CN108645831B - 多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪及其检测方法，涉及荧光光谱、拉曼光谱、荧光成像、荧光显微成像的检测。该检测仪包括角分辨模块、激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块和显微成像检测模块；各模块分别通过光学导轨固定于各自的旋转台，且可围绕棱镜及其上的样品膜同时或独立旋转；通过转动各模块可以产生不同角度的激发信号以及获得不同角度的发射信号；以正四棱锥镜作为耦合元件，结合多个检测模块，在无需分光系统的情况下该检测仪可以同时获取同一个样品的表面增强荧光与拉曼、光谱与成像等多重信息。本发明结构简单，成本低廉，操作简单，易推广。

Description

多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪及其检测 方法

技术领域

本发明涉及荧光与拉曼、光谱与成像等集成功能检测，具体涉及一种表面等离子体耦合发射荧光光谱、拉曼光谱、荧光成像和荧光显微成像等检测装置及检测方法。

背景技术

荧光分析技术具有灵敏度高和方法多样性等优点，在工农业、质量检测及科学研究等领域的应用日益增加。然而在实际的应用中，由于样品的复杂性和特殊性，已有的常规荧光方法的灵敏度及选择性无法满足所有检测的需要。为了检测低浓度或者复杂基底中的组分，研究人员仍致力于发展新型荧光技术及仪器，以进一步提高荧光技术的灵敏度。表面等离子体耦合发射法(SPCE)作为一种荧光增强方法受到越来越多科研工作者的关注。SPCE的原理：处于光滑纳米金属薄膜表面200nm范围内的激发态荧光团与金属薄膜表面的等离子体耦合作用后在棱镜一侧以荧光发射波长对应的共振角度产生高度定向辐射。SPCE具有信号增强，定向发射，高度偏振性，距离依懒性，波长分辨性和背景抑制性等独特性质。自由空间条件下的荧光发射具有各向同性，其检测效率极低，通常检测到的荧光不足体系荧光总强度的1％。而SPCE由于具有高度定向性可极大地提高荧光的收集效率，与自由空间发射相比，其检测到的荧光信号可高达总体荧光强度的50％，从而大幅度地提高方法的灵敏度。

SPCE原理不仅在荧光领域得到应用，亦已应用于拉曼检测。拉曼光谱具有非标记和提供分子指纹图谱信息的特点，但其强度很弱以致难以用于分析检测中。表面增强拉曼信号(SERS)技术利用纳米结构之间的局域电磁场，能极大地增强拉曼信号，但是该类等离子体基底难以保证其增强效果的均一性和提高拉曼散射信号的收集效率。传播型表面等离子体可以提供增强效果均一的电磁场增强外还可以增强拉曼信号。克莱彻曼(Kretschmann)棱镜构型是获取传播型表面等离子体(PSP)耦合最简单直接的方式，通过在棱镜侧收集定向拉曼信号，得到表面等离子体耦合定向增强拉曼散射(SPCR)，由于该信号具有高度的定向发射性质，可进一步有效地提高拉曼信号收集效率。

作为一种新的表面等离子体耦合增强分析方法，SPCE自提出以来，因其独特的性质，受到越来越多的关注。随着研究的进一步深入，SPCE在仪器结构设计方面也得到迅速的发展。中国专利200910111882.8公开一种表面等离子体耦合荧光光谱检测装置，结构简单、易于实验室操作和推广。近年来，基于SPCE的成像研究也获得了极大的关注。在SPCE中，采用物镜作为耦合器件也可实现SPCE检测。目前大多数的SPCE成像研究主要是基于物镜型结构的装置，但其价格十分昂贵，操作复杂，设计繁琐，加工复杂且波长适用范围窄。中国专利CN102539404A公开一种定向发射荧光成像检测装置，是一种基于棱镜构型的RK模式SPCE成像检测装置。入射光直接照射样品表面，无需精密调整入射角度，操作简便、装置结构简单、成本低廉，波长检测适用范围更广，且能对更大区域样品进行有效成像，在中高密度的微阵列芯片检测中发挥更大的优势。中国专利CN103344620A公开一种双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及方法，是一种基于棱镜构型的RK和KR双模式SPCE成像检测装置。通过棱镜耦合方式，可灵活的实现RK模式与KR模式的SPCE成像检测，不仅有利于SPCE成像机理理论的进一步探索与发展，而且在实际应用中，有效的避免在单一的RK模式下，当荧光信号太弱时较难检测的问题。然而，上述基于棱镜构型的双模式SPCE成像检测装置，依然存在不足之处：SPCE具有角度定向性，以半球形棱镜作为耦合元素信号在空间形成一强度均匀的圆环，但是该成像装置只在某一个角度收集信号，因此增强的荧光信号的利用率并不充分；通过CCD只得到成像，未获得光谱信息；且仅限荧光检测，未实现拉曼检测，收集的信号比较单一，限制SPCE分析技术的推广。

