CN110082901A - 一种双模式的全内反射显微系统 - Google Patents

Abstract

一种双模式的全内反射显微系统，属于显微仪器技术领域。本发明包括入射光路组件、成像组件和数据采集组件，入射光组件包括激光器、准直透镜、起偏器、光栅、会聚透镜和光学掩膜；成像组件包括物镜、分光镜、二向色镜、反射镜、透镜、CCD相机和EM‑CCD相机；数据采集组件包括数据采集卡和数据采集软件。本发明能够利用计算机程序算法构建出物体超分辨率荧光图像，降低成像过程的复杂度，提高测量结果的准确性；并且在此基础上，添加一种基于物体散射场幅度测量的成像模式，与原有荧光成像模式联用，形成双模态的成像显微系统。

Description

一种双模式的全内反射显微系统

技术领域

本发明涉及显微仪器技术领域，尤其涉及一种双模式的全内反射显微系统。

背景技术

在生物、材料等领域，显微系统作为成像仪器被广泛使用，例如荧光显微镜、共聚焦显微镜、近场显微镜等。以全内反射荧光显微技术为例，它是通过调制照明光， 扩展了成像系统空间频率可观测区域—光学传递函数，使成像分辨率成功突破了光学显微成像极限限制。

然而目前的荧光显微技术存在以下问题：1、一般荧光显微镜只提供了生物物体荧光功能图像，缺乏物体结构信息考查能力；2、以上述全内反射荧光显微技术为例，已知照明光的具体参数是该显微镜超分辨物体荧光图像获取的必要条件，记录照明光的具体参数是必需的测量过程，因此，实验过程复杂。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种双模式的全内反射显微系统，其能够利用计算机程序算法构建出物体超分辨率荧光图像，降低成像过程的复杂度，提高测量结果的准确性；并且在此基础上，添加一种基于物体散射场幅度测量的成像模式，与原有荧光成像模式联用，形成双模态的成像显微系统。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种双模式的全内反射显微系统，包括入射光路组件、成像组件和数据采集组件，

所述入射光组件包括激光器、准直透镜、起偏器、光栅、会聚透镜和光学掩膜；

所述成像组件包括物镜、分光镜、二向色镜、反射镜、透镜、CCD相机和EM-CCD相机；

所述数据采集组件包括数据采集卡和数据采集软件。

本发明采用全内反射的方式进行照明，使用光栅调制入射光(波长λ=485nm)，在光路中加入光学掩膜，只允许±1级的衍射光通过，并聚焦在高倍数、高数值孔径物镜（油镜，100X TIRF，NA=1.49）的后焦面上，经过物镜后重新变为平行光。入射光波长、物镜类型不仅限于此，可根据实际需求灵活更换。在物体-基底界面处，入射光入射角大于全反射临界角，从而在界面处形成倏逝波，同时两束平行光发生干涉，在物体-基底界面处产生余弦结构倏逝驻波照明物体。基底采用通用载玻片，厚度范围为0.13mm-0.17mm。物体荧光信号与物体受激产生的散射场通过同一物镜收集，成像光路中插入二向色镜，将物体散射场与荧光信号分离，最后通过CCD、EM-CCD相机分别测量。一般来说，因生物细胞物体折射率范围在1.33-1.38。比如，对于数值孔径为NA=1.49的物镜，可利用数值孔径ΔNA范围为0.11-0.16，入射角具有18度的调节范围，光束校准比较容易，也方便改变光束强度。同时，高数值孔径也有利于尽可能多的收集物体散射场信息。因此，宜选用NA较大的物镜（限定范围）。另外，本系统采用反射式成像，即光源和采集模块CCD相机在物体对侧，利用载玻片进行载物，因此物镜需要使用油镜，介质油折射率与载玻片折射率应相匹配。

