CN102305776B - 基于透明介质微球的超分辨显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于透明介质微球的超分辨显微成像系统，该系统采用基于传统的宽场光学显微镜系统进行改进的装置，即，在传统的宽场光学显微镜系统中，在样品表面放置一微米量级的透明小球。该系统采取的方法为：使用白光照明样品，激发样品表面产生表面等离子体倏逝波；使用微米量级的透明小球耦合表面等离子体倏逝波，并进行空间放大产生样品放大的虚像；对虚像进行二次成像并观察，从而获取样品表面的超分辨细节的显微图像，实现基于白光宽场照明的远场宽场超分辨。本发明系统分辨率精细度高，获取图像真实可靠，图像获取速度高，可以获取观察样品的即时动态图像；结构简单，成本低廉。

Description

基于透明介质微球的超分辨显微成像系统

技术领域

本发明属于微观观测测量领域，具体涉及一种基于透明介质微球的超分辨显微成像系统的方法和装置。

背景技术

纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括1～100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨显微术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在：物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大小；分子生物学的发展要求人们能观测到活体细胞这种高散射物质内小到纳米尺度的单分子；微电子技术的发展要求人们能检测到超大规模集成电路中窄到数十纳米的线宽尺寸；纳米新材料的出现要求人们能观测到纳米尺度大小的纳米颗粒等，这些现代科学的新进展，更加促使人们不断地去探索高分辨显微成像的新方法和新技术。

由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和1000nm。如图1所示为传统的宽场光学显微镜系统的示意图，包括第一光源1、第二光源2、第一抛物线型反光碗3、第二抛物线型反光碗4、第一宽光谱线偏振片5、第二宽光谱线偏振片6、第一柯勒透镜7、第二柯勒透镜8、第一视场光阑9、第二视场光阑10、第一孔径光阑11、第二孔径光阑12、第一显微物镜13、第二显微物镜14、粗调装置15、样品架19、分光棱镜20、电荷耦合元件(Charged Coupled Device，CCD)21、显微目镜22、计算机23、样品24、分光镜25和反射镜26等组件。

按照功能不同，可以分为反射式照明模块、透射式照明模块、成像模块和样品模块等几个部分。一般的工作流程为：通过反射式照明模块或/和透射式照明模块提供照明光照亮样品表面，再通过成像模块获取图像由人眼直接观察或交由计算机处理；样品模块的主要功能则是放置样品并提供横向调节，以方便显微镜观察更大的视场区域。

其中，典型的反射式照明模块包括第一光源1、第一抛物线型反光碗3、第一宽光谱线偏振片5、第一柯勒透镜7、第一视场光阑9、第一孔径光阑11、第一显微物镜13和分光镜25等组件。第一光源1放置于第一抛物线型反光碗3的焦点上，由第一光源1发出的白光，经过第一抛物线型反光碗3反射收集后将依次通过第一柯勒透镜7、第一视场光阑9、宽光谱线偏振片5、第一孔径光阑11、分光镜25和第一显微物镜13后，照亮样品24表面。

与之相对应，典型的透射式照明模块包括第二光源2、第二抛物线型反光碗4、第二宽光谱线偏振片6、第二柯勒透镜8、第二视场光阑10、第二孔径光阑12和第二显微物镜14等组件。第二光源2放置于第二抛物线型反光碗4的焦点上，由第二光源2发出的白光，经过第二抛物线型反光碗4反射收集后将依次通过第二柯勒透镜8、第二视场光阑10、第二孔径光阑12、第二宽光谱线偏振片6、反射镜26和第二显微物镜14后，采用透射的方式照亮样品24。

上述的反射式照明模块和透射式照明模块均构成柯勒照明模式，其相对光学位置关系如图2所示(以反射式照明模块为例，在此忽略了用于折转光路的分光镜25或反射镜26)。为满足柯勒照明要求，第一柯勒透镜7把第一光源1放大成像在第一显微物镜13的前焦平面上，照明模块的第一孔径光阑11就位于该焦平面，第一显微物镜13又把孔径光阑成像在无限远，即与第一显微物镜13的入射光瞳重合。照明模块的第一视场光阑9紧贴放置于第一柯勒透镜7后方，被第一显微物镜13成像在物平面即样品24表面上。照明系统的第一孔径光阑11(光阑孔径可变)确定了照明系统的孔径角，而第一柯勒透镜7后的第一视场光阑9决定了被照明可观测样品24范围的大小。第一宽光谱线偏振片5可以放置于第一光源1之后、分光镜25之前任意位置，它的作用是将光源发出的光线转变为线偏光，以满足在特殊情况下对于照明光偏振性的要求。宽光谱线偏振片5可以环绕其中央对称轴做360度旋转，也可以抽离光轴，在这种情况下，照明光将没有偏振效应。