发明内容

本发明的目的旨在克服上述现有检测装置存在的缺点，利用表面等离子体耦合发射荧光与发射拉曼信号空间对称分布的特点，提供一种基于棱镜构型，实现荧光光谱、拉曼光谱、荧光成像、荧光显微成像等多重信息同时或独立获取的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪及其检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，包括角分辨模块、激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块、显微成像检测模块；

所述角分辨模块包括主同轴三旋转台、侧臂同轴双旋转台；所述主同轴三旋转台包括同轴旋转的主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台，所述侧臂同轴双旋转台包括同轴旋转的侧前旋转台、侧后旋转台；棱镜设有金属薄膜，该金属薄膜上设有样品膜，该样品膜同时含有荧光探针和拉曼探针；所述棱镜设在主同轴三旋转台上，且该棱镜位于主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台同轴旋转的轴线上，所述棱镜还位于侧前旋转台、侧后旋转台同轴旋转的轴线上；

所述激发光路模块包括由外向内依次设置的激发光源、起偏器、激发光路显微物镜、针孔、平凸透镜和可变光阑；

所述荧光光谱检测模块包括由外向内依次设置的荧光检测用光纤和荧光检测用透镜，还包括与荧光检测用光纤相连接的荧光检测用检测器；

所述拉曼光谱检测模块包括由外向内依次设置的拉曼检测用光纤和拉曼检测用透镜，还包括与拉曼检测用光纤相连接的拉曼检测用检测器；

所述成像检测模块包括由内向外依次设置的成像检测用滤光片、成像检测用透镜和成像检测用检测器；

所述显微成像检测模块包括由内向外依次设置的显微成像检测用显微物镜、显微成像检测用滤光片、显微成像检测用透镜和显微成像检测用检测器；

所述激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块、显微成像检测模块分别各自独立地设在主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台、侧前旋转台、侧后旋转台的其中之一上，且激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块、显微成像检测模块各自独立地通过该些旋转台围绕所述棱镜旋转；通过激发光路模块围绕所述棱镜旋转实现不同入射角度的激发，通过荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块、显微成像检测模块围绕所述棱镜旋转实现不同角度下的表面等离子体共振耦合增强荧光光谱、表面等离子体耦合增强拉曼光谱、表面等离子体增强荧光成像、表面等离子体增强荧光显微成像的检测。

一实施例中：所述激发光路模块设在所述主下旋转台；所述荧光光谱检测模块设在所述主上旋转台；所述拉曼光谱检测模块设在所述侧前旋转台；所述成像检测模块设在所述主中旋转台；所述显微成像检测模块设在所述侧后旋转台。

