CN104914089B - 用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于光谱分析技术领域的一种用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，具体说是基于表面增强拉曼散射效应测定痕量化学物质的拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析，并改进主成分分析这种定性鉴别方法，是采用杠杆定律和三角形内平行线读数法，实现混合物成分的半定量分析。这种方法既可以用于分析几种完全不同的化学物质的混合物，也可以用于分析同系物的混合物。此项发明基于PCA定性分析，实现了混合物成分的半定量分析，是一种简便、快捷且较为准确的混合物鉴定方法。

Description

用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法

技术领域

本发明属于光谱分析技术领域，特别涉及一种用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，具体说是基于表面增强拉曼散射效应测定痕量化学物质的拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析，并改进主成分分析这种定性鉴别方法，是采用杠杆定律和三角形内平行线读数法，实现混合物成分的半定量分析。

背景技术

拉曼光谱能够反映分子的结构信息，从而鉴别化学物质的种类。但极少量分子的拉曼散射光强度很弱，难以被探测到。利用表面增强拉曼散射(SERS)效应，化学物质的拉曼信号会大大增强，从而实现快速、准确的痕量检测。表面增强拉曼散射效应指的是在金、银等物质的纳米结构表面，由于入射光的激发而产生局域表面等离子体共振，使得散射光增强几个数量级。在SERS基底上，局域电场最强的位置称为“热点”，要提高基底的灵敏度，应当尽量增加“热点”数量，并且令待测分子易于吸附在“热点”处；常见的SERS基底大体分为两类，一类是纳米粒子悬浮液，一类是全固态的基底，例如硅基片上生长的纳米棒、纳米颗粒，或银电极腐蚀得到的纳米结构等。全固态的SERS基底往往能够吸附更多分子，散射信号增强效果更明显；此外，物理方法制备的SERS基底表面通常更加粗糙，“热点”数量远多于化学方法制备的金、银纳米粒子，因此，本项发明采用完全由物理方法制备的全固态SERS基底，在二氧化硅纳米棒阵列上修饰金纳米粒子。其中二氧化硅纳米棒以电子束蒸镀法生长于硅片上，表面十分粗糙，能够附着大量金纳米粒子，而且透光性好，不妨碍激光照射到纳米棒侧壁上的金纳米粒子，金纳米粒子则溅射沉积到二氧化硅纳米棒上，粒径只有几纳米，在纳米棒顶端和侧壁上都有分布，且附着力较强，这种SERS基底具有大量“热点”，检测灵敏度很高。主成分分析是一种用于定性判别的化学计量学方法，是采用杠杆定律和三角形内平行线读数法(如图1、图2所示)，通过对化学物质的拉曼光谱进行这种分析，可以鉴别出物质种类。将不同物质的拉曼光谱进行主成分分解，得到得分矩阵T和载荷矩阵P：

X＝TP^T+E

式中E是误差矩阵。分矩阵T为列正交矩阵，每一列都反映一个主成分的方差信息，其中方差最大的主成分反映出最多的光谱之差异信息，称为第一主成分，其次是第二、第三……主成分。由于前两个主成分通常已能够反映大部分差异信息，所以可选取第一主成分和第二主成分的得分值绘制得分图。

在得分图中，相似的光谱所对应的数据点彼此靠近，差异明显的光谱所对应的数据点彼此远离。而混合物拉曼光谱兼具几种组分的特征，其相应于各个主成分的得分值也与成分相关。两种物质的混合物在得分图中对应的数据点处于两种组分对应的数据点之间的连线上，三种物质的混合物在得分图中对应的数据点处于三种组分对应的数据点所围成的三角形内(如图2所示)。

一般情况下，主成分分析只被用于定性鉴别化学物质，而要计算出混合物中各种组分的含量，必须采用定量的化学计量学方法，如偏最小二乘回归法等。这些方法进行建模使用的数据量十分庞大，不仅需要混合物中组分各自的拉曼光谱，还需要这些组分以各种比例混合后测得的拉曼光谱。对于两种化学物质的混合物，往往要变化近十种比例，测拉曼光谱；对于三种及以上化学物质的混合物，则至少要变化几十种比例进行测试，工作量惊人。