第一显微物镜13是整个宽场光学显微镜系统的核心，它与分光棱镜20、CCD21、显微目镜22和粗调装置15又构成成像模块，其相对光学位置关系如图3所示。通过粗调装置15上下调节第一显微物镜13的高度，以第一显微物镜13为成像元件，CCD21和样品24构成共轭关系，即样品24将被第一显微物镜13直接成像在CCD21表面。同时，被第一显微物镜13收集的光线，经分光棱镜20按光强比例1∶1平均分为两路，其中一路直接被CCD21接收，通过计算机23数据处理后成为数字格式图像；另一路通过显微目镜22，可以直接被人眼观察，在该路中，样品24将被成像在显微目镜22前焦平面上。

样品架19和样品24构成样品模块，如图4所示。样品24被放置在样品架19上。样品架19的中间为通孔，使透射式照明模块的照明光能够照明样品24。同时，样品架19提供横向调节功能，以方便显微镜观察更大的视场区域。

为了节约成本，简化功能，在很多情况下上述的宽场光学显微镜会进行一定的简化：如在很多商品化宽场光学显微镜中，反射式照明模块和透射式照明模块仅保留其中之一，甚至二者都完全取消；在成像模块中不包含分光棱镜20和CCD21，仅保留第一显微物镜13和用于人眼观察的显微目镜22等。其他的改进或替代还包括：将第一抛物线型反光碗3或第二抛物线型反光碗4替换为椭圆型等。

需要指出的是，在整个宽场光学显微镜系统中，第一显微物镜13作为成像元件是必不可少的。当系统中采用了反射式照明模块时，第一显微物镜13既作为成像模块中的成像元件，又作为柯勒照明模块中的组件之一。当系统中没有采用反射式照明模块时，第一显微物镜13仍作为成像模块中的成像元件而存在。

二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息(如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息)，因而无法完全取代光学显微成像的地位。

随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术(Super-resolution Optical Microscopy，SROM)应运而生。根据原理不同，现有技术可以分为两大类：一类是以固体浸没透镜(Solid Immersion Lens，SIL)技术为代表的近场显微技术；另一类则是以激发抵制损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion，STED)为代表的荧光显微技术。然后，两种现有技术都存在着一定的缺陷：前者虽然使用宽场照明，但很难将其分辨率压缩在100nm以下；后者则是基于荧光显微技术，无法使用于非荧光样品上，因此使用范围受到限制。

发明内容

本发明提供了一种基于透明介质微球的超分辨显微成像系统，以微米量级的透明小球为核心，实现了基于白光宽场照明的超分辨显微图像获取，实现了远场宽场超分辨。

一种基于透明介质微球的超分辨显微成像方法，包括以下步骤：

(1)使用白光照明具有超分辨细节的待观察样品，激发所述的待观察样品表面产生表面等离子体倏逝波；所述的具有超分辨细节的待观察样品，为金属样品、预先进行了喷金处理的介质样品或预先进行了喷金处理的半导体样品；所述的照明为反射式柯勒照明和/或透射式柯勒照明；

(2)使用微米量级的透明小球耦合所述的表面等离子体倏逝波，并进行空间放大产生待观察样品放大的虚像；所述的微米量级的透明小球，是指直径在1～9um之间、在380～780nm透明且折射率在1.3～1.9之间的透明介质小球；所述的微米量级的透明小球放置在所述的待观察样品表面，且所述的微米量级的透明小球的最低点与待观察样品表面相切或垂直距离＜100nm；

(3)使用显微物镜对所述的待观察样品放大的虚像进行二次成像；

(4)观察或获取所成的二次像。

步骤(1)中所述的白光，是指由波长范围在380～780nm内的可见光的混合而成的非相干光，其中心波长为550～600nm。

步骤(1)中，所述的待观察样品的表面局部粗糙度不大于20nm。所述的表面局部粗糙度，是指样品表面纵向上，在本方法可观察的视场范围内，最高点与最低点间的最大高度差。所述的可观察的视场范围，是指本方法的最终可清晰成像范围，由步骤(2)所述的透明小球的大小确定。