一实施例中：所述激发光路模块还包括第一光学导轨，该第一光学导轨与所述主下旋转台相连且可通过主下旋转台围绕所述棱镜转动；所述激发光源、起偏器、激发光路显微物镜、针孔、平凸透镜和可变光阑设在该第一光学导轨上；所述荧光光谱检测模块还包括第三光学导轨，该第三光学导轨与所述主上旋转台相连且可通过主上旋转台围绕所述棱镜转动；所述荧光检测用光纤和荧光检测用透镜设在该第三光学导轨上；所述拉曼光谱检测模块还包括第四光学导轨，该第四光学导轨与所述侧前旋转台相连且可通过侧前旋转台围绕所述棱镜转动；所述拉曼检测用光纤和拉曼检测用透镜设在该第四光学导轨上；所述成像检测模块还包括第二光学导轨，该第二光学导轨与所述主中旋转台相连且可通过主中旋转台围绕所述棱镜转动；所述成像检测用滤光片、成像检测用透镜和成像检测用检测器设在该第二光学导轨上；所述显微成像检测模块还包括第五光学导轨，该第五光学导轨与所述侧后旋转台相连且可通过侧后旋转台围绕所述棱镜转动；所述显微成像检测用显微物镜、显微成像检测用滤光片、显微成像检测用透镜和显微成像检测用检测器设在该第五光学导轨上。

一实施例中：所述主同轴三旋转台还包括主中心轴、主上转接板、主中转接板、主下转接板，主中心轴通过主下转接板固定于外部的光学平台上，所述主上旋转台通过该主上转接板套接于主中心轴上部，所述主中旋转台通过该主中转接板套接于主中心轴中部，所述主下旋转台通过该主下转接板套接于主中心轴下部；所述侧臂同轴双旋转台还包括侧臂、侧中心轴、侧前转接板、侧后转接板，所述侧臂固定于所述光学平台上，所述侧中心轴通过侧后转接板固定于所述侧臂，所述侧前旋转台通过该侧前转接板套接于侧中心轴前部，所述侧后旋转台通过该侧后转接板套接于侧中心轴底部。

一实施例中：所述棱镜为正四棱锥棱镜。

一实施例中：所述棱镜上设有光学石英基底，棱镜与该光学石英基底之间涂有光学常数与两者相匹配的溶液；所述金属薄膜设在该光学石英基底上，所述样品模设在该金属薄膜上。

一实施例中：所述棱镜设在样品架上，样品架通过二维平移台及底座设在所述主中心轴上端。

一实施例中：所述激发光源为功率可调固体激光器，波长为400～600nm，功率为50～500mW；所述激发光路显微物镜的放大倍数为25～60倍；所述针孔的直径为0.02～0.03mm；所述可变光阑的大小为3～7mm×3～7mm。

一实施例中：所述荧光检测用检测器为单色仪检测器，所述拉曼检测用检测器为单色仪检测器，所述成像检测用检测器为CCD检测器，所述显微成像检测用检测器为CCD检测器。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种利用上述多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪的检测方法，包括：

1)调节激发光路模块中的可变光阑的尺寸，以获得大小合适的入射光斑；

2)调节激发光路模块中的激发光源的功率，以获得光强合适的入射光斑；

3)旋转激发光路模块实现不同入射角度的激发；

4)旋转荧光光谱检测模块实现不同角度下表面等离子体共振耦合增强荧光光谱的检测；旋转拉曼光谱检测模块实现不同角度下表面等离子体耦合增强拉曼光谱的检测；旋转成像检测模块实现不同角度下表面等离子体增强荧光成像的检测；旋转显微成像检测模块实现不同角度下表面等离子体增强荧光显微成像的检测。

本发明的工作原理如下：激发光通过激发光路显微物镜、针孔组成的空间滤波器和平凸透镜后，形成光强分布均匀的平行光束，平行光束通过矩形可变光阑，得到大小合适的矩形光斑，通过调节激光器电源功率，得到光强合适的入射光斑。以正四棱锥镜为耦合元件，得到正四棱锥镜直角边所在四个面的等同对称分布的表面等离子体耦合定向发射光信号，因此，通过设置同轴旋转台可以实现入射角度与发射角度的调整和检测；激发光路模块可随主下旋转台旋转，可实现不同的入射角激发样品；各检测模块可随各自旋转台旋转实现不同角度下的信号采集，因此该系统可同时实现激发光路系统不同入射角度激发样品时的不同发射角度下的图像与光谱数据等多重信息的采集。

