CN112649368B - 基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射(SPCE)定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置，经过半波片调制的偏振性激发光经二向色滤镜反射后以特定的角度到达物镜，激发金属表面等离子体与样品发生耦合作用，产生的SPCE信号经由物镜收集和二向色滤镜过滤后，通过反射镜切换导入SPCE显微荧光成像模块或SPCE显微荧光光谱模块，实现样品同一微区的SPCE显微荧光成像与光谱的采集。本发明通过结合显微镜系统，将耦合策略SPCE同时应用于高空间分辨荧光成像与光谱，具有定向增强特性以及微区尺度上的空间选择功能，可以获取样品同一微区的高质量显微荧光成像与光谱信息，为检测复杂体系中感兴趣微区的低含量组分提供了一种高效、可靠的手段。

Description

基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧 光成像与光谱检测方法及装置

技术领域

本发明涉及显微光学成像和光谱分析技术领域，具体涉及基于表面等离子体耦合发射(surface plasmon coupled emission，SPCE)的定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置。

背景技术

随着生物、医学等领域向细胞、小分子的不断发展，其对显微分析也提出了更高的要求。显微成像与光谱装置是光学成像技术与光谱技术的融合，不仅能提供目标物的空间成像信息，还能提供丰富的光谱信息，为研究或观测微小物体提供了一种新的技术手段。荧光技术具有成像速度快、重复性好、观察直观等优点，在细胞、小分子等领域得到了越来越广泛的应用。近年来，有关常规荧光成像与光谱的检测方法及装置得到了迅速的发展。然而，现有的荧光显微成像与光谱普遍基于非增强型的常规信号，对于复杂体系中低含量组分的检测，仍存在灵敏度不足的问题。

表面等离子体耦合发射是一种新颖的表面增强光学技术，连续金属膜表面的激发态分子和表面等离子体之间的相互作用会引发表面等离子体振荡，通过物镜或者棱镜耦合后在发射光波长对应的表面等离子共振角处形成定向辐射。SPCE具有高度定向发射性、偏振性、波长分辨性、距离依赖和背景抑制性等特点，使其能有效的提高光信号的收集效率、检测灵敏度和选择性，近年来受到了越来越多研究者的关注。基于棱镜构型的SPCE成像和光谱在仪器结构设计方面的研究得到了迅速的发展。目前，基于棱镜构型的SPCE成像和光谱检测装置，虽然可以同时获取样品的SPCE荧光成像、光谱信息，但是其检测范围大，无法对微区尺寸的样品进行检测，限制了SPCE分析技术在更小尺度上的应用。而另方面，基于物镜构型的SPCE技术，虽然可以得到微区尺度样品的成像信息，但是目前还无法获得样品对应微区的光谱信息。

发明内容

本发明的目的在于，提供基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置，是一种新颖的具有微区尺度上的空间选择和定向增强功能的SPCE显微荧光成像和光谱检测方法及装置。

本发明将普适的耦合策略SPCE同时应用于荧光成像和光谱，结合显微镜装置，基于SPCE具有的高度定向性，以物镜作为耦合元件，通过在激发光光路设置半波片以获得所需偏振性激发光，其在经过二向色滤镜反射后以特定的表面等离子体共振角射入位于金属纳米薄膜上的样品，发射的荧光信号由同一物镜收集并再次经过二向色滤镜过滤掉激发光，定向激发和全收集大大提高了信号收集效率和检测灵敏度。与棱镜构型的SPCE荧光成像与光谱检测装置收集的大范围信号相比，本发明是以物镜作为耦合器件，可以实现样品更小范围，即微区尺度的荧光成像与光谱信号采集。SPCE显微荧光成像和光谱检测方法及装置在提高信号检测灵敏度的同时，还可以实现样品同一微区高质量的荧光成像以及光谱信息的获取，为样品低含量感兴趣微区的研究提供了更加高效、可靠的检测手段。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法，所述检测方法采用的检测装置包括激发光模块、定向激发SPCE显微镜模块、SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块；所述定向激发SPCE显微镜模块包括半波片、样品、物镜、二向色滤镜和反射镜；所述SPCE显微荧光成像模块包括成像用检测器；所述SPCE显微荧光光谱模块包括定位狭缝、单色仪和光谱检测器；所述检测方法包括：

