CN103344620B - 双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及方法，涉及一种荧光成像检测。所述装置设有样品系统、入射臂系统和检测臂系统；所述样品系统包括双旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底；所述双旋转台设有上旋转台、下旋转台和中心轴，所述入射臂系统设有激光光源、衰减器、起偏器、显微物镜、针孔、平凸透镜、方形可变光阑和第一光学导轨；所述检测臂系统设有滤光片、成像透镜、CCD接收器和第二光学导轨。调节入射臂系统中的方形可变光阑的尺寸获得大小合适的矩形入射光斑；选择RK模式的SPCE成像的检测；选择KR模式的SPCE成像的检测。可有效避免在单一的RK模式下，当荧光信号太弱时较难检测的问题。

Description

双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及方法

技术领域

本发明涉及一种荧光成像检测，尤其是涉及一种双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置及检测方法。

背景技术

由于具有高的灵敏度，荧光分析技术在现代生化研究与疾病诊断等领域具有广泛的应用。然而，为了检测低浓度或复杂基底下的分析物，人们仍致力于发展新型荧光技术及仪器，以进一步提高荧光的灵敏度。表面等离子体耦合发射荧光法(Surface Plasmon CoupledEmission,SPCE)由于具有荧光增强，定向发射，高度偏振性，距离敏感性，光谱分辨和背景抑制等独特性质，逐渐引起科研工作者的兴趣。SPCE的原理为：处于光滑纳米金属表面200nm范围的激发态荧光团与金属表面的等离子体耦合作用后，以荧光发射波长对应的SPCE角(即θ_SPCE)进入棱镜基体辐射。而在自由空间(Free Space,FS)发射中，由于荧光发射在空间上是各向同性的，所检测到的信号不足总荧光强度的1％，与之相比，SPCE的荧光收集效率可达到50％。

根据样品激发方式的不同，SPCE可分为克莱彻曼模式(Kretschmann模式，即KR模式)和反式克莱彻曼模式(Reverse Kretschmann模式，即RK模式)。在KR模式中，入射光由棱镜一侧以表面等离子体激发角度入射到金属膜表面，引发表面等离子体，产生瞬逝场，从而激发金属表面的荧光团样品膜，激发态的荧光团与金属表面的等离子体发生耦合作用后，通过棱镜定向辐射。在RK模式中，入射光直接照射到荧光团样品膜，近表面的激发态荧光团和金属3表面的等离子体发生耦合作用并通过棱镜定向辐射。因此，在SPCE中，激发态的荧光团与金属表面的作用，与激发方式无关。

SPCE自提出以来，研究方向主要为荧光机理研究、金属基底优化、仪器结构设计、分析应用检测等方面，本申请人在专利号为200910111882.8的中国专利中公开一种表面等离子体耦合荧光检测装置，是一种结构简单、易于实验室操作和推广的SPCE荧光光谱检测装置。近年来，基于SPCE的成像研究也获得了极大的关注。在SPCE中，将棱镜替换成物镜，也可实现SPCE检测。大多数的SPCE成像研究主要是基于物镜型结构的装置，由于物镜型装置价格极其昂贵，操作复杂，设计繁琐，加工复杂且波长适用范围窄，因此，本申请人又在公开号为CN102539404A的中国专利中公开一种定向发射荧光成像检测装置，是一种基于棱镜构型的RK模式SPCE成像检测装置。与物镜型的SPCE成像装置对比，基于棱镜构型的RK模式SPCE成像装置，入射光直接照射样品表面，无需KR模式中的精密调整入射角度，装置结构简单、成本低廉、操作简便，波长检测适用范围更广，能检测到的有效成像区域更大，在中高密度的微阵列芯片检测中具有独特的优势。然而，上述基于棱镜构型的RK模式SPCE成像装置，也存在以下不足之处：该成像装置模式单一，功能简单，由于其入射光路固定，入射光角度无法改变，因此仅能进行RK模式的SPCE成像。而在RK模式中，其荧光的增强主要是来自于收集效率的提高，目前报道的RK模式的SPCE成像荧光增强效果差强人意(仅约为2倍)，应用于低浓度及复杂基底存在下的生物样品检测时，由于荧光信号太弱，常常遇到较大的瓶颈和挑战。与RK模式相比，KR模式的SPCE除了荧光收集效率的提高外，由于瞬逝场激发作用的参与，增强了激发荧光团的能量，因而有更好的荧光增强效果。但KR模式SPCE成像检测，只有以表面等离子体激发角入射的激发光才能引发表面等离子体产生瞬逝场，因此需调整入射光的角度；同时，激发光及其反射光与发射光的角度差较小，需要采用高性能的滤光片去除激发光或其反射光的干扰，因此，在单一模式下，无论是KR模式或者RK模式的SPCE成像装置，在研究和应用中都常常遇到较大的瓶颈和挑战，限制SPCE成像技术的推广。

