CN104502326B - 一种增强sers信号的定量分析方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种增强SERS信号的定量分析方法，包括以下步骤：(1)在基片上钻圆锥孔或圆柱‑圆锥孔；圆柱‑圆锥孔是在圆锥孔的上方连接圆柱孔，且圆锥孔一端与圆柱孔一端相接；(2)在钻有步骤(1)所述孔的基片表面沉积纳米颗粒，得到增强基底；(3)利用增强基底结合内标法获取校正样本的SERS光谱数据；(4)在校正样本的SERS光谱数据与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型；(5)利用增强基底结合内标法获取待测样本的SERS光谱x_test；采用校正模型计算出待测样本中待测物质的浓度。本发明的增强SERS信号的定量分析方法相比于平面增强基底，增强效果要强5～10倍，可以应用在痕量物质定量分析中。

Description

一种增强SERS信号的定量分析方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种增强SERS信号的定量分析方法，及其在痕量物质定量分析中的应用，属于分析测试领域。

背景技术

表面增强拉曼散射(SERS，Surface Enhancement of Raman Scattering)效应是指在特殊制备的一些金属良导体表面或溶胶中，在激发区域内，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致吸附分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强的现象。目前在学术界普遍认同的SERS机理分为两类：电磁效应和化学效应。电磁效应是由于金属表面与激发光的相互作用使分析物电场强度增大的结果。表面等离子体共振引起的局部电磁场增强被认为是最主要的贡献，表面等离子体是金属中的自由电子在光电场下发生集体性的振荡效应。化学效应是由于分析物与金属波函数重叠而发生。当分子化学吸附于基底表面时，表面、表面吸附原子和其它共吸附物种等都可能与分子有一定的化学作用，这些因素对分子的电子密度分布有直接的影响，即对体系极化率的变化影响其拉曼强度[Journal ofChemical Physics Letters,1974,26(2):163-166；Advanced Functional Materials,2013,23(35):4332-4338]。不论考虑哪种增强机制，为了得到大的增强，金属表面必须具有合适的粗糙程度。目前表面增强拉曼光谱在体外的检测分析主要有两种方法：干法和湿法。干法SERS检测[Analytical Chemistry,1995,67(4):735-743；Langmuir,2002,18(18):6839-6844；Analyst,2013,138(4):1020-1025；RSC Advances,2014,4(25):12995-13000]是将待测样本溶液滴加在沉积了金或银纳米颗粒的SERS基底上，蒸发掉溶剂后，直接将激光光束聚焦到有目标分析物的区域，从而获得其表面增强拉曼光谱。该方法的SERS增强基底一般具有良好的重现性，并且使用比较方便，适合于大批量样本的分析检测。然而，在检测过程中，激光光束会产生局部加热问题，干法中激光光束是直接照射在目标分析物上的，如果激光功率过高，样品很有可能会被烧毁或变性，因而干法SERS检测一般使用相对较低的激光功率，这势必就会降低对待测物质的检测灵敏度。湿法SERS检测[Langmuir,2013,29(6):1908-1919；Chemical Communications,2013,49(1):30-32；ChemicalCommunications,2014,50(9):1058-1060；Journal of Materials Chemistry C,2014,2(35):7326-7335]是先将待测溶液和银或金纳米溶胶颗粒相混合，然后将混合液滴加到一个小反应杯中或用点样毛细管直接吸取混合液，激发光将透过小反应杯壁或毛细管壁聚焦到溶液中，从而获得待测物质的表面增强拉曼光谱。在湿法SERS检测中，大部分激光光束所产生的热量被溶剂所吸收，从而避免了待测物质因局部过热而受损。因而可以使用相对较高的激光功率，提高对待测物质的检测灵敏度。但湿法SERS检测受金或银溶胶的粒径大小、形状以及聚集度等影响比较大，所以重复性相对较差；另外，当需对大批量的样本进行分析时，湿法SERS检测不及干法SERS检测方便。