激发光模块发出的激发光束经过半波片，得到的偏振性激发光经二向色滤镜反射后到高数值孔径的聚焦物镜中聚焦，并以特定的表面等离子体共振角射入样品(例如“玻璃-金属薄膜-样品”)，激发金属表面等离子体，产生瞬逝场，激发目标物，发射信号由同一物镜收集，再经由同一二向色滤镜过滤后聚焦到定向激发SPCE显微镜模块的反射镜；

调节反射镜将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，移动样品将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸以及荧光成像强度；

调节反射镜将发射信号导入SPCE显微荧光光谱模块的光谱检测器，将单色仪的中心波长设置为零，利用光谱检测器的成像以及SPCE显微荧光光谱模块中前置的定位狭缝的微区选择功能，得到与荧光成像相同长、宽尺寸的微区，再将单色仪的中心波长设置成荧光样品发射峰的中心波长，利用SPCE显微荧光光谱模块的单色仪和光谱检测器采集与上述SPCE显微荧光成像相同大小微区的荧光光谱。

其中，所述半波片用于将激发光的偏振性调整为p偏振。例如可以由s偏振调整为p偏振。

其中，所述样品的基底为溅射了金属纳米薄膜的盖玻片。

其中，所述的样品SPCE显微荧光成像和光谱的微区尺寸等于定位狭缝的长、宽分别与显微镜物镜的放大倍数的比值。

其中，所述二向色滤镜为能够反射激发光并透过大于激发光波长的带通滤光片。

其中，所述反射镜可为全反射镜，即可100％将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，或导入SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器。所述反射镜也可按比例将发射信号分配导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器和SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器，例如SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块各50％，实现实时、同时探测成像和光谱信息。

其中，所述激发光模块包括相互连接的激光器和光纤耦合器。

本发明中，所述的显微荧光成像是以偏振性激发光定向激发位于金属纳米薄膜上的样品后得到的增强型SPCE显微荧光成像。

本发明中，所述的显微荧光光谱是以偏振性激发光定向激发位于金属纳米薄膜上的样品后得到的增强型SPCE显微荧光光谱。

在一个典型的实施例中，本发明所述的一种基于SPCE的定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法，具体操作步骤如下：

a、通过激光器选择需要的激发光波长，激光经光纤耦合器耦合后进入定向激发SPCE显微镜模块，激光经准直透镜准直为平行光束后，调节半波片，得到的偏振性激发光经第一聚焦透镜聚焦以及二向色滤镜反射后，经过物镜后到达样品，以特定的表面等离子体共振角射入样品“玻璃-金属薄膜-样品”，调节光纤耦合器的位置可以改变激发光在物镜后焦平面的入射角度。偏振性激发光以特定的表面等离子体共振角射入样品后激发金属表面等离子体，产生瞬逝场，激发目标物，发出的信号经由同一物镜收集，经二向色滤镜过滤和第二聚焦透镜聚焦后，到达定向激发SPCE显微镜模块的反射镜。调节反射镜，将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，移动样品将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸并得到微区的荧光成像强度；

b、通过激光器选择需要的激发光波长，激光经光纤耦合器耦合后进入定向激发SPCE显微镜模块，激光经准直透镜准直为平行光束后，调节半波片，得到的偏振性激发光经第一聚焦透镜聚焦以及二向色滤镜反射后，经过物镜后到达样品，以特定的表面等离子体共振角射入样品“玻璃-金属薄膜-样品”，调节光纤耦合器的位置可以改变激发光在物镜后焦平面的入射角度。偏振性激发光以特定的表面等离子体共振角射入样品后激发金属表面等离子体，产生瞬逝场，激发目标物，发出的信号经由同一物镜收集，经二向色滤镜过滤和第二聚焦透镜聚焦后，到达定向激发SPCE显微镜模块的反射镜。调节反射镜，将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，移动样品将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸并得到微区的荧光成像强度；调节定向激发SPCE显微镜模块的反射镜将发射信号导入SPCE显微荧光光谱模块的光谱检测器，将单色仪的中心波长设置为零，此时光谱检测器具有简单成像的功能，根据光谱检测器的成像功能，同时调节处于定向激发SPCE显微镜模块左侧出光口与SPCE显微荧光光谱模块入光口之间定位狭缝的大小，得到与上述荧光成像相同长、宽尺寸的微区，再将单色仪的中心波长设置成荧光样品发射峰的中心波长，利用SPCE显微荧光光谱模块的单色仪和光谱检测器采集与上述SPCE显微荧光成像相同大小微区的荧光光谱。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置，包括激发光模块、定向激发SPCE显微镜模块、SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块；