发明内容

本发明的目的旨在克服上述现有检测装置存在的缺点，综合考虑KR和RK两种模式SPCE各自的优势与不足，提供一种基于棱镜构型，可实现不同模式下成像检测的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置。

本发明的另一目的旨在提供一种双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测方法。

通过所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置既可以进行RK模式的SPCE成像检测，也可实现KR模式下的SPCE成像检测，有效地发挥KR和RK模式SPCE的各自优势，避免了单一模式时存在的问题。

本发明所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置设有样品系统、入射臂系统和检测臂系统；

所述样品系统包括双旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底；所述双旋转台设有上旋转台、下旋转台和中心轴，上旋转台和下旋转台均套在中心轴外；中心轴与外部光学平台连接，样品架固于中心轴上端；棱镜置于样品架上；光学石英基底设于棱镜底边上，光学石英基底表面设有纳米级金属薄膜层，纳米级金属薄膜层表面设有荧光传感膜，光学石英基底与棱镜之间之间涂有光学常数与两者匹配的溶液；

所述入射臂系统设有激光光源、衰减器、起偏器、显微物镜、针孔、平凸透镜、方形可变光阑和第一光学导轨；所述激光光源、衰减器、起偏器、显微物镜、针孔、平凸透镜和方形可变光阑由外向内依次排列且均设于光学导轨上；入射臂系统通过第一光学导轨固于上旋转台；

所述检测臂系统设有滤光片、成像透镜、CCD接收器和第二光学导轨；所述滤光片、成像透镜和CCD接收器由内向外依次排列且固于第二光学导轨上，检测臂系统通过第二光学导轨固于下旋转台上。

所述激光光源可采用固体激光器，所述固体激光器可采用波长为405nm、473nm、488nm、532nm或694.3nm等的固体激光器，功率可为50～500mW。

所述显微物镜的倍数可为(25～40)倍。

所述针孔的直径可为0.015～0.025mm。

所述方形可变光阑的光阑大小可为(0.1～12)mm×(0.1～12)mm。

所述荧光传感膜可采用罗丹明B荧光传感膜(RhB-PVA膜)等。

所述棱镜可采用等腰直角三角棱镜。

所述光学常数与两者匹配的溶液可采用甘油等。

所述上旋转台下端最好连接有上转接板，所述中心轴最好呈凸字形，上转接板与中心轴的凸肩固连；所述下旋转台下端最好连接有下转接板；下转接板固于外部的光学平台上；所述中心轴下端固于下转接板上，中心轴通过下转接板与外部光学平台连接。

本发明所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测方法，采用本发明所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，包括以下步骤：

1)调节入射臂系统中的方形可变光阑的尺寸获得大小合适的矩形入射光斑；

2)选择RK模式的SPCE成像的检测：通过上旋转台的旋转调整入射臂系统的角度从而使矩形光斑直接照射在棱镜表面的样品膜上，在棱镜另一侧产生定向发射；通过下旋转台的旋转调整检测臂的角度，即可通过CCD检测器采集不同角度下RK模式SPCE的荧光发射信号，并以图像格式存储，通过软件处理实现数据分析；

3)选择KR模式的SPCE成像的检测：通过上旋转台的旋转选择合适的入射角度，使矩形入射光斑在棱镜一侧以表面等离子激发角度入射，引发表面等离子体产生瞬逝场激发样品，再通过下旋转台的旋转调整检测臂在棱镜一侧的检测角度获得KR模式SPCE不同角度下的荧光图像，采集到的图像通过软件处理实现数据分析。