与现有的表面等离子体耦合发射荧光检测装置相比本发明具有以下优点：

可对待测样品的较大区域实现同时的成像、荧光和拉曼光谱与荧光显微成像等多重信息的检测，有效避免由于样品局部不均匀等造成的影响，在中高密度的微阵列芯片检测中具有无可比拟的优势；此外，本发明可实现荧光和拉曼光谱信号、大区域荧光成像与局部荧光显微成像信号等多重信息的同时或独立获取，可突破以往装置设计中单一信号收集的局限性，充分利用表面等离子体耦合发射光信号，实现样品多层次信息的同时获取。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明实施例所述多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪的侧视结构示意图。

图2为本发明实施例所述多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪中侧臂同轴双旋转台的结构示意图。

图3为本发明实施例中采用正四棱锥棱镜作为耦合器件的光路示意图。

图4为本发明实施例所述多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪的主同轴三旋转台俯视结构示意图。在图4中，θ为定向检测角度，空心箭头表示各检测模块能以透镜为中心，随相应的旋转台转动。

图5为本发明实施例中采用垂直照射时，不同角度的表面等离子体增强定向荧光(SPCE)光谱示意图。

图6为本发明实施例中采用垂直照射时，不同角度的表面等离子体增强定向拉曼光谱(SPCR)示意图。

附图标记：

主下转接板1，主下旋转台2，主中心轴3，主中转接板4，主中旋转台5，主上转接板6，主上旋转台7，底座8，二维平移台9，样品架10，棱镜11，激发光源12，起偏器13，激发光路显微物镜14，针孔15，平凸透镜16，矩形可变光阑17，第一光学导轨18，成像检测用荧光滤光片19，成像检测用透镜20，成像检测用CCD检测器21，第二光学导轨22，荧光检测用透镜23，荧光检测用光纤24，第三光学导轨25，侧前旋转台26，侧后旋转台27，第四光学导轨28，拉曼检测用透镜29，拉曼检测用光纤30，第五光学导轨31，显微成像检测用显微物镜32，显微成像检测用荧光滤光片33，显微成像检测用透镜34，显微成像检测用CCD检测器35，侧前转接板36，侧后转接板37，竖直侧臂38，拉曼检测用单色仪检测器39，侧中心轴40，样品膜41，纳米级光滑金属薄膜42，光学石英基底43，荧光检测用单色仪检测器44。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，附图中相同的标号始终表示相同的部件。

本发明所述多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪包含角分辨模块、激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块和显微成像检测模块，具体结构如图1～4所示。激发光路模块和各检测模块分别通过角分辨模块实现不同入射角度激发下不同检测角度的多层次信息的获取。

1.角分辨模块：包括主同轴三旋转台、侧臂同轴双旋转台，以及底座8，二维平移台9，样品架10，棱镜11，样品膜41，纳米级光滑金属薄膜42，光学石英基底43；其中，主同轴三旋转台包括主下转接板1，主下旋转台2，主中心轴3，主中转接板4，主中旋转台5，主上转接板6，主上旋转台7；侧臂同轴双旋转台包括侧前旋转台26，侧后旋转台27，侧前转接板36，侧后转接板37，竖直侧臂38，侧中心轴40。

主同轴三旋转台为以样品为同轴圆心的双“凸”型结构，如图1所示，为上中下三层同轴结构，竖直布置的主中心轴3底端通过主下转接板1固定于外部的光学平台(图中未示出)上，主上旋转台7通过主上转接板6套接于主中心轴3的上部凸肩位置，主中旋转台5通过主中转接板4套接于主中心轴3的中部凸肩位置，主下旋转台2通过主下转接板1套接于主中心轴3底部并固定于外部的光学平台(未画出)上，从而确保上中下三个旋转台为同轴旋转结构，且主上旋转台7、主中旋转台5、主下旋转台2可围绕主中心轴3同时或分别独立地在水平面内旋转；样品架10通过二维平移台9和其相应的底座8固定于中心轴3的上端，从而确保样品架10及其上的棱镜11位于主上旋转台7、主中旋转台5、主下旋转台2同轴旋转的轴线上。