为了简便、快速地测定混合物的成分，应当尽量简化建模过程，考虑到主成分分析得出的得分图所具有的特性，故而将其发展为一种半定量的分析手段。只要测出混合物中组分各自的拉曼光谱，进行建模，就可以直接计算出任何比例的混合物成分，工作量大大减少，效率显著提高。对于实际应用中需要尽快大致了解混合物成分的情形，此项发明很具现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)使用表面增强拉曼散射基底检测三种化学物质低浓度溶液的拉曼光谱，进行建模；

(2)对三种化学物质的SERS谱线进行主成分分析，建立模型，画出得分图；

(3)检测含有模型中两种或三种物质的混合溶液的SERS谱线，代入PCA模型中计算出相应于主成分1和主成分2的得分值；

(4)观察混合溶液SERS谱线所对应的数据点位置，若在两种物质数据点的连线上，则该混合溶液含有这两种组分；若在三种物质数据点所确定的三角形内，则该混合溶液含有全部三种组分；

(5)对于两种化学物质的混合物，其SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置大体在两种组分的数据点连线上。根据杠杆定律，混合物中两种物质的含量比例与其数据点到这两种组分数据点的距离成反比；

(6)对于三种化学物质的混合物，其SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置在三种组分的数据点所围成的三角形内。发展了一种三角形内平行线读数法，可计算出该混合物中三种物质的相对含量。

所述步骤(1)的方法是以溶液浸泡SERS基底，或将溶液滴加在SERS基底上，使待测分子吸附在SERS活性物质表面，测其拉曼光谱；为消除测量误差的影响，要在样品上的不同位置重复测定；然后将这几种组分的各数条拉曼光谱分为训练集和验证集，分类方法为Kennard-Stone算法，这种算法的过程是首先将距离最大的两个样本选入训练集，再依据将待筛选样本与已选入训练集的样本之间的最小空间距离最大化的原则依次选择训练样本，从而使得训练集能够充分代表这些光谱的特征。而验证集的光谱随后会被代入建好的模型中，计算检验模型的准确性。

所述对训练集的光谱进行以下预处理：

1)扣背底，采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法扣除光谱背底，控制参数少，运算速度快；

2)平滑，采用快速傅里叶变换方法对光谱进行平滑处理，去掉高频噪声；

3)微分处理，对光谱数据做一阶微分处理，提高光谱分辨率；

4)中心化，通过均值中心化处理将变量转换为其与平均值间的差值，有利于观察不同组样本间的差异及进行聚类分析。

所述步骤(2)选取拉曼光谱中几种组分主要特征峰的区段进行主成分分析。光谱中的其它数据并不反映染料分子的化学信息，因此不被纳入分析范围，以避免无效信息干扰染料的种类鉴别过程。

所述步骤(3)运算得到训练集光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分值，绘制成得分图，再将验证集光谱进行与训练集光谱相同的预处理后，代入PCA模型中计算出得分值，也绘入得分图中，由此可以检验模型是否准确。

所述步骤(5)为测定混合物的成分的过程，采用上述步骤(1)测得混合溶液的SERS光谱，并进行预处理，然后代入PCA模型中计算出得分值，绘入得分图；分别计算包括几种组分溶液和混合溶液在内的样品各自数条拉曼光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分平均值及标准差，将这些平均数据点绘制在得分图中；如果两种组分的混合物所对应的数据点大体上位于这两种组分的数据点连线上；如果三种组分的混合物所对应的数据点则在这三种组分的数据点所确定的三角形内。