步骤(2)中，所述的微米量级的透明小球优选为直径为3um、折射率为1.46的二氧化硅小球。

步骤(2)中，所述的微米量级的透明小球可以为无镀膜的微米量级的透明小球、也可以为镀有金薄膜的微米量级的透明小球。优选为表面镀金薄膜的微米量级的透明小球，以加强微米量级的透明小球耦合表面等离子体倏逝波的效果。所述的金薄膜的物理性质(如折射率、厚度)由选用小球的物理性质(如折射率、大小)决定。采用直径为3um、折射率为1.46的二氧化硅小球时，表面镀金薄膜厚度优选为30nm。

步骤(3)中，所述的显微物镜，是指数值孔径NA＝0.8～0.9、放大率为100倍的非浸没式显微物镜，优选为NA＝0.8。

步骤(4)中，可以采取电荷耦合元件(Charged Coupled Device，CCD)获取所成的二次像，也可以由人眼配合显微目镜直接观察所成的二次像；所述的显微目镜，放大倍率优选为10倍。

本发明的工作原理是：

当照明光线倾斜入射金属-介质分界面时，当满足动量匹配条件时，可以激发出表面等离子倏逝波。表面等离子体倏逝波是一种沿金属-介质分界面传播的横波，其波数由如下公式确定：

$k_{\mathrm{sp}}=k_0\sqrt{\frac{{\mathrm{\ϵ}}_m{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_m+{\mathrm{\ϵ}}_d}}$

其中k_sp为表面等离子体倏逝波波数，k₀为入射光波数，ε_m为金属介电常数，ε_d为介质介电常数。特别地，当金属-介质分界面呈现周期性光栅分布时，其波数可以进一步简化为：

k_sp＝k₀′+nG

其中k₀′＝k₀sinθ，θ为入射光线入射角，G为光栅矢量的大小。

一般认为，常规光学显微镜不能观察到样本表面超分辨细节的原因在于k₀＜G，而由上述公式可以看出，在表面等离子体倏逝波被激发的情况下，存在如下关系：k_sp＞G＞k₀，因此使用表面等离子体倏逝波进行超分辨观察是可行的。然而，由于表面等离子体倏逝波只存在于样品表面(即金属-介质分界面上)，并且随着距离分界面距离的增大电场强度呈指数衰减，因此，一般认为表面等离子体倏逝波无法传播到远场，由于金属对光也有衰减作用，表面等离子体倏逝波即使在平行于表面方向上也只能传播有限的距离。然而，当将微米量级的透明小球在靠近待观察样品(金属或经过喷金处理的介质、半导体)表面放置时，在微米量级的透明小球和待观察样品表面间将产生类似于光纤耦合的光的隧穿效应，原本沿金属-介质分界面传播的表面等离子体倏逝波将被耦合进入透明小球。由于表面等离子体倏逝波的波长远小于微米量级的透明小球的直径，因此微米量级的透明小球在这里可以被看成是一个凸透镜。当样品表面与微米量级的透明小球表面的距离小于小球半径时，样品表面将成放大的虚像，进而可以通过显微物镜进行观察。

观察图像的清晰度可以由观察图像的对比度定量表征，而对比度与耦合的表面等离子体倏逝波的电场强度正相关。当微米量级的透明小球表面镀有金薄膜时，将有新的表面等离子体倏逝波场在小球表面被激发，它们与原来样品表面上表面等离子体倏逝波的的共振作用将使电场得到增强，从而使耦合效果得到增强。然而，所镀金膜的厚度不宜过大，过厚的金膜将增大小球表面的光反射进而造成远场散射现象，使得耦合效果劣化。

本发明还提供了一种基于透明介质微球的超分辨显微成像装置，为宽场光学显微镜系统，包括：用于提供照明光照亮样品表面的照明模块、用于获取样品表面图像并进行观察或处理的成像模块和用于放置样品并提供横向调节的样品模块，还包括：

用于进行超分辨显微成像的微米量级的透明小球，

用于固定所述的微米量级的透明小球的球托；

用于与所述的球托和成像模块中的显微物镜连接、并控制所述的微米量级的透明小球高度的细调装置；

其中，所述的微米量级的透明小球，是指直径在1～9um之间、在380～780nm透明且折射率在1.3～1.9之间的透明介质小球，优选为直径为3um、折射率为1.46的二氧化硅小球；所述的微米量级的透明小球放置在样品表面，所述的微米量级的透明小球最低点与样品表面的平面相切或垂直距离＜100nm。

