CN108120678B - 一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生化检测领域，具体涉及一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置及方法，解决了有色化合物的微体积快速检测方法只能进行定性、半定量检测且存在较多假阳性结果，以及利用相机、手机等设备获取显色后待测物质的图片易受外部光源干扰的问题，包括微通道、激光器、光电探测器、全反射镜和计算机，微通道设置在微通道固定平台上，微通道上方设置有与水平面呈45°的全反射镜，全反射镜镜面一侧设置有激光器和光电探测器，激光器呈水平设置，光电探测器连接有计算机以及基于检测装置的检测方法。本发明利用散射光干涉技术与光热效应结合，实现了显色物质的快速定量检测，涉及的检测方法所需样品体积小且避免了外部环境温度的影响。

Description

一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置及方法
技术领域
本发明属于生化检测领域，具体涉及一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置及方法。
背景技术
显色反应是将试样中被测组分转变成有色化合物的化学反应，一般是通过选取适当的试剂，将待测离子转化为有色化合物，根据颜色变化的程度和待测样品之间的关系进行半定量或定量的分析。其中显色反应中常用检测方法主要包括比色法、分光光度法等。比色法虽然操作简单，可用肉眼观察进行半定量的分析，但通常会因为不同检测者生物视觉感官不同而产生误差。因此需进一步借助其他设备如相机或手机等，将检测结果转化为图片颜色信息，该方法的局限性在于容易受到图片采集方式及周围光线的影响，（杨冬冬，张校亮，崔彩娥，谭慷，李晓春，分析测试学报，2015, 34(10): 1179-1184.）。分光光度法灵敏度高、稳定性好，但所需样品量较大，测量结果容易受到溶液中颗粒散射的影响。
在特定波长强激光照射下，光子与有色的吸光物质中分子相互作用，导致吸光物质溶液温度升高，而造成有色吸光物质折射率的变化，这种变化与吸光物质颜色变化程度在一定范围内正相关。基于光热效应的激光热透镜技术实现了吸光物质的定量检测，但是该方法明显受到样品饱和吸收的影响(GEORGES J. Advantages and limitations ofthermal lens spectrometry over conventional spectrophotometry for absorbancemeasurements. Talanta, 1999, 48(3):501-509.)。1995年，Bornhop等人将He-Ne激光入射到通有待测物质的毛细管内，由于不同界面处折射率不同，经其反射和折射后，在环绕管轴360°范围内有明暗相间的干涉条纹产生，Bornhop等人将其称为“背向散射干涉”（Back-scattering interferometry, BSI）(Bornhop D J. Microvolume index of refractiondeterminations by interferometricbackscatter. Applied optics, 1995, 34(18):3234-3239.)。当管内液体的折射率改变时，干涉条纹形状基本不变，但相对于初始干涉条纹位置有一定的移动，移动量与折射率的变化有关，因而被用来探究折射率变化量、抗原-抗体等分子间作用的检测(Bornhop D J, Latham J C, Kussrow A, et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scatteringinterferometry. science, 2007, 317(5845): 1732-1736.)。但该方法容易受到周围环境温度以及激光产生的光热效应的影响。