侧臂同轴双旋转台为以样品为同轴圆心的“凸”型结构，如图2所示，为前后双层同轴结构，竖直侧臂38固定于外部的光学平台上；水平布置的侧中心轴40底端通过侧后转接板37固定于竖直侧臂38上；侧前旋转台26通过侧前转接板36套接于侧中心轴40的凸肩位置，侧后旋转台27通过侧后转接板37套接于侧中心轴40底部并固定于竖直侧臂38上，从而确保前后两个旋转台为同轴旋转结构，且侧前旋转台26、侧后旋转台27可围绕侧中心轴40同时或分别独立地在竖直平面内旋转；调节竖直侧臂38的高度使得侧臂同轴双旋转台的中心位置(即侧中心轴40中心)与棱镜11的高度处于同一水平线上，从而确保棱镜11位于侧前旋转台26、侧后旋转台27同轴旋转的轴线上。

在激发光路模块和各检测模块角度调节过程中，样品架10位置始终保持不动，棱镜11固定于样品架10上；如图4所示，光学石英基底43设于棱镜11底面且光学石英基底43与棱镜11底面之间涂有光学常数与两者匹配的溶液(如甘油)，纳米级光滑金属薄膜42设在光学石英基底43上，样品膜41设在纳米级光滑金属薄膜42上。

2.激发光路模块：包括第一光学导轨18、激发光源12、起偏器13、激发光路显微物镜14、针孔15、平凸透镜16、矩形可变光阑17；第一光学导轨18与主下旋转台2相连，且第一光学导轨18可通过主下旋转台2在水平面内围绕棱镜11转动；激发光源12、起偏器13、激发光路显微物镜14、针孔15、平凸透镜16、矩形可变光阑17由外(远离主中心轴3方向)向内(靠近主中心轴3方向)依次设在第一光学导轨18上，这样，激发光路模块可通过主下旋转台2围绕样品架10及其上的棱镜11转动；

激发光路模块采用开普勒光学扩束单元，激发光源12通过调节激光器电源，得到光强合适的入射光，入射光通过起偏器13、激发光路显微物镜14、针孔15、平凸透镜16后，成为光强分布均匀、P偏振的平行光束，平行光束依次通过矩形可变光阑17，得到大小合适的矩形入射光斑。

3.荧光光谱检测模块：包括第三光学导轨25、荧光检测用透镜23，荧光检测用光纤24，荧光检测用单色仪检测器44；第三光学导轨25与主上旋转台7相连，且第三光学导轨25可通过主上旋转台7在水平面内围绕棱镜11转动；荧光检测用光纤24、荧光检测用透镜23由外(远离主中心轴3方向)向内(靠近主中心轴3方向)依次排列固定第三光学导轨25上，这样，荧光光谱检测模块可通过主上旋转台7围绕样品架10及其上的棱镜11转动；

荧光光谱检测模块用于样品在不同发射角度下的荧光光谱数据采集。光谱信号经荧光检测用透镜23聚焦到荧光检测用光纤24，荧光检测用光纤24一端收集信号，另一端直接连在荧光检测用单色仪检测器44上，荧光检测用单色仪检测器44置于光学平台上。

4.拉曼光谱检测模块：包括第四光学导轨28、拉曼检测用透镜29、拉曼检测用光纤30、拉曼检测用单色仪检测器39；第四光学导轨28与侧前旋转台26相连，且第四光学导轨28可通过侧前旋转台26在竖直平面内围绕棱镜11转动；拉曼检测用光纤30、拉曼检测用透镜29由外(远离侧中心轴40方向)向内(靠近侧中心轴40方向)依次排列固定第四光学导轨28上，这样，拉曼光谱检测模块可通过侧前旋转台26围绕样品架10及其上的棱镜11转动；