发明内容

本发明为解决传统干法和湿法SERS检测的缺点，提供一种增强SERS信号的定量分析方法，以及该方法在痕量物质定量分析中的应用。

本发明的技术方案是，提供所述增强SERS信号的定量分析方法，包括以下步骤：

(1)在基片上钻圆锥孔或圆柱-圆锥孔；所述圆柱-圆锥孔是在圆锥孔的上方连接圆柱孔，且圆锥孔一端与圆柱孔一端相接；

(2)在钻有步骤(1)所述孔的基片表面沉积纳米颗粒，得到增强基底；

(3)利用所述增强基底结合内标法获取校正样本的SERS光谱数据；

(4)在校正样本的SERS光谱数据与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型；

(5)利用所述增强基底结合内标法获取待测样本的SERS光谱x_test；采用所述校正模型计算出待测样本中待测物质的浓度。

进一步地，所述圆锥孔的孔径和高度能使垂直基片入射的激发光在圆锥孔内发生全反射。

进一步地，所述基片为玻璃片或硅片。

进一步地，所述纳米颗粒为金纳米溶胶颗粒(AuNP)或银纳米溶胶颗粒(AgNP)。

进一步地，利用乘子效应模型在校正样本的SERS光谱信号与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型；所述乘子效应模型为：x_k＝b_k×(c_IS,k·r_IS+c_target,k·r_target)+d_k，其中，(k＝1,2,…,K)，x_k代表第k个样本的SERS光谱；c_IS,k和c_target,k分别代表第k个样本中内标物质和待测物质的浓度；r_IS和r_target分别代表内标物质和待测物质的分子散射特性；非乘子参数d_k代表由于背景干扰和增强基底物理性质变化对第k个校正样本SERS光谱信号产生的非乘子效应；乘子参数b_k代表由于SERS基底物理性质以及激光光源的功率和聚焦位置的变化对第k个校正样本SERS光谱信号强度产生的乘子效应。

上述乘子效应模型的基本原理是利用陈增萍及其合作者发明的如下表面增强拉曼光谱定量分析乘子效应模型—MEM_SERS(“一种具有普适性的表面增强拉曼光谱定量分析技术”，中国专利号：ZL201210243634.0)在校正样本的SERS光谱信号与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型。本发明的上述发明专利中乘子效应模型其进行了简化处理，使其可以更方便的应用。

进一步地，采用所述校正模型计算出待测样本中待测物质的浓度包括以下步骤：

(1)从校正样本的SERS光谱数据中计算出校正样本的乘子参数b_k，(k＝1,2,…,K)；

(2)在x_k和b_k之间建立校正模型b_k＝α₁+x_kβ₁；在x_k和b_k×c_target,k之间建立校正模型b_k×c_target,k＝α₂+x_kβ₂，用多元线性回归方法计算校正模型中的参数α₁、β₁、α₂和β₂；所述多元线性回归方法可以是偏最小二乘回归法。

(3)计算样本中待测物质浓度，即c_test＝(α₂+x_testβ₂)/(α₁+x_testβ₁)。

本发明进一步提供所述的定量分析方法在痕量物质定量分析中的应用。

本发明中设计并制备了圆锥孔(图1)和圆柱-圆锥孔(图2)玻璃板增强基底(简称‘玻璃板基底’)，其中，圆柱-圆锥孔是圆柱孔和圆锥孔的组合孔，是在圆锥孔的上方连接圆柱孔，且圆锥孔一端与圆柱孔一端相接。本发明并将其应用到复杂体系的表面增强拉曼光谱定量分析。在该基底上进行干法或湿法SERS检测，获得的SERS信号要明显强于在平面玻璃板基底和点样毛细管中所获得的SERS信号，同时避免了传统干法和湿法SERS检测的缺点。在本发明中，我们测试了4-巯基吡啶在不同孔径和高度的圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底上的SERS光谱信号，并在此基础上确定了具有最佳SERS增强效果的圆锥孔玻璃板的孔径参数，最后成功将最佳孔径的圆锥孔玻璃板基底与表面增强拉曼光谱定量分析乘子效应模型(MEM_SERS)相结合实现了血浆样中的免疫抑制药物——6-巯基嘌呤的准确SERS定量分析。

本发明从圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板SERS基底(SERS)出发，考察了它们相对于平面玻璃板和毛细管的SERS增强效果，并将其与实验室发展的MEM_SERS模型相结合，用于提高复杂体系中待测物质的SERS检测的灵敏度和定量分析结果的精确度。