其中，所述的细调装置，包括：用于与球托和成像模块中的显微物镜进行连接的支架、用于细调的压电陶瓷和用于驱动所述的压电陶瓷的高压放大模块。所述的细调装置的细调范围为10um，细调精度为2nm。

其中，所述的用于固定微米量级的透明小球的球托，可以采取两种技术方案：一种被称为“沉孔方案”，即，在厚度为微米量级的二氧化硅薄片上，微加工制作一个沉孔型微孔，沉孔直径大于所述的微米量级的透明小球直径，下方的通孔直径则小于所述的微米量级的透明小球的直径，可以采用准分子激光微加工或LIGA工艺等技术手段进行加工，所述的球托与所述的微米量级的透明小球间使用紫外曝光胶固化永久性连接；针对直径为3um的微米量级的透明小球，优选尺寸为：沉孔直径8um，下方通孔直径2.8um，薄片厚度10um；另一种被称为“探针方案”，即，使用微米空心玻璃探针，经金属镀膜后，直接通过静电力吸附所述微米量级的透明小球，微米空心玻璃探针可以通过加热毛细玻璃管拉伸得到，微米空心玻璃探针尺寸优选与所述微米量级的透明小球相同。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)分辨率精细度高，可以获取横向50nm的超分辨图像；

(2)采用白光照明，获取图像真实可靠；

(3)采用宽场成像方式，图像获取速度远高于扫描成像方式，可以获取观察样品的即时动态图像；

(4)结构简单，成本低廉。

附图说明

图1为传统的宽场光学显微镜系统的结构原理图。

图2为传统的宽场光学显微镜系统中应用柯勒照明的光路示意图。

图3为传统的宽场光学显微镜系统中成像模块的光路示意图。

图4为传统的宽场光学显微镜系统中样品模块的示意图。

图5为本发明的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置的结构原理图。

图6为本发明中沉孔方案球托与微米量级的透明小球装配及尺寸示意图。

图7为本明中探针方案球托与微米量级的透明小球装配及尺寸示意图。

图8为本发明中细调装置的原理图。

图9为本发明中采用表面镀金薄膜的微米量级的透明小球的示意图。

图10为本发明中采用的微米量级的透明小球阵列的示意图。

图11为与图10中的微米量级的透明小球阵列相适应使用的球托阵列基板的示意图。

图中，光源1，光源2，抛物线型反光碗3，抛物线型反光碗4，宽光谱线偏振片5，宽光谱线偏振片6，柯勒透镜7，柯勒透镜8，视场光阑9，视场光阑10，孔径光阑11，孔径光阑12，显微物镜13，显微物镜14，粗调装置15，微米量级的透明小球16，球托17，细调装置18，样品架19，分光棱镜20，CCD21，显微目镜22，计算机23，样品24，球托基板17a，沉孔17b，通孔17c，微米空心玻璃探针17d，连杆18a，连杆18b，压电陶瓷18c，高压放大模块18d，微米量级的透明小球阵列160，球托阵列170，球托阵列基板170a，分光镜25，反射镜26，金薄膜27。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

图1为传统的宽场光学显微镜系统的结构原理图，包括第一光源1、第二光源2、第一抛物线型反光碗3、第二抛物线型反光碗4、第一宽光谱线偏振片5、第二宽光谱线偏振片6、第一柯勒透镜7、第二柯勒透镜8、第一视场光阑9、第二视场光阑10、第一孔径光阑11、第二孔径光阑12、第一显微物镜13、第二显微物镜14、粗调装置15、样品架19、分光棱镜20、电荷耦合元件(Charged Coupled Device，CCD)21、显微目镜22、计算机23、分光镜25和反射镜26。样品24置于样品架19上。

按照功能不同，图1所示的传统的宽场光学显微镜系统可以分为反射式照明模块、透射式照明模块、成像模块和样品模块等几个部分。一般的工作流程为：通过照明模块(包括反射式照明模块或/和透射式照明模块)提供照明光照亮样品表面，再通过成像模块获取图像由人眼直接观察或交由计算机处理；样品模块的主要功能则是放置样品并提供横向调节，以方便显微镜观察更大的视场区域。

图2为传统的宽场光学显微镜系统中应用柯勒照明的光路示意图；图3为传统的宽场光学显微镜系统中成像模块的光路示意图；图4为传统的宽场光学显微镜系统中样品模块的示意图。