拉曼光谱检测模块用于样品在不同发射角度下的拉曼光谱数据采集。拉曼信号经拉曼检测用透镜29聚焦到拉曼检测用光纤30，拉曼检测用光纤30一端收集信号，另一端直接连在拉曼检测用单色仪检测器39上，拉曼检测用单色仪检测器39置于光学平台上。

5.成像检测模块：包括第二光学导轨22，成像检测用荧光滤光片19，成像检测用透镜20，成像检测用CCD检测器21；第二光学导轨22与主中旋转台5相连，且第二光学导轨22可通过主中旋转台5在水平面内围绕棱镜11转动；成像检测用荧光滤光片19、成像检测用透镜20、成像检测用CCD检测器21由内(靠近主中心轴3方向)向外(远离主中心轴3方向)依次排列固定在第二光学导轨22上，这样，成像检测模块可通过主中旋转台5围绕样品架10及其上的棱镜11转动；

成像检测模块用于样品在不同发射角度下的图像采集。成像信号经成像检测用荧光滤光片19、成像检测用透镜20到达成像检测用CCD检测器21。

6.显微成像检测模块：包括第五光学导轨31、显微成像检测用显微物镜32、显微成像检测用荧光滤光片33、显微成像检测用透镜34、显微成像检测用CCD检测器35；第五光学导轨31与侧后旋转台27相连，且第五光学导轨31可通过侧后旋转台27在竖直平面内围绕棱镜11转动；显微成像检测用显微物镜32、显微成像检测用荧光滤光片33、显微成像检测用透镜34、显微成像检测用CCD检测器35由内(靠近侧中心轴40方向)向外(远离侧中心轴40方向)依次排列固定在第五光学导轨31上，这样，显微成像检测模块可通过侧后旋转台27围绕样品架10及其上的棱镜11转动；

显微成像检测模块用于样品在不同发射角度下的显微图像采集。样品膜41位于显微成像检测用显微物镜32的成像焦点上，信号经显微成像检测用显微物镜32、显微成像检测用透镜33、显微成像检测用荧光滤光片34到达显微成像检测用CCD检测器35。

在本实施例中，激发光源12采用功率可调的固体激光器，波长可以为405nm、473nm、488nm、532nm、561nm或694.3nm等固体激光器，固体激光器功率可为50～500mW。例如，固体激光器采用波长为532nm的固体激光器，固体激光器的功率调为250mW。所述激发光路显微物镜14为40倍物镜。所述针孔15的直径为Φ0.025mm。所述矩形可变光阑17的大小为5mm×5mm。所述棱镜11采用正四棱锥棱镜。

本实施例中，纳米级光滑金属薄膜42采用真空溅射法制备，具体方法如下：在洁净的光学石英基底43表面溅射厚度为2nm的铬膜作为粘附层，再溅射合适厚度的金属，即得纳米级光滑金属薄膜42。

样品膜41固定于纳米级光滑金属薄膜42表面上，样品膜41同时含有荧光探针和拉曼探针。

在本实施例中的表面等离子体耦合发射荧光光谱、拉曼光谱、荧光成像、显微成像等的同时检测时，包括以下步骤：

1)调节激发光路模块中的矩形可变光阑17的尺寸，以获得大小合适的入射光斑；

2)调节激发光路模块中的激发光源12的功率，以获得光强合适的入射光斑；

3)调整主下旋转台2，使激发光路模块产生的矩形光斑以一定的入射角照射到样品膜41表面，在棱镜11侧产生表面等离子体耦合发射光，如图4所示；通过旋转调整主下旋转台2可以调节激发光路模块与棱镜11的角度，实现不同入射角度的激发。

4)荧光光谱检测模块中，棱镜11侧定向发射的荧光信号通过荧光检测用透镜23汇聚，经荧光检测用光纤24进入荧光检测用单色仪检测器44，进行检测；荧光光谱检测模块通过主上旋转台7围绕样品架10及其上的棱镜11转动，以实现不同角度下的表面等离子体共振耦合增强荧光光谱(SPCE)的检测；