所述步骤(3)和(4)是根据杠杆定律，混合物中两种组分的含量比例与其数据点到这两种组分数据点的距离成反比；混合物的拉曼光谱对应的数据点C在组分A和组分B的数据点连线上；因此，混合物中组分A的含量为组分B的含量为其中AC、BC、AB表示各数据点连线上距离。

所述步骤(5)和(6)是三角形内平行线读数法计算三种化学物质的混合物成分，三角形ABC的三个顶点分别代表三种组分。要计算混合物O的成分，应当过点O分别作三条边的平行线DE、FG、HI，则混合物O中组分A的含量为组分B的含量为组分C的含量为其中AC、BC、AB、EG、FH、DI表示各数据点连线距离。

本发明的有意效果是本发明采用在PCA建模过程只使用SERS谱线中待测物质主要特征峰的数据，避免不反映待测物质化学信息的光谱数据降低模型的准确性。这种方法既可以用于分析几种完全不同的化学物质的混合物，也可以用于分析同系物的混合物。此项发明基于PCA定性分析，实现了混合物成分的半定量分析，是一种简便、快捷且较为准确的混合物鉴定方法。

附图说明

图1是根据杠杆定律，计算两种化学物质的混合物成分的示意图。

图2是计算三种化学物质的混合物成分所采用的三角形内平行线读数法示意图。

图3是甲基橙(MO)、亚甲基蓝(MB)、结晶紫(CV)三种染料的5×10^-6M溶液SERS谱线经过主成分分析得出的得分图。

图4是三种染料及它们的混合溶液的SERS谱线PCA得分图。

图5是三种染料及它们的混合溶液的平均得分值所绘制的PCA得分图。

图6是2-氯联苯、3-氯联苯、4-氯联苯的5×10^-5M溶液SERS谱线经过主成分分析得出的得分图。

图7是一氯联苯三种同系物及它们的两种混合溶液的SERS谱线PCA得分图。

图8是一氯联苯三种同系物及它们的两种混合溶液的平均得分值所绘制的PCA得分图。

具体实施方式

本发明提供一种用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，包括以下几个步骤：

(1)使用表面增强拉曼散射基底检测三种化学物质低浓度溶液的拉曼光谱，进行建模；

(2)对三种化学物质的SERS谱线进行主成分分析，建立模型，画出得分图；

(3)检测含有模型中两种或三种物质的混合溶液的SERS谱线，代入

PCA模型中计算出相应于主成分1和主成分2的得分值；

(4)观察混合溶液SERS谱线所对应的数据点位置，若在两种物质数据点的连线上，则该混合溶液含有这两种组分；若在三种物质数据点所确定的三角形内，则该混合溶液含有全部三种组分；

(5)对于两种化学物质的混合物，其SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置大体在两种组分的数据点连线上。根据杠杆定律，混合物中两种物质的含量比例与其数据点到这两种组分数据点的距离成反比；

(6)对于三种化学物质的混合物，其SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置在三种组分的数据点所围成的三角形内。发展了一种三角形内平行线读数法，可计算出该混合物中三种物质的相对含量。下面结合附图和实施例予以进一步说明。

首先制作SERS基底，采用金纳米粒子修饰的二氧化硅纳米棒阵列作为SERS基底检测痕量化学物质。这种SERS基底完全由物理方法制备得到。使用电子束蒸镀设备在单晶硅片上生长二氧化硅纳米棒，棒长度约140nm，直径约30nm，间距约20nm。继而在二氧化硅纳米棒阵列上溅射沉积金纳米粒子，使得纳米棒顶端覆盖厚度约为20nm的金颗粒团簇，侧壁上则分散附着粒径3-10nm的金颗粒，颗粒间距离为10nm左右。