如图5所示，一种基于透明介质微球的超分辨显微成像装置，包括：第一光源1，第二光源2，第一抛物线型反光碗3，第二抛物线型反光碗4，第一宽光谱线偏振片5，第二宽光谱线偏振片6，第一柯勒透镜7，第二柯勒透镜8，第一视场光阑9，第二视场光阑10，第一孔径光阑11，第二孔径光阑12，第一显微物镜13，第二显微物镜14，粗调装置15，微米量级的透明小球16，球托17，细调装置18，样品架19，分光棱镜20，CCD21，显微目镜22，计算机23，分光镜25，反射镜26。样品24置于样品架19上。

第一光源1、第一抛物线型反光碗3、第一宽光谱线偏振片5、第一柯勒透镜7、第一视场光阑9、第一孔径光阑11、第一显微物镜13和分光镜25构成上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置的反射式照明模块。第一光源1放置于第一抛物线型反光碗3的焦点上，由第一光源1发出的白光，经过第一抛物线型反光碗3反射收集后将依次通过第一柯勒透镜7、第一视场光阑9、宽光谱线偏振片5、第一孔径光阑11、分光镜25和第一显微物镜13后，提供反射照明光线。

与之相对应，第二光源2、第二抛物线型反光碗4、第二宽光谱线偏振片6、第二柯勒透镜8、第二视场光阑10、第二孔径光阑12和第二显微物镜14构成上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置的透射式照明模块。第二光源2放置于第二抛物线型反光碗4的焦点上，由第二光源2发出的白光，经过第二抛物线型反光碗4反射收集后将依次通过第二柯勒透镜8、第二视场光阑10、第二孔径光阑12、第二宽光谱线偏振片6、反射镜26和第二显微物镜14后，提供透射照明光线。

上述的反射照明模块和透射照明模块均构成柯勒照明模式，与传统的宽场光学显微镜的结构原理相同，如图2所示。

同时，第一显微物镜13与分光棱镜20、CCD21、显微目镜22和粗调装置15构成成像模块。样品24放置在可以做横向二维移动的样品架19上构成样品模块。而微米量级的透明小球16放置在靠近样品24表面，且微米量级的透明小球16最低点与待观察样品表面的平面相切或垂直距离＜100nm。

上述的反射照明光线经过微米量级的透明小球16后照亮样品24表面，被样品24表面反射，反射光束先经过微米量级的透明小球16，再经过第一显微物镜13和分光镜25，最终由CCD21或人眼通过显微目镜22观察到的图像，为样品24反射照明光线后得到的图像。

同样，上述的透射照明光线在透过样品24后，先经过微米量级的透明小球16，再经过第一显微物镜13和分光镜25，最终由CCD21或人眼通过显微目镜22观察到的图像，为样品24被照明光线透射后得到的图像。

当样品24为介质或半导体时，需要预先对其表面做喷金处理，在其表面镀有一层金薄膜27。微米量级的透明小球16，是指直径在1～9um之间、在380～780nm透明且折射率在1.3～1.9之间的透明介质小球，优选为直径为3um、折射为1.46的二氧化硅小球。

如果照明光线从第一显微物镜13(反射照明)和/或第二显微物镜14(透射照明)出射后，直接照射在样品24表面上，将形成携带有样品表面形貌信息的表面等离子体倏逝波。其波数由如下公式确定：

$k_{\mathrm{sp}}=k_0\sqrt{\frac{{\mathrm{\ϵ}}_m{\mathrm{\ϵ}}_d}{{\mathrm{\ϵ}}_m+{\mathrm{\ϵ}}_d}}$

其中k_sp为表面等离子体倏逝波波数，k₀为入射光波数，ε_m为金属介电常数，ε_d为介质介电常数。特别地，当金属-介质分界面呈现周期性光栅分布时，其波数可以进一步简化为：

k_sp＝k₀′+nG

其中k₀′＝k₀sinθ，θ为入射光线入射角，G为光栅矢量的大小。

从上述公式可以看出，在表面等离子体倏逝波被激发的情况下，存在如下关系：k_sp＞G＞k₀，因此使用表面等离子体倏逝波进行超分辨观察是可行的。但是，由于表面等离子体倏逝波只存在于样品表面(即金属-介质分界面上)，随着距离分界面距离的增大电场强度呈指数衰减，因此，一般认为表面等离子体倏逝波无法传播到远场，并且由于金属对光有衰减作用，表面等离子体倏逝波即使在平行于表面方向上也只能传播有限的距离。