拉曼光谱检测模块中，棱镜11侧定向发射的拉曼信号通过拉曼检测用透镜29聚焦，经拉曼检测用光纤30进入拉曼检测用单色仪检测器39，进行检测；拉曼光谱检测模块通过侧前旋转台26围绕样品架10及其上的棱镜11转动，以实现不同角度下的表面等离子体耦合增强拉曼光谱信号(SPCR)的检测；

成像检测模块通过主中旋转台5围绕样品架10及其上的棱镜11转动，调整成像检测模块的角度，即可通过成像检测用CCD检测器21采集不同角度下棱镜11侧定向荧光发射的表面等离子体增强荧光成像信号，并以图像格式存储，得到的图案通过软件处理实现数据分析，实现大区域成像信号的采集，获得样品的整体信息。

显微成像检测模块通过侧后旋转台27围绕样品架10及其上的棱镜11转动，调整显微成像模块的角度，即可通过显微成像检测用CCD检测器35采集不同角度下棱镜11侧定向荧光发射的表面等离子体增强荧光显微成像信号，得到局部更详细的信息。

这样，以正四棱锥棱镜为耦合元件，通过转动主下旋转台2、主上旋转台7、侧前旋转台26、主中旋转台5和侧后旋转台27的角度，分别调节激发光路模块、荧光光谱检测模块、拉曼光谱检测模块、成像检测模块、显微成像检测模块的位置，即可在无需分光系统的情况下，实现对同一样品、不同入射角度激发的不同发射角度下的表面等离子体共振耦合增强荧光光谱、表面等离子体耦合增强拉曼光谱、表面等离子体增强荧光成像、表面等离子体增强荧光显微成像的图像与光谱数据等多重信号的同时或分别独立获取。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：包括角分辨模块、激发光路模块、表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块；

所述角分辨模块包括主同轴三旋转台、侧臂同轴双旋转台；所述主同轴三旋转台包括同轴旋转的主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台，所述主同轴三旋转台还包括主中心轴、主上转接板、主中转接板、主下转接板，主中心轴通过主下转接板固定于外部的光学平台上，所述主上旋转台通过该主上转接板套接于主中心轴上部，所述主中旋转台通过该主中转接板套接于主中心轴中部，所述主下旋转台通过该主下转接板套接于主中心轴下部；主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台可围绕主中心轴同时或分别独立地在水平面内旋转；所述侧臂同轴双旋转台包括同轴旋转的侧前旋转台、侧后旋转台；所述侧臂同轴双旋转台还包括侧臂、侧中心轴、侧前转接板、侧后转接板，所述侧臂固定于所述光学平台上，所述侧中心轴通过侧后转接板固定于所述侧臂，所述侧前旋转台通过该侧前转接板套接于侧中心轴前部，所述侧后旋转台通过该侧后转接板套接于侧中心轴底部；侧前旋转台、侧后旋转台可围绕侧中心轴同时或分别独立地在竖直平面内旋转；棱镜为正四棱锥棱镜；棱镜设有金属薄膜，该金属薄膜上设有样品膜，该样品膜同时含有荧光探针和拉曼探针；所述棱镜设在主同轴三旋转台上，且该棱镜位于主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台同轴旋转的轴线上，所述棱镜还位于侧前旋转台、侧后旋转台同轴旋转的轴线上；

所述激发光路模块包括由外向内依次设置的激发光源、起偏器、激发光路显微物镜、针孔、平凸透镜和可变光阑；

所述表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块包括由外向内依次设置的荧光检测用光纤和荧光检测用透镜，还包括与荧光检测用光纤相连接的荧光检测用检测器；

所述表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块包括由外向内依次设置的拉曼检测用光纤和拉曼检测用透镜，还包括与拉曼检测用光纤相连接的拉曼检测用检测器；

所述表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块包括由内向外依次设置的成像检测用滤光片、成像检测用透镜和成像检测用检测器；