所述激发光模块发出的激发光束沿第一光路方向行进；

所述定向激发SPCE显微镜模块包括半波片、样品、物镜、二向色滤镜和反射镜；所述半波片和二向色滤镜在第一光路方向上依次布置，所述二向色滤镜可将沿第一光路方向入射的光调整至沿第二光路方向行进；所述物镜、样品在第二光路方向上依次布置；所述样品、物镜、二向色滤镜和反射镜在第三光路方向上依次布置，且反射镜可将沿第三光路方向入射的光调整至沿第四光路方向行进或调整至沿第五光路方向行进；

所述SPCE显微荧光成像模块包括成像用检测器，所述成像用检测器位于第四光路方向上；

所述SPCE显微荧光光谱模块包括在第五光路方向上依次布置的定位狭缝、单色仪和光谱检测器。

进一步地，所述激发光模块包括相互连接的激光器和光纤耦合器。

进一步地，所述定向激发SPCE显微镜模块还包括准直透镜、第一聚焦透镜和第二聚焦透镜，所述准直透镜、半波片、第一聚焦透镜和二向色滤镜在第一光路方向上依次布置；所述样品、物镜、二向色滤镜、第二聚焦透镜和反射镜在第三光路方向上依次布置。

其中，所述半波片用于将激发光的偏振性调整为p偏振。所述二向色滤镜为能够反射激发光并透过大于激发光波长的带通滤光片。

其中，所述物镜为高数值孔径的聚焦物镜，例如为60～100倍的显微镜物镜(例如为60倍或100倍)，或为相应的油镜。物镜的NA值比较大可以实现入射光角度的调节。

其中，所述反射镜可为全反射镜，即可100％将沿第三光路方向入射的发射光信号导入在第四光路方向上的SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，或导入在第五光路方向上的SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器。所述反射镜例如为90°可调式反射镜，可通过转动实现向第四光路方向或第五光路方向的切换。所述反射镜也可按比例将沿第三光路方向入射的发射信号分配导入在第四光路方向上的SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器和在第五光路方向上的SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器，例如SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块各50％，实现实时、同时探测成像和光谱信息。

一实施例中，所述样品的基底为溅射了金属纳米薄膜的盖玻片。

本发明所述的“光路方向”用于描述各部件的相对位置以及光的大致行进路线，不排除光在某一光路方向上可能产生发散、汇聚、聚焦、角度改变等现象。所述的在光路方向上“依次布置”指的是沿光的行进方向和到达顺序依次布置。

与现有的SPCE成像、光谱检测装置相比，本发明的基于SPCE的定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置具有如下优点：

1、基于SPCE的定向发射特性，以物镜作为耦合元件，激发光经半波片进行偏振性转换后经过高数值孔径的聚焦物镜的聚焦，以某一特定的表面等离子体共振角射入金属薄膜上的样品后，以同一物镜收集所有定向发射的荧光信号，定向激发和全收集大大提高了荧光信号的收集效率和检测灵敏度；

2、与棱镜构型的SPCE荧光成像与光谱装置收集的大范围信号相比，本发明是以物镜作为耦合器件，结合SPCE显微荧光光谱模块前大小可调的定位狭缝，可以实现样品更小范围，即微区尺度上的荧光成像与光谱信号的采集；

3、相同微区SPCE荧光成像和荧光光谱的采集方法简单。

4、基于SPCE的定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法及装置为检测复杂体系中感兴趣微区的低含量组分其成像和光谱提供了更加高效、可靠的手段。

附图说明

图1为本发明实施例的一种基于物镜耦合型的SPCE定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置的模块示意图。

图2为本发明实施例的一种基于物镜耦合型的SPCE定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置的结构示意图。

图3为本发明实施例中使用半波片将激发光调整为p偏振的示意图。

图4为本发明实施例中用于SPCE显微荧光光谱感兴趣微区选择的定位狭缝结构示意图。

图5为本发明实施例中使用SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机和SPCE显微荧光光谱模块的CCD光谱检测器得到的细胞样品成像图。