所述步骤(1)的方法是以溶液浸泡SERS基底，或将溶液滴加在SERS基底上，使待测分子吸附在SERS活性物质表面，测其拉曼光谱；为消除测量误差的影响，要在样品上的不同位置重复测定；然后将这几种组分的各数条拉曼光谱分为训练集和验证集，分类方法为Kennard-Stone算法，这种算法的过程是首先将距离最大的两个样本选入训练集，再依据将待筛选样本与已选入训练集的样本之间的最小空间距离最大化的原则依次选择训练样本，从而使得训练集能够充分代表这些光谱的特征。而验证集的光谱随后会被代入建好的模型中，计算检验模型的准确性。其中，对训练集的光谱进行以下预处理，以保证计算检验模型的准确性：

1)扣背底，采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法扣除光谱背底，控制参数少，运算速度快；

2)平滑，采用快速傅里叶变换方法对光谱进行平滑处理，去掉高频噪声；

3)微分处理，对光谱数据做一阶微分处理，提高光谱分辨率；

4)中心化，通过均值中心化处理将变量转换为其与平均值间的差值，有利于观察不同组样本间的差异及进行聚类分析。

进行预处理后代入PCA模型中计算出得分值，绘入得分图；分别计算包括几种组分溶液和混合溶液在内的样品各自数条拉曼光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分平均值及标准差，将这些平均数据点绘制在得分图中；如果两种组分的混合物所对应的数据点大体上位于这两种组分的数据点连线上；如果三种组分的混合物所对应的数据点则在这三种组分的数据点所确定的三角形内。所述步骤(3)运算得到训练集光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分值，绘制成得分图，再将验证集光谱进行与训练集光谱相同的预处理后，代入PCA模型中计算出得分值，也绘入得分图中，由此可以检验模型是否准确。

如图1所示，根据杠杆定律，混合物中两种组分的含量比例与其数据点到这两种组分数据点的距离成反比；混合物的拉曼光谱对应的数据点C在组分A和组分B的数据点连线上；因此，混合物中组分A的含量为组分B的含量为

如图2所示，根据三角形内平行线读数法计算三种化学物质的混合物成分，三角形ABC的三个顶点分别代表三种组分。要计算混合物O的成分，应当过点O分别作三条边的平行线DE、FG、HI，则混合物O中组分A的含量为组分B的含量为组分C的含量为

实施例1

为证明此项发明中的主成分分析方法可以确定完全不同的化学物质的混合溶液成分，选取三种染料甲基橙(MO)、亚甲基蓝(MB)、结晶紫(CV)作为建模物质。实验及分析步骤如下：

1.配制三种染料的浓度为5×10^-6M的水溶液。

2.取MO、MB、CV溶液各3mL，浸泡面积约为25mm²的SERS基底半小时。浸泡结束后，将SERS基底平放在载玻片上晾干，则染料分子已经吸附在基底上。

3.使用BWTEK便携式拉曼光谱仪测染料分子的拉曼光谱。激光波长为785nm，功率为300mW，积分时间5s。在每片样品上随机选取10个位置测光谱，测得的光谱差异很小，表明SERS基底非常均匀，染料分子在基底上吸附得也很均匀。

4.采用Kennard-Stone算法将三种染料分子的各10条拉曼光谱分为训练集和验证集。

5.对训练集的光谱进行扣背底、平滑、一次微分和中心化预处理。

6.选取拉曼光谱中三种染料分子主要特征峰的区段进行主成分分析。光谱中的其它数据并不反映染料分子的化学信息，因此不被纳入分析范围，以避免无效信息干扰染料的种类鉴别过程。

7.对经过处理的训练集拉曼光谱进行主成分分析运算，得到这些光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分值，绘制成得分图，并将验证集光谱代入PCA模型中计算出得分值，也绘入得分图中(如图3所示)。每种染料的10条谱线得分值相近，对应的数据点在得分图中聚集在一起；三种染料的数据点则彼此远离。