2015年，C. Joo等人采用泵浦-探测光路结构，使用532 nm的高功率激光入射到含有待测物质的毛细管上激发光热效应，采用低功率的红光激光做探测光，结合BSI技术实现了对血样中血红素的直接定量检测(Kim U, Song J, LeeD, et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration oferythrocytes using photothermalangular light scattering[J]. Biosensors andBioelectronics, 2015, 74: 469-475.)，但由于采用了泵浦-探测两束激光、使得光路过于复杂。由于微通道所需样品体积很小，因此，将光热效应和散射干涉技术结合可以实现有色化合物的微体积检测。
发明内容
本发明为了解决现有技术下有色化合物的微体积快速检测方法只能进行定性、半定量检测且存在较多假阳性结果，以及利用相机、手机等设备获取显色后待测物质的图片易受外部光源干扰的问题，提供了一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置及方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置，包括微通道、激光器、光电探测器、全反射镜和计算机，微通道设置在微通道固定平台上，微通道上方设置有与水平面呈45°的全反射镜，全反射镜镜面一侧设置有激光器和光电探测器，激光器呈水平设置，光电探测器连接有计算机。
一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，包括如下步骤：
S1. 配制显色剂以及不同浓度的标准品溶液，将标准品溶液与显色剂按比例混合反应并得到显色产物溶剂；
S2. 取S1中不同浓度标准品溶液显色产物溶剂10～30微升并将其置入微通道中；
S3. 采用特定波长的激光器，利用激光器产生的激光对微通道的样品区进行照射；
S4. 激光照射微通道的样品区持续60～120s，并采用光电探测器连续记录微通道周围干涉条纹的信息；进一步的，以标准品溶液浓度为横坐标，以激光照射终了时刻相对于起始时刻的条纹移动量为纵坐标，绘制标准相位曲线；
S5. 对某一待测标准品溶液的浓度定量：利用条纹移动量计算其相位移动量，将移动量代入所得的标准相位曲线，得出所测样品具体浓度。
步骤S1中标准品溶液与显色剂按比例混合的方法是：将标准品溶液及显色剂按照比例从5:1～50:1在离心管内均匀混合。
步骤S3中特定波长的激光器是指能够与发生显色反应产生的有色化合物互为补色的激光器。
步骤S2～S4中的微通道是指毛细管或微流控芯片，其截面形状可以为圆形或半圆或矩形中的任意一种。
步骤S2和S3中微通道的样品区是指微通道中含有步骤S1中显色产物溶剂的区域。
激光器用于产生光热效应，其波长选择取决样品显色后的颜色，所选用波长应接近于样品显色产物的最大吸收峰，使信号最明显；激光入射到微通道的样品区功率密度为0.2 W/cm2～0.7 W/cm2。
步骤S4中干涉条纹的信息为干涉条纹光强分布曲线及曲线进行快速傅里叶变换后的相位值，条纹移动量为激光照射终末时刻与起始时刻的条纹光强分布曲线快速傅里叶变换后相位差。
本发明相比现有技术具有的特定技术特征及有益效果是：
本发明利用散射光干涉技术与光热效应结合，实现了显色物质的快速定量检测，涉及的检测方法所需样品体积小、利用pid 温度控制系统控制微通道样品区的温度，以及对整个装置的采取了一些措施避免外界震动等噪声、温度、及采用遮光，在暗室中采集条纹，避免了外部环境温度的影响，增大激光强度，可实现更小浓度待测物的检测，采用快速傅里叶变换处理干涉条纹，提高了条纹移动的检测精度。
附图说明
图1是本发明所用装置的示意图；
图2是本发明中不同浓度下亚硝酸盐的相位变化量的分析结果；
图3是本发明装置的另一种结构示意图。
图中：1-激光器，2-全反射镜，3-微通道，4-入射角θ，5-微通道固定平台，6-光电探测器，7-计算机。
具体实施方式
