度的信息，分析细胞的生理机理。
综上所述，本发明实施例提供的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，方法及应用该对细胞进行同时同位测量细胞成分和形貌(折射率)分布的方法，可以将细胞内的成分空间分布和细胞的形貌、大小在时间维度和空间维度一一匹配，从而实现分别先后单独使用这两种方法所不能获取的双模态生物信息，对细胞的分化，凋亡调控提供早期关键的信息，可以大幅度降低实验试错的成本和提高效率。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，其特征在于，包括一个配置激光器的共聚焦拉曼光谱仪；一个设置在所述共聚焦拉曼光谱仪输出端激发光路上的半反半透镜，用于将激发光分成两部分，其中反射部分输入拉曼散射光谱成像系统，用于激发和收集拉曼信号，透射部分用于形成相位成像的参考光；设置在所述拉曼散射光谱成像系统焦平面处的载玻片系统，用于承载细胞样品并增强细胞样品的拉曼散射信号；设置在所述载玻片系统后方的相位成像系统，将透过所述载玻片系统的物光输入合束器，所述合束器将所述参考光和所述物光进行合束干涉形成干涉图，并将干涉光输入图像传感器，收集干涉图用于后期计算形成定量相位分布图；所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，还包括由计算机组成的控制采集系统，用于控制所述拉曼散射光谱成像系统和所述相位成像系统同时进行数据采集与计算。
2.根据权利要求1所述的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，其特征在于，所述载玻片系统是一个亚波长周期的金属光栅或者金属超表面，用于将所述的金属光栅表面或所述金属超表面附近的电场进行增强，进而增强细胞样品的拉曼信号，同时一部分携带了待测细胞相位的光透射所述金属光栅，形成物光。
3.根据权利要求2所述的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，其特征在于，所述金属光栅由周期排列的纳米孔阵列构成，纳米孔的周期为300nm，孔的大小范围为200–300nm。
4.根据权利要求2或3所述的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，其特征在于，所述激光器是一个单横模单纵模线偏振激光器。
5.根据权利要求2或3所述的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统，所述拉曼散射光谱成像系统和所述相位成像系统使用放大倍率相同的物镜。
6.一种基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)搭建共聚焦拉曼显微成像系统；
(2)在所述共聚焦拉曼显微成像系统的激发光路上加入半反半透元件，将反射部分的光作为定量相位成像系统的物光，与所述共聚焦拉曼显微成像系统的激发光路重合形成重合光路；将透射部分的光作为定量相位成像系统的参考光；
(3)在所述重合光路上加入载玻片系统，使得透过细胞并携带细胞相位信息的物光可以透过所述载玻片系统，同时，将被激发的细胞的拉曼信号反射，进入所述共聚焦显微拉曼光谱仪进行光谱测量或者光谱成像；
(4)使用合束元件，将所述物光与所述参考光合并，形成干涉图；
(5)使用计算机控制双模态系统同时采集拉曼散射光谱和干涉图，形成拉曼光谱的空间分布图，同时对所述干涉图使用相位恢复算法，获得相位的空间分布图。至此，获得细胞同一时间和同一空间上的拉曼光谱成像和相位成像。
7.一种应用根据权利要求1-5任一所述的基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统进行同时且同位测量细胞的成分和形貌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)搭建所述基于拉曼散射光谱和定量相位的双模态成像系统；
(2)将细胞连同培养液滴加在所述载玻片系统上，或将所述载玻片系统放置在透明细胞培养皿底部，然后调整所述光谱成像物镜和所述相位成像物镜，使细胞能够清晰成像；
(3)使用计算机控制双模态系统同时采集拉曼散射光谱和干涉图，形成拉曼光谱的空间分布图，同时使用相位恢复算法，获得相位的空间分布图。至此，获得细胞同一时间和同一空间上的相位成像和拉曼光谱成像；
(4)利用相位空间分布，获取折射率，细胞形貌，细胞大小等参数，结合拉曼光谱空间分布代表的成分空间分布，利用这两种不同维度的信息，来分析细胞的生理机理。
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