本发明的工作原理如下：

入射臂系统可随上旋转台旋转，可实现以不同的入射角度激发样品；激光光源发出的激光通过衰减器、起偏器、显微物镜、针孔和平凸透镜后，成为光强分布均匀、P偏振的平行光束，平行光束依次通过方形可变光阑，得到大小合适的矩形入射光斑。检测臂系统可随下旋转台旋转，可实现入射臂系统不同入射角度激发样品时的图像数据采集。

与现有的表面等离子体耦合发射荧光成像的检测装置及其检测方法对比，本发明具有如下突出优点：

本发明通过棱镜耦合方式，可灵活的实现RK模式与KR模式的SPCE成像检测。与物镜型的SPCE成像装置对比，本发明利用棱镜代替价格昂贵的高数值孔径物镜或制作复杂的抛物面元件，不仅降低了成本，而且适用于不同发射波长染料的检测，此外，可对待测样品的较大区域实现同时的成像检测，在中高密度的微阵列芯片检测中具有无可比拟的优势；而与基于棱镜构型的RK模式SPCE成像检测装置相比，本发明不仅可以实现之前的RK模式的成像检测，也可实现KR模式的SPCE成像检测。两种模式下的成像检测，不仅有利于SPCE成像机理理论的进一步探索与发展，而且在实际应用中，可有效的避免在单一的RK模式下，当荧光信号太弱时较难检测的问题。

附图说明

图1为本发明实施例所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置的结构示意图。

图2为本发明实施例KR模式表面等离子耦合发射荧光成像的结构组成示意图。在图2中，θ₁为表面等离子体激发角度，θ为表面等离子体耦合发射荧光的定向荧光发射角度，空心箭头表示入射臂和检测臂能以样品为中心，随相应的旋转台转动。

图3为本发明实施例RK模式表面等离子耦合发射荧光成像的结构组成示意图。在图3中，θ为表面等离子体耦合发射荧光的定向荧光发射角度，空心箭头表示入射臂和检测臂能以样品为中心，随相应的旋转台转动。

图4为本发明实施例在KR模式检测过程中，FS的荧光成像信号随入射光斑角度变化的强度分布图。在图4中，横坐标为荧光检测角度(°)，纵坐标为相对荧光强度，θ₁为表面等离子体激发角度即最佳激发角度为56°。

图5为本发明实施例在KR模式检测过程中，以表面等离子体激发角度56°入射时，SPCE的荧光成像信号随检测角度变化的荧光强度角分布极坐标图。在图5中，极坐标为荧光检测角度(°)，纵坐标为相对荧光强度，θ₁为表面等离子体激发角度即入射角度56°，而θ为表面等离子体耦合发射荧光的定向荧光发射角度。结果显示，检测角度为52°即θ时，荧光信号最强，该角度为KR模式的最佳检测角度。

图6为本发明实施例在RK模式检测过程中，SPCE的荧光成像信号随检测角度变化的荧光强度角分布极坐标图。在图6中，极坐标为荧光检测角度(°)，纵坐标为相对荧光强度，θ为表面等离子体耦合发射荧光的定向荧光发射角度。结果显示，检测角度为52°即θ时，荧光信号最强。

图7为本发明实施例在KR模式下所检测到的荧光信号。以荧光染料微阵列为检测样品，以表面等离子体激发角度即入射角度56°入射，在最佳荧光发射角度，即θ检测角度52°时，CCD积分时间为0.5秒所采集到的荧光图像。

图8为本发明实施例在RK模式下所检测到的荧光信号。以荧光染料微阵列为检测样品，以与KR模式相同功率密度的入射角度入射时，在最佳荧光发射角度，即θ检测角度52°时，CCD积分时间为3秒所采集到的荧光图像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

如图1～3所示，本实施例所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置设有样品系统、入射臂系统和检测臂系统。

所述样品系统包括双旋转台、样品架8、棱镜9和光学石英基底18。所述双旋转台如图1所示，为上下层同轴结构，包括下转接板1、下旋转台2、上转接板3、上旋转台4和“凸”型结构的中心轴5。上旋转台4通过上转接板3固定于中心轴5的中部凸肩位置，从而确保上下两个旋转台为同心结构。下旋转台2通过下转接板1固定于外部的光学平台(未画出)上，中心轴5底端通过下转接板1固于外部的光学平台上。上旋转台4通过上转接板3固定于中心轴5的中部凸肩位置，从而确保上下两个旋转台为同心结构。通过手动可分别旋转上旋转台4或下旋转台2，这样上旋转台4、下旋转台2可围绕中心轴5独立旋转。上旋转台4用于固定入射臂系统，下旋转台2用于固定检测臂系统。所述样品架8通过二维平移台7和其相应的底座6固定于中心轴5的上端。在入射臂系统和检测臂系统角度调节过程中，样品架8位置保持不动，所述棱镜9固定于样品架8上；如图2和3所示，所述光学石英基底18表面设有纳米级金属薄膜19，所述纳米级金属薄膜19表面设有荧光传感膜20；所述光学石英基底19与棱镜9之间涂有光学常数与两者匹配的溶液(采用甘油)。