所述表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块包括由内向外依次设置的显微成像检测用显微物镜、显微成像检测用滤光片、显微成像检测用透镜和显微成像检测用检测器；

所述激发光路模块、表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块分别各自独立地设在主上旋转台、主中旋转台、主下旋转台、侧前旋转台、侧后旋转台的其中之一上，且激发光路模块、表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块各自独立地通过该些旋转台围绕所述棱镜旋转；通过激发光路模块围绕所述棱镜旋转实现不同入射角度的激发，通过表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块、表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块围绕所述棱镜旋转实现不同角度下的表面等离子体共振耦合增强荧光光谱、表面等离子体耦合增强拉曼光谱、表面等离子体增强荧光成像、表面等离子体增强荧光显微成像的同时或独立的检测。

2.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述激发光路模块设在所述主下旋转台；所述表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块设在所述主上旋转台；所述表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块设在所述侧前旋转台；所述表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块设在所述主中旋转台；所述表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块设在所述侧后旋转台。

3.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述激发光路模块还包括第一光学导轨，该第一光学导轨与所述主下旋转台相连且可通过主下旋转台围绕所述棱镜转动；所述激发光源、起偏器、激发光路显微物镜、针孔、平凸透镜和可变光阑设在该第一光学导轨上；所述表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块还包括第三光学导轨，该第三光学导轨与所述主上旋转台相连且可通过主上旋转台围绕所述棱镜转动；所述荧光检测用光纤和荧光检测用透镜设在该第三光学导轨上；所述表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块还包括第四光学导轨，该第四光学导轨与所述侧前旋转台相连且可通过侧前旋转台围绕所述棱镜转动；所述拉曼检测用光纤和拉曼检测用透镜设在该第四光学导轨上；所述表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块还包括第二光学导轨，该第二光学导轨与所述主中旋转台相连且可通过主中旋转台围绕所述棱镜转动；所述成像检测用滤光片、成像检测用透镜和成像检测用检测器设在该第二光学导轨上；所述表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块还包括第五光学导轨，该第五光学导轨与所述侧后旋转台相连且可通过侧后旋转台围绕所述棱镜转动；所述显微成像检测用显微物镜、显微成像检测用滤光片、显微成像检测用透镜和显微成像检测用检测器设在该第五光学导轨上。

4.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述棱镜上设有光学石英基底，棱镜与该光学石英基底之间涂有光学常数与两者相匹配的溶液；所述金属薄膜设在该光学石英基底上，所述样品模设在该金属薄膜上。

5.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述棱镜设在样品架上，样品架通过二维平移台及底座设在所述主中心轴上端。

6.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述激发光源为功率可调固体激光器，波长为400～600nm，功率为50～500mW；所述激发光路显微物镜的放大倍数为25～60倍；所述针孔的直径为0.02～0.03mm；所述可变光阑的大小为3～7mm×3～7mm。

7.根据权利要求1所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪，其特征在于：所述荧光检测用检测器为单色仪检测器，所述拉曼检测用检测器为单色仪检测器，所述成像检测用检测器为CCD检测器，所述显微成像检测用检测器为CCD检测器。

8.一种利用权利要求1至7中任一项所述的多功能表面等离子体耦合发射荧光与拉曼检测仪的检测方法，其特征在于：包括：

1)调节激发光路模块中的可变光阑的尺寸，以获得大小合适的入射光斑；

2)调节激发光路模块中的激发光源的功率，以获得光强合适的入射光斑；

3)旋转激发光路模块实现不同入射角度的激发；

4)旋转表面等离子体耦合定向发射荧光光谱检测模块实现不同角度下表面等离子体共振耦合增强荧光光谱的检测；旋转表面等离子体耦合定向发射拉曼光谱检测模块实现不同角度下表面等离子体耦合增强拉曼光谱的检测；旋转表面等离子体耦合定向发射荧光成像检测模块实现不同角度下表面等离子体增强荧光成像的检测；旋转表面等离子体耦合定向发射荧光显微成像检测模块实现不同角度下表面等离子体增强荧光显微成像的检测。

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