参照图1对本发明进行进一步阐述，一种基于散射光光热干涉生化定量的检测装置，包括微通道3、激光器1、光电探测器6、全反射镜2和计算机7，微通道3设置在微通道固定平台5上，微通道3上方设置有与水平面呈45°的全反射镜2，全反射镜2镜面一侧设置有激光器1和光电探测器6，激光器1呈水平设置，光电探测器6连接有计算机7。
其中，激光器1水平放置，其产生的激光经过全反射镜2反射后射入微通道3的样品区，入射角θ4为90°，即激光垂直射入微通道3的样品区。微通道用来处理或操纵体积为纳升到阿升的微小流体系统，而激光照射到微通道3的样品区，是指激光照射在含有溶液的微通道部分。
如图3所示，为本发明装置的另一种结构，即基于散射光光热干涉的生化定量的方法的除了图1的检测方式以外，也可用如图3所示的检测装置。散射光前向散射的生化定量的检测方式：使用激光器1、微通道3、光电探测器6、计算机7对含有显色溶液微通道部分进行定量检测。激光器1产生的激光垂直入射微通道3的样品区，经过光电探测器6收集后传输到计算机7。基于上述检测装置，一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，包括如下步骤：
S1. 配制显色剂以及不同浓度的标准品溶液，将标准品溶液与显色剂按比例混合反应并得到显色产物溶剂；
S2. 取S1中不同浓度标准品溶液显色产物溶剂10～30微升并将其置入微通道3中；
S3. 采用特定波长的激光器1，利用激光器1产生的激光对微通道3的样品区进行照射；
S4. 激光照射微通道3的样品区持续60～120s，并采用光电探测器6连续记录微通道3周围干涉条纹的信息；进一步的，以标准品溶液浓度为横坐标，以激光照射终了时刻相对于起始时刻的条纹移动量为纵坐标，绘制标准相位曲线；
S5. 对某一待测标准品溶液的浓度定量：利用条纹移动量计算其相位移动量，将移动量代入所得的标准相位曲线，得出所测样品具体浓度。
步骤S1中标准品溶液与显色剂按比例混合的方法是：将标准品溶液及显色剂按照比例从5:1～50:1在离心管内均匀混合。步骤S3中特定波长的激光器1是指能够与发生显色反应产生的有色化合物互为补色的激光器。步骤S2～S4中的微通道3是指毛细管或微流控芯片，其截面形状可以为圆形或半圆或矩形中的任意一种。步骤S2和S3中微通道3的样品区是指微通道3中含有步骤S1中显色产物溶剂的区域。激光器1用于产生光热效应，其波长选择取决样品显色后的颜色，所选用波长应接近于样品显色产物的最大吸收峰，使信号最明显；激光入射到微通道3的样品区功率密度为0.2 W/cm2～0.7 W/cm2。步骤S4中干涉条纹的信息为干涉条纹光强分布曲线及曲线进行快速傅里叶变换后的相位值，条纹移动量为激光照射终末时刻与起始时刻的条纹光强分布曲线快速傅里叶变换后相位差。
实施例一：
亚硝酸根离子的定量检测：
1．制备标准品溶液：将亚硝酸钠溶于去离子水中，配制浓度分别为0.5、1、2、3、4、5mg/L的NO2 - 标准溶液；制备显色剂的配制：取0.0861 g 对氨基苯磺酰胺，0.634 g 柠檬酸和0.0259 g盐酸萘乙二胺依次溶于45 ℃~50 ℃超纯水中，搅拌至完全溶解。
将标准溶液和显色剂以5:1的比例在离心管内充分混合反应，静置显色10 min后，取20 μL溶液通入微通道的样品区。
2．检测装置的型号选择及安装：如图1所示，选择与显色剂颜色相互补的激光器1，在本实例中选择的是532 nm的全固态激光器，一束光线由激光器1发出，经全反射镜2反射后入射到微通道的样品区，在微通道3内外界面经过多次反射和折射，再经由全反射镜2将背向散射光反射，在小于等于15°方向上用线阵CCD采集干涉条纹。
3.获取背向散射干涉图案：利用固定在光学平台的CCD，将CCD设置为连续采集模式，采样频率10 Hz，将激光开始照射溶液产生干涉图案进行保存。
4．干涉图案处理制备标准曲线：采样快速傅里叶变换将对上述步骤3中保存的干涉图片进行处理，获取干涉图案相位值，结果表明：光热效应期间相位值的变化量随亚硝酸盐检测浓度的增大而增大。以此作标准曲线图，如图2所示。
5．对某一待测标准溶液的浓度定量：采用光电探测器6连续记录此样品及空白时干涉条纹的信息；计算其相对于背景信号的相位移动量，将移动量带入所得的相位曲线，最终得出所测样品具体浓度。