所述入射臂系统设有激光光源10、衰减器11、起偏器12、显微物镜13、针孔14、平凸透镜15、方形可变光阑16和第一光学导轨17；所述激光光源10、衰减器11、起偏器12、显微物镜13、针孔14、平凸透镜15和方形可变光阑16由外向内依次排列且均设于第一光学导轨17上；入射臂系统通过第一光学导轨17固于上旋转台4。上旋转台4，以样品架8为中心，可随上旋转台4转动，从而可以不同的入射角度激发样品。所述激光光源10发出的激发光通过衰减器11、起偏器12、显微物镜13、针孔14和平凸透镜15后，成为光强分布均匀、P偏振的平行光束，所述平行光束依次通过方形可变光阑16，得到大小合适的矩形入射光斑；

所述检测臂系统固定于下旋转台2，可随下旋转台2旋转，用于样品在不同发射角度下的图像数据采集。检测臂系统设有滤光片21、成像透镜22和CCD接收器23，上述元件固定在第二光学导轨24上面。

所述激光光源10采用固体激光器，固体激光器采用波长为532nm的固体激光器，固体激光器的功率为250mw。所述显微物镜13为40倍物镜。所述针孔14的直径为φ0.025mm。所述方形可变光阑16的光阑的大小为7mm×7mm。所述棱镜9采用等腰直角三角棱镜。

所述纳米级金属薄膜19采用真空溅射法制备，具体方法如下：在洁净的石英基底表面溅射厚度为2nm的铬膜作为粘附层，再溅射厚度为50nm的银膜，在银膜表面溅射5nm的二氧化硅薄膜作为保护层，防止银膜被氧化，即得纳米级光滑金属薄膜19。

所述荧光传感膜20采用旋涂法制备，具体方法如下：在纳米级光滑金属薄膜19表面旋转镀膜上含有罗丹明B的PVA膜，结合光漂白方法，制备得到所需的荧光传感膜20。

本实施例所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测方法，采用本实施例所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，以罗丹明B荧光传感膜(RhB-PVA膜)为检测对象，具体包括以下步骤：

采用RK模式的SPCE成像检测时，入射光只须直接照射样品表面，因此入射臂与样品表面的角度可为0～180°之间的任一角度。如图3所示，调整上旋转台4，使入射臂的矩形光斑直接照射荧光传感膜20表面，在棱镜9另一侧产生SPCE。通过改变下旋转台2的角度，CCD检测器23即可实现不同角度下的荧光发射信号的采集，采集后的图像用Image J处理，获取各个图像的信号强度并加以分析。而KR模式的SPCE成像检测，入射臂需以θ₁角度入射，才可产生SPCE。因此，先调整下旋转台2的角度，使CCD接收器23收集荧光传感膜20的空间自由发射FS的荧光信号。调整上旋转台4，使入射臂的矩形光斑通过棱镜9以表面等离子激发角入射，该角度的控制可通过分析CCD接收器23收集的FS成像角度分布结果实现。当以表面等离子激发角入射时，所收集到的荧光信号最强。如图2所示，固定入射角度为表面等离子激发角度后，改变下旋转台2的角度，CCD检测器23即可实现不同角度下的荧光发射信号的采集，实现KR模式的SPCE成像检测。图像数据通过软件分析处理。

以本发明所述基于基于棱镜构型的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置进行罗丹明B荧光传感膜20的KR模式下与RK模式下的SPCE成像检测。在KR模式中，在FS方向采集不同激发角度下的荧光信号并加以分析，结果如图4所示，当以56°的角度入射时，得到的荧光信号最强，即该体系下，进行KR模式SPCE成像检测光源所需的表面等离子激发角为56°。固定入射角度为56°后，采集不同检测角度下所获取的荧光成像信号。结果如图5显示，在检测角度为52°时，荧光发射信号最强，具有显著的信号角度分布。同样的，在RK模式中，采集不同检测角度下所获取的荧光成像信号，结果如图6所示，RK模式的最佳检测角度为52°。