本发明设计的圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底的SERS增强效果明显优于平面玻璃板基底和点样毛细管；使用圆锥孔或圆柱-圆锥孔基底所检测的样本SERS光谱具有良好的重现性。经过对孔径和高度的优化，我们获得了具最佳增强效果的圆锥孔玻璃板基底；将其与MEM_SERS模型相结合，能有效提高对待测物质定量分析的检测灵敏度和定量结果的准确度。

本发明采用MEM_SERS模型在待测物质的校正样本SERS光谱与其浓度之间建立校正模型；乘子效应模型将SERS增强基底的物理性质变化对样本SERS光谱信号产生的乘子效应与由于背景干扰和增强基底的物理性质变化对样本SERS光谱信号产生的非乘子效应进行了分离，并采用OPLEC_m来估计校正样本SERS光谱中乘子效应参数值。

本发明采用‘双校正模型’策略来消除SERS基底的物理性质以及激光光源功率和聚焦位置的变化对待测样本SERS光谱产生的乘子效应。

本发明除了需要校正样本SERS光谱和校正样本中待测物质浓度的信息外，没有其他苛刻的要求。

本发明设计了16种不同孔径和高度的圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底(图1、图2和表1)。比较相同浓度的4-巯基吡啶的乙醇溶液在不同孔径和高度的圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板SERS基底上的SERS光谱信号强度(表2)可得出：孔径为3.4mm和高度为2mm的圆锥孔玻璃板基底的SERS增强效果最佳。将其与MEM_SERS模型相结合对血浆样本中6-巯基嘌呤的含量进行了定量分析，获得了令人满意的结果(表3)。因此，本发明提出的基于圆锥孔玻璃板SERS增强基底与MEM_SERS模型相结合的分析方法在药物检测、环境分析和医药分析等领域中的目标分析物的快速检测方面具有广泛的应用前景。

由以上描述可知，本发明为一种基于圆锥孔玻璃板增强基底的SERS光谱分析方法，适用于干法和湿法SERS检测，并克服了现有干法和湿法检测的缺点。相比于平面增强基底，圆锥孔增强基底的增强效果要强5～10倍。将最优孔径和高度的圆锥孔玻璃基底与MEM_SERS模型相结合能有效提高SERS定量分析精确度和灵敏度。

与现有同类技术相比，本发明所具有如下技术效果：本发明设计的圆锥孔玻璃板基底的SERS增强效果明显的优于平面玻璃板基底和点样毛细管；本发明的圆锥孔玻璃板基底既适用于干法SERS检测，也适用于湿法SERS检测；本发明的圆锥孔玻璃板基底使用一次后，经过简单的清洗后可重复使用；本发明与MEM_SERS模型相结合能实现复杂体系中待测物质的灵敏、准确的SERS定量分析。

附图说明

图1为本发明设计的内嵌圆锥孔的玻璃板的示意图。

图2为本发明设计的内嵌圆柱-圆锥孔玻璃板的示意图。

图3为分别采用最优孔径和高度的圆锥孔玻璃板基底和点样毛细管测得的1.6μM6-巯基嘌呤样本的SERS光谱(Hole-1、Hole-2、Hole-3为在圆锥孔玻璃板基底上重复测定3次所得的SERS光谱；Capillary-1、Capillary-2、Capillary-3为用点样毛细管取样重复测定3次所得的SERS光谱)。

图4为利用圆锥孔玻璃板基底进行SERS检测的示意图。

图5为利用平面玻璃板基底进行SERS检测的示意图。

图6为利用点样毛细管进行SERS检测的示意图。

图7为在三个相同孔径和高度的圆锥孔玻璃板基底上所测得1μM 4-巯基吡啶的乙醇溶液的SERS光谱。

具体实施方式

实施例：圆锥孔玻璃板SERS增强基底与表面增强拉曼光谱定量分析乘子效应模型(MEM_SERS)相结合对血浆样中6-巯基嘌呤的定量分析。

在本实施例中，我们首先采用4-巯基吡啶的乙醇溶液来确定玻璃板基底上圆锥孔的孔径和高度的最佳值，然后将最佳孔径和高度得圆锥孔玻璃板基底与MEM_SERS模型相结合对血浆样中6-巯基嘌呤进行SERS光谱准确定量分析。