实施例二：
二价铜离子的定量检测：
1．标准品溶液：将硝酸铜溶于去离子水中，配制浓度分别为0、0.5、1、2、3、4、5、10mg/L的Cu2+标准溶液；显色剂的配制：称取100 mg 2,9-二甲基-1,10-菲啰啉（C14H12N2·1/2H2O）溶于100 ml甲醇（5.7）。此溶液可稳定一个月。配置好的显色剂放到4ºC冰箱中避光保存。盐酸羟胺二价铜离子还原成亚铜离子，在中性或微酸性溶液中，亚铜离子和2,9-二甲基-1,10-菲啰啉反应生成黄色络合物。
2．检测装置设计：所使用的激光器波长为457nm的蓝光激光器，其他与实施例一中的检测装置一致，如图1所示。
3．获取背向散射干涉图案：利用固定在光学平台的CCD，将CCD设置为连续采集模式，采样频率10 Hz，将激光开始照射溶液产生干涉图案进行保存。
4.干涉图案处理制备标准曲线：采样快速傅里叶变换将对上述步骤3中保存的干涉图片进行处理，获取干涉图案相位值，结果表明：光热效应期间相位值的变化量随二价铜离子检测浓度的增大而增大。
5．对某一待测样品的浓度定量：采用光电探测设备连续记录此样品及空白时干涉条纹的信息；计算其相对于背景信号的相位移动量，将移动量带入所得的相位曲线，最终得出所测样品具体浓度。

Claims (4)

1.一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，其特征在于，检测方法所涉及的装置包括微通道（3）、激光器（1）、光电探测器（6）、全反射镜（2）和计算机（7），微通道（3）设置在微通道固定平台（5）上，微通道（3）上方设置有与水平面呈45°的全反射镜（2），全反射镜（2）镜面一侧设置有激光器（1）和光电探测器（6），激光器（1）呈水平设置，光电探测器（6）连接有计算机（7），激光器（1）用于产生光热效应，其波长选择取决样品显色后的颜色，所选用波长应接近于样品显色产物的最大吸收峰，使信号最明显；激光入射到微通道（3）的样品区功率密度为0.2 W/cm2～0.7 W/cm2；检测方法包括如下步骤：
S1. 配制显色剂以及不同浓度的标准品溶液，将标准品溶液与显色剂按比例混合反应并得到显色产物溶剂；
S2. 取S1中不同浓度标准品溶液显色产物溶剂10～30微升并将其置入微通道（3）中；
S3. 采用激光器（1），激光器（1）是指能够与发生显色反应产生的有色化合物互为补色的激光器，利用该激光器（1）产生的激光对微通道（3）的样品区进行照射；
S4. 激光照射微通道（3）的样品区持续60～120s，并采用光电探测器（6）连续记录微通道（3）周围干涉条纹的信息，干涉条纹的信息为干涉条纹光强分布曲线及曲线进行快速傅里叶变换后的相位值，条纹移动量为激光照射终末时刻与起始时刻的条纹光强分布曲线快速傅里叶变换后相位差；以标准品溶液浓度为横坐标，以激光照射终了时刻相对于起始时刻的条纹移动量为纵坐标，绘制标准相位曲线；
S5. 对某一待测标准品溶液的浓度定量：利用条纹移动量计算其相位移动量，将移动量代入所得的标准相位曲线，得出所测样品具体浓度。
2.根据权利要求1所述的一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，其特征在于，步骤S1中标准品溶液与显色剂按比例混合的方法是：将标准品溶液及显色剂按照比例从5:1～50:1在离心管内均匀混合。
3.根据权利要求1所述的一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，其特征在于，步骤S2～S4中的微通道（3）是指毛细管或微流控芯片，其截面形状为圆形或半圆或矩形中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种基于散射光光热干涉生化定量的检测方法，其特征在于，步骤S2和S3中微通道（3）的样品区是指微通道（3）中含有步骤S1中显色产物溶剂的区域。
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