附图标记：激光器1，光纤耦合器2，准直透镜3，半波片4，第一聚焦透镜5，样品6，盖玻片6-1，金属薄膜6-2，样品6-3，物镜7，二向色滤镜8，第二聚焦透镜9，90°可调式全反射镜10，电子倍增CCD相机11，定位狭缝12，单色仪13，CCD光谱检测器14，计算机15。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行具体说明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“横”、“竖”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图中的立体图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，“第一”、“第二”等指示的顺序关系仅是为了便于描述本发明和简化描述，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例

请查阅图1和图2，为本实施例的一种基于物镜耦合型的SPCE定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置，其包括：激发光模块、定向激发SPCE显微镜模块、SPCE显微荧光成像模块、SPCE显微荧光光谱模块。

所述激发光模块包括相互连接的激光器1、光纤耦合器2；激发光模块发出的激发光束沿第一光路方向行进；

所述定向激发SPCE显微镜模块包括准直透镜3、半波片4、第一聚焦透镜5、样品6、物镜7、二向色滤镜8、第二聚焦透镜9、90°可调式全反射镜10；半波片4可以将激发光的偏振性调整为p偏振，如图3；样品6放置于样品台上，例如为“玻璃-金属薄膜-样品”，即样品的基底为溅射了金属纳米薄膜的盖玻片；二向色滤镜8为能够反射激发光并透过大于激发光波长的带通滤光片；

其中，准直透镜3、半波片4、第一聚焦透镜5、二向色滤镜8在第一光路方向上依次布置，且二向色滤镜8可将沿第一光路方向入射的光反射至沿第二光路方向行进；物镜7、样品6在第二光路方向上依次布置；样品6、物镜7、二向色滤镜8、第二聚焦透镜9、90°可调式全反射镜10在第三光路方向上依次布置，且90°可调式全反射镜10可将沿第三光路方向入射的光反射至沿第四光路方向行进或反射至沿第五光路方向行进。

所述SPCE显微荧光成像模块包括成像用检测器，本实施例中成像用检测器为电子倍增CCD相机(EMCCD)11，电子倍增CCD相机11通过C-mount接口连接至定向激发SPCE显微镜模块的右侧出光口，并位于第四光路方向上；

所述SPCE显微荧光光谱模块包括在第五光路方向上依次布置的定位狭缝12(如图4)、单色仪13和光谱检测器，本实施例中该光谱检测器为CCD光谱检测器14，CCD光谱检测器14通过C-mount接口连接至定向激发SPCE显微镜模块的左侧出光口；

通过定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10的左右转动，可100％将发射光信号导入位于第四光路方向的SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机11，或导入位于第五光路方向的SPCE显微荧光光谱模块的单色仪13、CCD光谱检测器14。

计算机15与激发光模块的激光器1、光纤耦合器2，SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机11以及SPCE显微荧光光谱模块的单色仪13和CCD光谱检测器14信号连接。

本实施例中，第一光路方向与第二光路方向垂直；第二光路方向与第三光路方向平行或部分重合但光的行进方向相反；第三光路方向与第四光路方向垂直；第三光路方向与第五光路方向垂直。以图2作为参照时，第一光路方向向右，第二光路方向向上，第三光路方向向下，第四光路方向向右，第五光路方向向左。但不以此为限。

利用本实施例的基于SPCE的定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置，进行相同微区荧光成像和荧光光谱的采集方法包括：

首先，通过激光器1选择需要的激发光波长，激光经光纤耦合器2耦合后沿第一光路方向进入定向激发SPCE显微镜模块，激光经准直透镜3准直为平行光束后，调节半波片4，得到的偏振性激发光经第一聚焦透镜5聚焦以及二向色滤镜8反射后沿第二光路方向行进，经过物镜7后到达样品6，并以特定的表面等离子体共振角射入样品6，调节光纤耦合器2的位置可以改变激发光在物镜7后焦平面的入射角度。偏振性激发光以特定的表面等离子体共振角射入样品6后激发金属表面等离子体，产生瞬逝场，激发目标物，发出的信号沿第三光路方向经由同一物镜7收集，经二向色滤镜8过滤和第二聚焦透镜9聚焦后，到达90°可调式全反射镜10。调节定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10将发射信号沿第四光路方向导入SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机11，移动样品台将样品6中的感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸并得到微区的荧光成像强度；