8.配制几种染料的混合溶液，溶液中的染料分子总量与用于建模的三种染料溶液相同。以下表1中的几种混合溶液为例：

表1 配制几种染料的混合溶液

9.取以上混合溶液各3mL，分别浸泡面积约为25mm²的SERS基底半小时。浸泡结束后，将SERS基底平放在载玻片上晾干，则染料分子已经吸附在基底上。

10.测染料分子的拉曼光谱。激光波长为785nm，功率为300mW，积分时间5s。在每片样品上随机选取10个位置测光谱。

11.对以上6种混合溶液的各10条谱线进行如步骤6的预处理，然后代入上面建立的PCA模型中，计算出各自相应于第一主成分和第二主成分的得分值(如图4所示)。每种混合溶液的10条谱线得分值相近，对应的数据点聚集在一起。

12.分别计算全部溶液的各10条拉曼光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分平均值及标准差，将这些平均数据点绘制在得分图中(如图5所示)，两种染料的混合物所对应的数据点大体上位于两种组分的数据点连线上，三种染料的混合物所对应的数据点则在三种组分的数据点所确定的三角形内。

13.根据杠杆定律计算两种染料的混合物成分，如下表2所示，其中误差的含义为根据PCA模型计算出的组分含量与混合溶液配制的含量之间的偏差。可以看到，计算出的组分含量比较准确。

表2 根据杠杆定律计算两种染料的混合物成分

14.采用三角形内平行线读数法计算三种染料的混合物成分，如下表3所示，计算所得的成分与溶液配制的成分很接近。

表3 采用三角形内平行线读数法计算三种染料的混合物成分

以上实验结果表明，通过对表面增强拉曼光谱进行主成分分析，完全不同的三种物质的低浓度混合溶液成分可以较为准确地计算出来。

实施例2

为证明此项发明中的主成分分析方法可以确定结构相近、拉曼光谱类似的化学物质的混合溶液成分，选取一氯联苯的三种同系物2-氯联苯(2-CB)、3-氯联苯(3-CB)、4-氯联苯(4-CB)作为建模物质。实验及分析步骤如下：

1.分别配制三者的浓度为5×10^-5M的丙酮溶液，并滴加3μL在面积约为25mm²的SERS基底上，待丙酮挥发后，一氯联苯分子已吸附在基底上。

2.使用BWTEK便携式拉曼光谱仪测一氯联苯分子的拉曼光谱。激光波长为785nm，功率为300mW，积分时间20s，在每片样品上随机选取10个位置测光谱。

3.采用Kennard-Stone算法将一氯联苯三种同系物分子的各10条拉曼光谱分为训练集和验证集。

4.对训练集拉曼光谱进行扣背底、平滑、一次微分和中心化预处理。

5.选取拉曼光谱中三种一氯联苯分子主要特征峰的区段进行主成分分析。

6.对训练集拉曼光谱进行主成分分析运算，得到这些光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分值，绘制成得分图，并将验证集光谱代入PCA模型中计算出得分值，也绘入得分图中(如图6所示)。每种分子的10条谱线得分值相近，对应的数据点在得分图中聚集在一起；三种同系物的数据点则彼此远离。

7.配制2-CB和3-CB含量比为1:1的混合溶液和三种同系物含量比为1:1:1的混合溶液，溶液中的一氯联苯分子总量与用于建模的三种同系物溶液相同。

8.滴加以上混合溶液各3μL在SERS基底上。待丙酮挥发后，一氯联苯分子已吸附在基底上。

9.测一氯联苯分子的拉曼光谱。激光波长为785nm，功率为300mW，积分时间20s。在每片样品上随机选取10个位置测光谱。

10.对以上混合溶液的各10条谱线进行如步骤4的预处理，然后代入上面建立的PCA模型中，计算出各自相应于第一主成分和第二主成分的得分值，如图7所示，每种混合溶液的10条谱线得分值相近，对应的数据点聚集在一起。

11.分别计算全部5种溶液的各10条拉曼光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分平均值及标准差，将这些平均数据点绘制在得分图中，如图8所示，2-CB和3-CB的混合物所对应的数据点大体上位于这两种同系物的数据点连线上，2-CB、3-CB和4-CB的混合物所对应的数据点则在三种同系物的数据点所确定的三角形内。