本实施例中所用试剂及来源如下：4-巯基吡啶(96％)、4-巯基苯甲酸(90％)、一水合6-巯基嘌呤(99.5％)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTMS，98％)和硝酸银(99.9％)购自阿拉丁试剂有限公司；二水合柠檬酸三钠(分析纯)购于中国上海西格玛-阿拉丁化学试剂有限公司；浓盐酸、浓硝酸和浓硫酸购于中国株洲化工研究所；30％的过氧化氢购于中国上海国药集团化学试剂有限公司。乙醇(分析纯)购于上海泰坦科技股份有限公司；血浆样品由长沙市血液中心提供；实验所用超纯水(18.2MΩcm^-1)由中国重庆艾科浦的超纯水仪生产的。

本实施例的主要实验步骤如下：

(1)银纳米溶胶的制备：实验中所使用的玻璃器皿均首先用新配制的王水浸泡8小时以上，然后用超纯水洗净，烘干待用。银纳米溶胶是按柠檬酸三钠还原硝酸银的方法制备的。其简要过程如下：准确称取18.00mg硝酸银并将其溶于100mL超纯水中后，倒入三口烧瓶中快速搅拌并加热至沸腾，接着迅速加入2mL 1％(m/V)柠檬酸三钠溶液，当溶液变为土黄色后，保持微沸状态持续反应30min，然后移去热源，继续搅拌冷却至室温，即得到银纳米溶胶。将银纳米溶胶放入棕色试剂瓶中，保存在4℃冰箱中备用；

(2)圆锥孔玻璃板基底的衍生化：先将圆锥孔玻璃板基底放入浓硫酸和双氧水混合液(H₂SO₄:H₂O₂＝4:1，v/v)中水浴60℃活化10min，然后用超纯水超声清洗3次和无水乙醇超声清洗1次，每次5min，最后烘干。将洁净的圆锥孔玻璃板基底放入2％APTMS乙醇溶液中反应24小时，然后取出用超纯水和无水乙醇间换清洗2次，除去残留的APTMS，在37℃下烘干，再放入到银溶胶中浸泡反应12小时以上，沉积好银纳米颗粒的圆锥孔玻璃板板基用超纯水清洗备用；

(3)用无水乙醇配制13mM的4-巯基吡啶储备液，保存于4℃冰箱中。用超纯水将4-巯基吡啶储备液稀释到1μM后，将其滴加到沉积了银纳米颗粒的16块钻有不同孔径和高度的圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底上(表1)，反应1h后用超纯水冲洗干净，37℃烘干。英国雷尼绍(Renishaw)公司的Invia-Reflex激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪(激光光源：He-Ne激光器，激光波长：633nm激光功率：17mW，检测器：空气冷却型1024×256像素的CCD，显微镜：徕卡(Leica)显微镜，配有50倍长焦物镜)测量玻璃板基底上吸附的4-巯基吡啶的SERS光谱。SERS光谱测量的曝光时间为1s，累计扫描次数为3次，扫描中心波数设置为1150cm^-1。同一块玻璃板基底上钻有多个相同孔径和高度的圆锥孔或圆柱-圆锥孔。随机选取了其中3个圆锥孔或圆柱-圆锥孔测量SERS光谱；

(4)用无水乙醇配制2mM 6-巯基嘌呤储备液和2mM 4-巯基苯甲酸储备液，并保存在4℃冰箱中备用。用超纯水稀释不同体积的6-巯基嘌呤储备液得到13个浓度在0.020μM到2.000μM之间的6-巯基嘌呤校正样本。在离心管中加入1mL血浆样本和500μL 2mM的6-巯基嘌呤储备液，用甲醇定容到10mL，超声30min，然后在10000转/分钟的转速下离心15min，取1mL上清液用超纯水稀释至10mL，即6-巯基嘌呤的血浆工作液。用超纯水稀释不同体积的6-巯基嘌呤的血浆工作液得到6-巯基嘌呤浓度分别为0.30、0.50、0.90、1.30、1.50、1.70和1.90μM的血浆测试样本。用超纯水稀释2mM 4-巯基苯甲酸储备液得到1.2μM的4-巯基苯甲酸工作液。将10μL待测样本(6-巯基嘌呤校正样本或血浆测试样本)与10μL 1.2μM 4-巯基苯甲酸工作液、20μL的银溶胶和2.5μL 2M的氯化钾充分混合后，将该混合溶液滴加到玻璃板基底的圆锥孔内，用美国必达泰克公司的便携式i-Raman785H光谱仪(激光波长：785nm，激光功率：300mW，检测器系统：BAC151A的拉曼成像显微采样系统和20倍长焦物镜)进行SERS光谱测量。SERS光谱测量的曝光时间是5000ms，扫描范围是400cm^-1～1700cm^-1。每个样本重复测量三次；