接着，旋转定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10将发射信号沿第五光路方向导入SPCE显微荧光光谱模块的CCD光谱检测器14，将单色仪13的中心波长设置为零，此时CCD光谱检测器14具有简单成像的功能，根据CCD光谱检测器14的成像功能，同时调节定向激发SPCE显微镜模块左侧出光口与SPCE显微荧光光谱模块入光口之间定位狭缝12的大小，得到与上述荧光成像相同长、宽尺寸的微区，再将单色仪13的中心波长设置成荧光样品发射峰的中心波长，利用SPCE显微荧光光谱模块的单色仪13和CCD光谱检测器14采集与上述SPCE显微荧光成像相同大小微区的荧光光谱。

显微荧光成像是以偏振性激发光定向激发位于金属纳米薄膜上的样品后得到的增强型SPCE显微荧光成像。

显微荧光光谱是以偏振性激发光定向激发位于金属纳米薄膜上的样品后得到的增强型SPCE显微荧光光谱。

样品6的SPCE显微荧光成像和光谱的微区尺寸等于定位狭缝12的长、宽分别与显微镜物镜的放大倍数的比值。

本实施例在使用时，通过调节激发光的偏振性、角度、定位狭缝12的大小以及90°可调式全反射镜10的旋转，从而实现激光定向激发后样品感兴趣微区增强型SPCE显微荧光成像和荧光光谱信息的采集。

具体地，选择“盖玻片-45nm Ag-10nm SiO₂-荧光量子点”样品(包括盖玻片6-1、金属薄膜6-2即45nm Ag、样品6-3即10nm SiO₂-荧光量子点，以下简称“玻璃-金属薄膜-QDs”)为例：

“玻璃-金属薄膜-QDs”样品任一微区SPCE显微荧光成像的采集：

将样品6置于定向激发SPCE显微镜模块的样品台上，通过激发光模块的激光器1，选择需要的激发光波长，激光经光纤耦合器2耦合后进入定向激发SPCE显微镜模块，调节光纤耦合器2的位置改变激发光在物镜7后焦平面的入射角度，激光经准直透镜3准直为平行光束后，调节半波片4，得到的偏振性激发光经第一聚焦透镜5聚焦以及二向色滤镜8反射后，以特定的表面等离子体共振角射入样品“玻璃-金属薄膜-QDs”，激发目标物，发出的荧光信号经由同一物镜7收集，经二向色滤镜8过滤以及第二聚焦透镜9聚焦后，调节定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机11，移动样品台将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸并得到微区的荧光成像强度；

“玻璃-金属薄膜-QDs”样品同一微区SPCE显微荧光成像和SPCE显微荧光光谱的采集：

将样品6置于定向激发SPCE显微镜模块的样品台上，通过激发光模块的激光器1，选择需要的激发光波长，激光经光纤耦合器2耦合后进入定向激发SPCE显微镜模块，调节光纤耦合器2的位置改变激发光在物镜7后焦平面的入射角度，激光经准直透镜3准直为平行光束后，调节半波片4，得到的偏振性激发光经第一聚焦透镜5聚焦以及二向色滤镜8反射后，以特定的表面等离子体共振角射入样品“玻璃-金属薄膜-QDs”，激发目标物，发出的荧光信号经由同一物镜7收集，经二向色滤镜8过滤以及第二聚焦透镜9聚焦后，调节定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的电子倍增CCD相机11，移动样品台将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸并得到微区的荧光成像强度；旋转定向激发SPCE显微镜模块的90°可调式全反射镜10将发射信号导入SPCE显微荧光光谱模块的CCD光谱检测器14，将单色仪13的中心波长设置为零，此时CCD光谱检测器具有简单成像的功能，根据CCD光谱检测器的成像功能，同时调节定向激发SPCE显微镜模块左侧出光口与SPCE显微荧光光谱模块入光口之间定位狭缝12的大小，得到与上述荧光成像相同长、宽尺寸的微区，再将单色仪的中心波长设置成荧光样品发射峰的中心波长，利用SPCE显微荧光光谱模块的单色仪13和CCD光谱检测器14采集与上述SPCE显微荧光成像相同大小微区的荧光光谱，最终实现样品同一微区的SPCE显微荧光成像与光谱的采集。如图5。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (9)