而上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置中，照明光线从第一显微物镜13(反射照明)出射后，先经过微米量级的透明小球16再照亮样品24表面，被样品24表面反射的光束再次经过微米量级的透明小球16；照明光线从第二显微物镜14(透射照明)出射后，照射在样品24表面再经过微米量级的透明小球16，这样，在微米量级的透明小球16和样品24表面间将产生类似于光纤耦合的光的隧穿效应，原本沿金属-介质分界面传播的表面等离子体倏逝波将被耦合进入微米量级的透明小球16。由于表面等离子体倏逝波波长远小于微米量级的透明小球16的直径，因此微米量级的透明小球16在这里可以被看成是一个凸透镜。由于样品24表面与微米量级的透明小球16表面的距离小于微米量级的透明小球16的半径，样品24表面将成放大的虚像。调整第一显微物镜13与微米量级的透明小球16之间的相对高度，从而使第一显微物镜13的观察面与上述的放大的虚像位置重合。此时，被第一显微物镜13收集的光线，将进入上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置的成像模块，被分光棱镜20按光强比例1∶1平均分为两束，其中一束直接被CCD21接收，通过计算机23数据处理后成为数字格式图像；另一束通过显微目镜22，可以直接被人眼观察，显微目镜的放大倍率可以为10～15X，优选为10X。

上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置中，微米量级的透明小球16为核心器件，在此将对其进行更为详细地叙述。微米量级的透明小球16与球托17连接。用于固定微米量级的透明小球的球托17，可以采取以下两种技术方案。

如图6所示为“沉孔方案”。在此方案中，微米量级的透明小球16以紫外曝光胶与球托17永久粘连。球托17为整块薄片结构、二氧化硅材质，具体尺寸参数由微米量级的透明小球16的直径大小决定。当微米量级的透明小球16的直径为3um时，球托17的球托基板17a厚度10um。为确定微米量级的透明小球16在球托17的准确位置，采用准分子激光微加工或LIGA工艺等技术手段在球托基板17a中央加工沉孔型微孔，并将微米量级的透明小球16固定放置于沉孔17b内。沉孔17b直径大于微米量级的透明小球直径，下方的通孔17c直径则小于微球直径。当微米量级的透明小球16为直径为3um时，沉孔17b直径设为8um，深度9um；通孔17c直径设为2.8um，深度1um。

如图7为“探针方案”。即使用微米空心玻璃探针17d，经金属镀膜后，通过静电力紧密吸附小球侧面，微米空心玻璃探针17d可以通过加热毛细玻璃管拉伸得到，优选尺寸与所述微米量级的透明小球16相同。

为了精确调节第一显微物镜13、微米量级的透明小球16和样品24之间的位置关系，需要使用粗调装置15和细调装置18进行调节。粗调装置15主要调节第一显微物镜13和样品架19即样品24之间的相对高度，采用电动机驱动调节/聚焦装置；粗调范围为100um，粗调精度为1um。细调装置18控制第一显微物镜13和微米量级的透明小球16间的相对位置，为保证调节精度，采取压电陶瓷装置，如图8所示。连杆18a、连杆18b分别与第一显微物镜13和球托17刚性连接，第一显微物镜13和球托17二者间的距离由两连杆间的压电陶瓷18c控制，压电陶瓷18c由高压放大模块18d驱动，高压放大模块18d由外部直流供电，控制信号则来源于计算机23。细调装置18的调节范围为10um，调节精度为2nm。

微米量级的透明小球16表面可以不做镀膜处理，但为了提高系统性能，也可以通过将小球表面镀金薄膜的方法加强微米量级的透明小球16耦合表面等离子体倏逝波的效果。如图9为本发明中采用表面镀金薄膜的微米量级的透明小球的示意图。当小球表面镀有金薄膜27时，将有新的表面等离子体倏逝波场在小球表面被激发，它们与原来样品表面上表面等离子体倏逝波的的共振作用将使电场得到增强，从而增强耦合效果。同样地，针对不同直径和折射率的微米量级的透明小球16，金薄膜27厚度也不完全相同：当微米量级的透明小球16采用直径3um、折射率1.46的二氧化硅小球时，与之对应的金薄膜27厚度优选为30nm。