12.根据杠杆定律，计算出2-CB和3-CB的混合溶液中2-CB的含量为54.96％，3-PCB的含量为45.04％，与实际配制的溶液成分相近。根据三角形内平行线读数法，计算出2-CB、3-CB和4-CB的混合溶液中2-CB的含量为31.17％，3-CB的含量为32.90％，4-CB的含量为35.88％，与实际配制的溶液成分相近。

以上实验结果表明，通过对表面增强拉曼光谱进行主成分分析，化学结构相近、拉曼特征峰类似的同系物低浓度混合溶液成分也可以较为准确地计算出来。

Claims (5)

1.一种用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

(1)使用表面增强拉曼散射基底检测三种化学物质低浓度溶液的拉曼光谱，进行建模；该建模方法是以溶液浸泡SERS基底，或将溶液滴加在SERS基底上，使待测分子吸附在SERS活性物质表面，测其拉曼光谱；为消除测量误差的影响，要在样品上的不同位置重复测定；然后将这三种化学物质的各数条拉曼光谱分为训练集和验证集，分类方法采用Kennard-Stone算法，这种算法的过程是首先将距离最大的两个样本选入训练集，再依据将待筛选样本与已选入训练集的样本之间的最小空间距离最大化的原则依次选择训练样本，从而使得训练集能够充分代表这些光谱的特征，而验证集的光谱随后会被代入建好的模型中，计算检验模型的准确性；

(2)对三种化学物质的SERS谱线进行主成分分析，建立模型；运算得到训练集光谱相应于第一主成分和第二主成分的得分值，绘制成得分图；

(3)检测含有模型中两种或三种物质的混合溶液的SERS谱线，代入PCA模型中计算出相应于主成分1和主成分2的得分值，也绘入得分图中；

(4)观察混合溶液SERS谱线所对应的数据点位置，若SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置在两种化学物质的数据点连线上；根据杠杆定律，混合物中两种物质的含量比例与其数据点到这两种组分数据点的距离成反比；则该混合溶液含有这两种组分；若SERS谱线在PCA得分图中对应的数据点位置在三种化学物质的数据点所围成的三角形内，根据三角形内平行线读数法计算出该混合物中三种物质的相对含量，则该混合溶液含有全部三种组分。

2.根据权利要求1所述用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的 方法，其特征在于，所述对训练集的光谱进行以下预处理：

1)扣背底，采用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法扣除光谱背底；

2)平滑，采用快速傅里叶变换方法对光谱进行平滑处理，去掉高频噪声；

3)微分处理，对光谱数据做一阶微分处理，提高光谱分辨率；

4)中心化，通过均值中心化处理将变量转换为其与平均值间的差值，有利于观察不同组样本间的差异及进行聚类分析。

3.根据权利要求1所述用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，其特征在于，所述步骤(2)选取拉曼光谱中三种化学物质主要特征峰的区段进行主成分分析。

4.根据权利要求1所述用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，其特征在于，所述步骤(4)是根据杠杆定律计算两种化学物质的混合物成分，混合物中两种化学物质的含量比例与混合物数据点到这两种组分数据点的距离成反比；混合物的拉曼光谱对应的数据点C在化学物质A和化学物质B的数据点连线上；因此，混合物中化学物质A的含量为化学物质B的含量为 。

5.根据权利要求1所述用表面增强拉曼光谱对痕量混合物进行半定量分析的方法，其特征在于，所述步骤(4)是三角形内平行线读数法计算三种化学物质的混合物成分，三角形ABC的三个顶点分别代表三种化学物质的数据点，点O代表混合物的数据点；要计算混合物的成分，应当过点O分别作三条边的平行线DE、FG、HI，分别平行于线AB、AC、BC，其中点F、H位于线AB上，点D、I为线AC上，点E、G位于线BC上；则混合物O中化学物质A的含量为化学物质B的含量为化学物质C的含量为 。