1.一种基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测方法，其特征在于：所述检测方法采用的检测装置包括激发光模块、定向激发SPCE显微镜模块、SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块；所述定向激发SPCE显微镜模块包括半波片、样品、物镜、二向色滤镜和反射镜；所述SPCE显微荧光成像模块包括成像用检测器；所述SPCE显微荧光光谱模块包括定位狭缝、单色仪和光谱检测器；

所述检测方法包括：

所述激发光模块发出的激发光束经过半波片，得到的偏振性激发光经二向色滤镜反射后到物镜中聚焦，并以表面等离子体共振角射入样品，激发金属表面等离子体，产生瞬逝场，激发目标物，发射信号经由物镜收集，经过二向色滤镜过滤后聚焦到反射镜；

调节反射镜将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，移动样品将感兴趣微区移至成像中心区域，圈出感兴趣微区，读取其长、宽尺寸以及荧光成像强度；

调节反射镜将发射信号导入SPCE显微荧光光谱模块的光谱检测器，将单色仪的中心波长设置为零，利用光谱检测器的成像以及SPCE显微荧光光谱模块中前置的定位狭缝的微区选择功能，得到与荧光成像相同长、宽尺寸的微区，再将单色仪的中心波长设置成荧光样品发射峰的中心波长，利用SPCE显微荧光光谱模块的单色仪和光谱检测器采集与上述SPCE显微荧光成像相同大小微区的荧光光谱。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述半波片用于将激发光的偏振性调整为p偏振。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述样品的基底为溅射了金属纳米薄膜的盖玻片。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述样品的SPCE显微荧光成像和光谱的微区尺寸等于定位狭缝的长、宽分别与物镜的放大倍数的比值。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述二向色滤镜为能够反射激发光并透过大于激发光波长的带通滤光片。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述反射镜可100％将发射信号导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，或导入SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器；或者，所述反射镜可按比例将发射信号分配导入SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器和SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器。

7.一种基于物镜耦合型的表面等离子体耦合发射定向增强型显微荧光成像与光谱检测装置，其特征在于：包括激发光模块、定向激发SPCE显微镜模块、SPCE显微荧光成像模块和SPCE显微荧光光谱模块；

所述激发光模块发出的激发光束沿第一光路方向行进；

所述定向激发SPCE显微镜模块包括半波片、样品、物镜、二向色滤镜和反射镜；所述半波片和二向色滤镜在第一光路方向上依次布置，所述二向色滤镜可将沿第一光路方向入射的光调整至沿第二光路方向行进；所述物镜、样品在第二光路方向上依次布置；所述样品、物镜、二向色滤镜和反射镜在第三光路方向上依次布置，且反射镜可将沿第三光路方向入射的光调整至沿第四光路方向行进或调整至沿第五光路方向行进；

所述SPCE显微荧光成像模块包括成像用检测器，所述成像用检测器位于第四光路方向上；

所述SPCE显微荧光光谱模块包括在第五光路方向上依次布置的定位狭缝、单色仪和光谱检测器。

8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：所述定向激发SPCE显微镜模块还包括准直透镜、第一聚焦透镜和第二聚焦透镜，所述准直透镜、半波片、第一聚焦透镜和二向色滤镜在第一光路方向上依次布置；所述样品、物镜、二向色滤镜、第二聚焦透镜和反射镜在第三光路方向上依次布置。

9.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：所述激发光模块包括相互连接的激光器和光纤耦合器；所述半波片用于将激发光的偏振性调整为p偏振；所述样品的基底为溅射了金属纳米薄膜的盖玻片；所述二向色滤镜为能够反射激发光并透过大于激发光波长的带通滤光片；所述反射镜可100％将沿第三光路方向入射的发射信号导入在第四光路方向上的SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器，或导入在第五光路方向上的SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器，或者所述反射镜可按比例将沿第三光路方向入射的发射信号分配导入在第四光路方向上的SPCE显微荧光成像模块的成像用检测器和在第五光路方向上的SPCE显微荧光光谱模块的单色仪及光谱检测器；所述反射镜通过转动实现向第四光路方向或第五光路方向的切换。

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