(5)根据6-巯基嘌呤和4-巯基苯甲酸(内标物)的SERS光谱峰的位置，选择拉曼位移在400～1700cm^-1范围内的SERS光谱数据进行定量分析；

(6)采用MEM_SERS模型进行定量分析：首先使用OPLEC_m方法估算出校正样本SERS光谱的乘子效应参数，然后采用‘双校正模型’策略预测血浆测试样本中6-巯基嘌呤的含量；

(7)采用预测均方根误差c_{6-Mercaptopurine,k}和分别代表第k个测试样本中6-巯基嘌呤的真实浓度和预测浓度；N代表测试样本数目)和平均相对预测误差来评估本发明的定量分析结果的质量，并将本发明的定量分析结果与LC-MS/MS方法的相应分析结果进行比较。

从表2所示的结果可以很明显的看出，在圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底上检测到的4-巯基吡啶乙醇溶液的SERS信号比平面玻璃板基底上检测到的SERS信号的高出5～10倍。这主要是因为激光光束在圆锥孔洞内发生了多重内部反射，使得更多的4-巯基吡啶分子被激发，产生更多的拉曼散射光子；另外由圆锥孔的聚焦作用，由4-巯基吡啶分子产生的拉曼散射光子几乎全部被拉曼光谱检测系统所收集并检测，所以获得的SERS信号更强。在所考察的几种玻璃板基底中，基片上所钻圆锥孔的孔径和高度与所用基片的折射率有关，圆锥孔的最佳孔径和高度应能使垂直入射的激发光在圆锥孔内能发生全反射；孔径为3.4mm、高度为2mm的圆锥孔玻璃板基底的SERS增强效果最好。

图3给出了使用孔径为3.4mm、高度为2mm的圆锥孔玻璃基底和点样毛细管检测到的同一浓度的6-巯基嘌呤乙醇溶液的SERS光谱信号。很明显，使用圆锥孔玻璃基底获得SERS信号要比使用毛细管获得的SERS信号强的多，并且其SERS光谱的重现性也更好。

图4、图5和图6分别给出了使用圆锥孔玻璃板基底、平面玻璃板基底和点样毛细管检测SERS光谱信号的原理示意图。该图简要解释了使用圆锥孔玻璃板基底测得的SERS光谱信号高于使用平面玻璃板基底和点样毛细管测得的SERS光谱信号的主要原因。一般而言，吸附在沉积了银纳米颗粒的平面玻璃板基底上的待测物质只有被激光光斑直接照射到的那一部分才能被激发而产生拉曼散射光子，而且只有一小部分拉曼散射光子被拉曼光谱检测系统所收集并检测。利用毛细管检测SERS光谱时，有相对较多的待测物质被激发而发射出较多的拉曼散射光子，但是有相当一部分的拉曼散射光子发射到空气中而没有拉曼光谱检测系统所检测到。而锥形孔的玻璃板基底与前两种情况有所不同。一方面，照射到圆锥孔洞中的激光光束经过多重内部反射会导致更多的待测物质分子被激发而产生更多拉曼散射光子；另一方面，大部分拉曼散射光子会经多重内部散射效应而聚集进入拉曼光谱检测系统，产生较强的SERS信号。

图7在三个相同孔径和高度(圆锥孔径：3.4mm，圆锥高度：2mm)的圆锥孔玻璃板基底上测得的同一浓度的4-巯基吡啶乙醇溶液的SERS光谱。从图7可以看出，由于圆锥孔玻璃板基底上沉积的银纳米颗粒的物理性质(颗粒大小和分布)不可能完全一致，导致同一样本的SERS光谱强度之间存在显著的差别。这种由SERS基底物理性质的差异所导致的SERS光谱信号的变化将会严重影响SERS光谱定量分析结果的准确度。因此必须采取一定的措施来消除这种不利的影响。本发明利用改进的OPLEC_m方法来估计SERS增强基底物理性质的变化对校正样本SERS光谱的乘子效应，然后采用双校正策略来消除乘子效应对SERS光谱定量分析结果的影响。