通过上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置，可以清晰地观察样品24的超分辨显微图像。样品24的选取范围广泛，可以是金属样品或者经过喷金处理的介质或半导体样品。为保证整个系统在观测过程中不被损坏，样品24表面视场范围内局部粗糙度不大于200nm。按照本发明优选方案进行装配，图像最高分辨率为50nm。

上述的基于透明介质微球的超分辨显微成像装置中，观察视场范围由微米量级的透明小球16的直径大小决定。微米量级的透明小球16有限的直径选择限制了最大可观察视场的范围。为了扩大视场范围，一个可行的改进方案是使用微米量级的透明小球阵列。图10为本发明使用微米量级的透明小球阵列增加视场范围的示意图。为了充分填充微米量级的透明小球16间的空隙、减小视场不连续性，微米量级的透明小球阵列160呈交错排列。图10给出的是其中一个示例的示意图，使用10个小球排列形成微米量级的透明小球阵列160，与之相对应，采用改进的球托阵列基板170a取代远离的球托，如图11所示，球托阵列基板170a只能基于“沉孔方案”进行改进，其沉孔排布与相应的微米量级的透明小球阵列160排布相同。

Claims (8)

1.一种基于透明介质微球的超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）使用白光照明具有超分辨细节的待观察样品，激发所述的待观察样品表面产生表面等离子体倏逝波；所述的具有超分辨细节的待观察样品，为金属样品或预先进行了喷金处理的介质样品；所述的照明为反射式柯勒照明和/或透射式柯勒照明；

（2）使用微米量级的透明小球耦合所述的表面等离子体倏逝波，并进行空间放大产生待观察样品放大的虚像；所述的微米量级的透明小球，是指直径在1~9um之间、在380~780nm透明、折射率在1.3~1.9之间且表面镀有30nm金薄膜的透明介质小球；所述的微米量级的透明小球放置在所述的待观察样品表面，且所述的微米量级的透明小球的最低点与待观察样品表面相切或垂直距离<100nm；

（3）使用显微物镜对所述的待观察样品放大的虚像进行二次成像；

（4）观察或获取所成的二次像。

2.如权利要求1所述的基于透明介质微球的超分辨显微成像方法，其特征在于：步骤（1）中所述的白光，是指由波长范围在380~780nm内的可见光的混合而成的非相干光，其中心波长为550~600nm。

3.如权利要求1所述的基于透明介质微球的超分辨显微成像方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的待观察样品的表面局部粗糙度不大于20nm。

4.如权利要求1所述的基于透明介质微球的超分辨显微成像方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的微米量级的透明小球为直径为3um、折射率为1.46的二氧化硅小球。

5.一种用于实现如权利要求1~4任一所述的基于透明介质微球的超分辨显微成像方法的装置，为宽场光学显微镜系统，包括：用于提供照明光照亮样品表面的照明模块、用于获取样品表面图像并进行观察或处理的成像模块和用于放置样品并提供横向调节的样品模块，其特征在于，还包括：

用于进行超分辨显微成像的微米量级的透明小球，

用于固定所述的微米量级的透明小球的球托；

用于与所述的球托和成像模块中的显微物镜连接、并控制所述的微米量级的透明小球高度的细调装置；

其中，所述的微米量级的透明小球，是指直径在1~9um之间、在380~780nm透明且折射率在1.3~1.9之间的透明介质小球；所述的微米量级的透明小球放置在样品表面，所述的微米量级的透明小球最低点与样品表面的平面相切或垂直距离<100nm。

6.如权利要求5所述的装置，其特征在于：所述的微米量级的透明小球为直径为3um、折射率为1.46的二氧化硅小球。

7.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的细调装置，包括：用于与球托和成像模块中的显微物镜进行连接的支架、用于细调的压电陶瓷和用于驱动所述的压电陶瓷的高压放大模块。

8.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的用于固定微米量级的透明小球的球托，采取“沉孔方案”或“探针方案”；所述的“沉孔方案”是指在厚度为微米量级的二氧化硅薄片上，微加工制作一个沉孔型微孔，沉孔直径大于所述的微米量级的透明小球的直径，下方的通孔直径则小于所述的微米量级的透明小球的直径，所述的球托与所述的微米量级的透明小球间使用紫外曝光胶固化永久粘连；所述的“探针方案”是指：使用微米空心玻璃探针，经金属镀膜后，直接通过静电力吸附所述微米量级的透明小球。

Images