此外，对同一荧光染料微阵列样品，分别采集KR模式SPCE与RK模式SPCE各自最佳检测角度下的荧光图像。图7为KR模式中，在入射角度为56°，检测角为52°时，CCD积分时间为0.5秒所检测到的SPCE成像，图8为RK模式中，以与KR模式相同功率密度的入射角度入射，检测角为52°时，积分时间为3秒时所检测到的SPCE成像。从图中可知，与RK模式的SPCE相比，KR模式的SPCE可获得更强的荧光信号，因此，为获得较强的成像信号，在RK模式中，CCD检测器需要使用更长的积分时间；而在实现方式上，与KR模式的SPCE成像相比，RK的SPCE成像则更为简单，更容易实现，因此，该装置通过灵活的角度控制，可实现不同模式下的成像检测，可有效的发挥KR和RK模式SPCE的各自优势。

Claims (9)

1.双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于设有样品系统、入射臂系统和检测臂系统；

样品系统包括双旋转台、样品架、棱镜和光学石英基底；所述双旋转台设有上旋转台、下旋转台和中心轴，上旋转台和下旋转台均套在中心轴外；中心轴与外部光学平台连接，样品架固于中心轴上端；棱镜置于样品架上；光学石英基底设于棱镜底边上，光学石英基底表面设有纳米级金属薄膜层，纳米级金属薄膜层表面设有荧光传感膜，光学石英基底与棱镜之间之间涂有光学常数与两者匹配的溶液；

入射臂系统设有激光光源、衰减器、起偏器、显微物镜、针孔、平凸透镜、方形可变光阑和第一光学导轨；激光光源、衰减器、起偏器、显微物镜、针孔、平凸透镜和方形可变光阑由外向内依次排列且均设于光学导轨上；入射臂系统通过第一光学导轨固于上旋转台；

检测臂系统设有滤光片、成像透镜、CCD接收器和第二光学导轨；滤光片、成像透镜和CCD接收器由内向外依次排列且固于第二光学导轨上，检测臂系统通过第二光学导轨固于下旋转台上；

所述棱镜采用等腰直角三角棱镜。

2.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述激光光源采用固体激光器，固体激光器的波长为405nm、473nm、488nm、532nm或694.3nm，功率为50～500mw。

3.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述显微物镜的倍数为25～40倍。

4.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述针孔的直径为0.015～0.025mm。

5.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述方形可变光阑的光阑大小为(0.1～12)mm×(0.1～12)mm。

6.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述荧光传感膜采用罗丹明B荧光传感膜。

7.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述光学常数与两者匹配的溶液采用甘油。

8.如权利要求1所述的双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，其特征在于所述上旋转台下端连接有上转接板，所述中心轴呈凸字形，上转接板与中心轴的凸肩固连；所述下旋转台下端连接有下转接板；下转接板固于外部的光学平台上；所述中心轴下端固于下转接板上，中心轴通过下转接板与外部光学平台连接。

9.双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测方法，其特征在于采用如权利要求1所述双模式表面等离子体耦合发射荧光成像检测装置，所述方法包括以下步骤：

1)调节入射臂系统中的方形可变光阑的尺寸获得大小合适的矩形入射光斑；

2)选择RK模式的SPCE成像的检测：通过上旋转台的旋转调整入射臂系统的角度从而使矩形光斑直接照射在棱镜表面的样品膜上，在棱镜另一侧产生定向发射；通过下旋转台的旋转调整检测臂的角度，即可通过CCD检测器采集不同角度下RK模式SPCE的荧光发射信号，并以图像格式存储，通过软件处理实现数据分析；

3)选择KR模式的SPCE成像的检测：通过上旋转台的旋转选择合适的入射角度，使矩形入射光斑在棱镜一侧以表面等离子激发角度入射，引发表面等离子体产生瞬逝场激发样品，再通过下旋转台的旋转调整检测臂在棱镜一侧的检测角度获得KR模式SPCE不同角度下的荧光图像，采集到的图像通过软件处理实现数据分析。