表3比较了本发明和LC-MS/MS对血浆测试样本中6-巯基嘌呤浓度的定量分析结果。圆锥孔玻璃板基底结合MEM_SERS模型的定量分析结果的RMSEP和ARPE值分别为0.06μM和4.1％，大约只有LC-MS/MS方法相应值的四分之一。圆锥孔玻璃板基底结合MEM_SERS模型得到的加标回收率均在91.8～108.1％之间，也明显优于LC-MS/MS方法的相应回收率。这些结果表明本发明能够实现复杂体系中待测物质的准确SERS定量分析，因而具有在药物检测、环境分析等诸多领域中推广应用的潜力。

表1表示本发明16种圆锥孔和圆柱-圆锥孔玻璃板基底的孔径和高度参数(编号1-8表示圆柱-圆锥孔；编号为9-16表示圆锥孔)；表2表示平面玻璃板基底(编号0)和16种不同孔径和高度的玻璃板基底(编号1-16)上测得的同浓度4-巯基吡啶的乙醇溶液的4个特征SERS峰的强度值；表3表示本发明圆锥孔玻璃板结合MEM_SERS方法、以及LC-MS/MS对血浆样本中6-巯基嘌呤的定量分析结果；其中a表示括号内的数字为标准偏差。

表1

表2

表3

Claims (7)

1.一种增强SERS信号的定量分析方法，包括以下步骤：

(1)在基片上钻圆锥孔或圆柱-圆锥孔；所述圆柱-圆锥孔是在圆锥孔的上方连接圆柱孔，且圆锥孔一端与圆柱孔一端相接；

(2)在钻有步骤(1)所述孔的基片表面沉积纳米颗粒，使所述孔表面沉积纳米颗粒得到增强基底；

(3)利用所述增强基底结合内标法获取校正样本的SERS光谱数据；

(4)在校正样本的SERS光谱数据与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型；

(5)利用所述增强基底结合内标法获取待测样本的SERS光谱x_test；采用所述校正模型计算出待测样本中待测物质的浓度。

2.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述圆锥孔的孔径和高度能使垂直基片入射的激发光在圆锥孔内发生全反射。

3.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述基片为玻璃片或硅片。

4.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述纳米颗粒为金纳米溶胶颗粒(AuNP)或银纳米溶胶颗粒(AgNP)。

5.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，利用乘子效应模型在校正样本的SERS光谱信号与样本中待测物质浓度矢量c之间建立校正模型；

所述乘子效应模型为：

x_k＝b_k×(c_IS,k·r_IS+c_{t arg et,k}·r_{t arg et})+d_k，

其中，k＝1,2,…,K，x_k代表第k个样本的SERS光谱；c_IS,k和c_{t arg et,k}分别代表第k个样本中内标物质和待测物质的浓度；r_IS和r_{t arg et}分别代表内标物质和待测物质的分子散射特性；非乘子参数d _k代表由于背景干扰和增强基底物理性质变化对第k个校正样本SERS光谱信号产生的非乘子效应；乘子参数b_k代表由于SERS基底物理性质以及激光光源的功率和聚焦位置的变化对第k个校正样本SERS光谱信号强度产生的乘子效应。

6.如权利要求5所述的定量分析方法，其特征在于，采用所述校正模型计算出待测样本中待测物质的浓度包括以下步骤：

(1)从校正样本的SERS光谱数据中计算出校正样本的乘子参数b_k，k＝1,2,…,K；

(2)在x_k和b_k之间建立校正模型b_k＝α₁+x_kβ₁；在x_k和b_k×c_{t arg et,k}之间建立校正模型b_k×c_{t arg et,k}＝α₂+x_kβ₂，用多元线性回归方法计算校正模型中的参数α₁、β₁、α₂和β₂；

(3)计算样本中待测物质浓度，即c_test＝(α₂+x_testβ₂)/(α₁+x_testβ₁)。

7.一种如权利要求1-6任一所述的定量分析方法在痕量物质定量分析中的应用。