而CCD相机和EM-CCD相机测量得到的数据通过数据采集组件的采集和计算来得出最终的物体二维图像，具体方式为：1、通过使用偶极子方法（Couple dipole method，CDM）或时域有限差分法（Finite-Difference Time-Domain，FDTD）对物体散射场进行理论模拟，仿真结果与实验测量数据进行对比，为实验结果提供交叉比对依据。2、超分辨率荧光图像获取：从 l=1,2,3,…L 幅未知结构照明光下测量的荧光图像Dl，通过最小化代价函数F估计出高分辨率物体荧光功能图像，同时得到 L 束不同的空间照明强度分布Il=1,2,3…L。3）物体二维结构图像获取：利用共轭梯度快速傅里叶方法（Conjugate-Gradient FastFourier Transform，CG–FFT），通过最小化代价函数F估计出物体二维结构图像。

本发明的优点是：通过光学系统设计、图像算法等手段，实现一种双模式（荧光模式、散射模式）、高分辨率的全内反射显微系统，该系统该可同时为生物物理研究同时提供细胞荧光功能图像以及细胞结构图像。本发明相对于现有技术而言：1、不需要对结构照明光进行精确控制以及测量，大大降低了成像系统的复杂度。2、避免了成像过程中光束畸变、透镜色差等带来的测量噪声，极大提高成像系统稳定性。3、仅利用物体散射场幅度，通过求解逆散射问题，进行物体结构成像。相比于相位测量，物体散射场幅度可直接快速地通过CCD相机进行测量，系统硬件成本低，结构简单。

综上，本发明双模式全内反射显微系统的设计实现了双模式（荧光模式、散射模式）的物体测量，可在无接触、无损伤、无侵入条件下，对物体表面进行荧光和结构高分辨率的成像。同时，利用图像重建程序算法，极大的简化成像系统设计复杂度，提高了系统结构的紧凑性。

附图说明

图1为本发明的结构原理图；

图2为物体-基底界面倏逝波示意图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

一种双模式全内反射显微系统，包括入射光路组件、成像组件和数据采集组件，所述入射光组件包括激光器1、准直透镜2、起偏器3、光栅4、会聚透镜5和光学掩膜6；所述成像组件包括物镜7、分光镜8、二向色镜9、反射镜10、透镜11、CCD相机12和EM-CCD相机13；所述数据采集组件包括数据采集卡和数据采集软件。

以观测生物细胞样本为例，物体14（细胞）置于载玻片15上，照明光源采用波长485nm的激光光源，出射后依次通过准直透镜进行准直，然后通过起偏器进行偏振纯化，接着通过光栅，改变入射光的方位角和相位，之后通过会聚透镜将入射光聚焦在物镜（UAPON100xO TIRF，NA1.49）的后焦面上，在会聚透镜和物镜之间插入光学掩膜，只允许±1级的衍射光通过，光线经过物镜后重新变为平行光。调节入射角，使之大于全反射临界角，两束平行光发生干涉，在物体-基底界面处产生余弦结构倏逝波驻波，照明物体。

物体产生的荧光信号以及物体散射场通过物镜进行收集，通过二向色镜对两路不同波长的光信号进行分离，散射信号通过CCD相机进行接收，荧光信号通过反射镜调整位置后，在EM-CCD相机上进行接收。

该实施例中，采用数据采集卡，同步采集两个相机上的数据。利用采集的数据，通过图像算法，重建物体超分辨率的荧光图像和物体二维结构图像。

光路中光学元件要求，通过一定的光学薄膜设计，尽可能减少光学元器件的反射和吸收带来的损耗，提高光线透过率，同时降低杂散光形成的噪声信号；

物体散射场通过CCD相机仅进行幅度测量，即光强测量不涉及相位，通过数学估计算法替代复杂的物体散射场相位测量光路，所以系统硬件成本低，结构简单，稳定性强。

可见，本发明双模式全内反射显微系统，实现一种双模式（荧光模式、散射模式）、高分辨率的显微成像新系统，可同时提供物体荧光功能图像以及结构图像。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，该具体实施方式是基于本发明整体构思下的一种实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种双模式的全内反射显微系统，其特征在于，包括入射光路组件、成像组件和数据采集组件，

所述入射光组件包括激光器、准直透镜、起偏器、光栅、会聚透镜和光学掩膜；

所述成像组件包括物镜、分光镜、二向色镜、反射镜、透镜、CCD相机和EM-CCD相机；

所述数据采集组件包括数据采集卡和数据采集软件。