CN117705773A - 模块化多模态显微光学分析系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了模块化多模态显微光学分析系统,包括:脉冲激光激发模块、脉冲激光共聚焦成像模块、拉曼光谱激发模块、连续激光共聚焦显微成像模块、显微拉曼光谱分析模块、扫描振镜模块、显微物镜模块、三维样品台模块、非线性显微成像模块、白光显微与荧光标记成像模块以及分析系统;本发明了模块化多模态显微光学分析系统融合多种光学成像与光谱分析功能,图像空间分辨率高、光谱分析特异性好,并可实现多种有机/无机样品的标记/无标记显微光学分析。
Description
技术领域
本发明属于生物光学、物理光学、医学影像学、分子成像技术领域,具体涉及模块化多模态显微光学分析系统。
背景技术
非线性显微成像和飞秒脉冲激光共聚焦成像是有更高空间分辨率的显微成像技术,它们能够克服传统显微镜的分辨极限,提供更清晰、更详细的图像信息。双光子荧光(Two Photo Excitation Fluorescence,TPEF)成像、二次谐波(Second HarmonicGeneration,SHG)成像、三次谐波(Third Harmonic Generation,THG)成像都是基于非线性光学效应的显微成像技术。其中TPEF显微镜无需共焦小孔的加入,从而荧光收集效率大大提高;SHG显微镜可以用来观察和研究材料的非中心对称结构,而不受样品吸收和荧光的影响;THG显微镜是一种无标记的散射过程,由水-脂质和水-蛋白界面引起,它允许在三维组织培养和小动物中检测细胞和分子细胞的功能。因此,TPEF、SHG、THG显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用,它们具有高分辨率、非侵入和无损伤性和三维成像的特点,可以实现对样品的快速成像和动态过程的观察,在生物学和材料科学等领域有广泛应用。
反射式激光共聚焦成像(Reflectance Confocal Laser Scanning Microscopy,RLSCM)是一种高分辨率显微成像技术,用于观察材料的表面形貌和光学特性。它可以用于观察材料表面的形貌、纹理、缺陷和微观结构等,并可以提供关于材料的光学和电子特性的信息。RLSCM技术的优点包括高分辨率、非接触式成像、无需标记样品、适用于不同类型的材料和样品,以及对样品的各个方向进行成像。它为研究材料的微观结构和表面特性提供了一种强大的工具。
激光共聚焦拉曼信号检测系统是一种用于分析样品的化学成分和结构的技术。它结合了共聚焦显微镜和拉曼光谱仪的原理。共聚焦光束到样品的一个小体积区域内,然后收集经过样品散射的光信号,这种聚焦光束的方式可以提供高分辨率的图像,并减少背景干扰;拉曼散射包含了关于样品的化学成分和结构的信息;拉曼散射信号经过光谱仪进行分光和检测,光谱仪可以解析不同频率的光子,并将其转换为可视化的拉曼光谱图;这些技术的结合使得激光共聚焦拉曼信号检测系统能够实现对样品的高分辨率成像和化学信息分析。它在材料科学、生物医学、环境监测等领域具有广泛的应用前景。
白光显微与标记荧光显微成像两种成像技术通常互补使用。白光显微用于常规显微观察和定位样本;标记荧光可以用于跟踪特定分子、细胞器或亚细胞结构,并进行定量分析。这种组合可以为生物学家提供更全面的视角,以研究生命科学中的各种现象。
因此,多模成像技术是目前医疗影像领域发展的重要方向,其能够结合各种成像技术各自的优点,实现对组织/细胞较大深度的高分辨率、高对比度度、高灵敏度的结构和功能多模态成像。多模态成像技术在癌症诊断与治疗监测、神经科学研究、细胞与组织成像等方面有重要应用前景。
发明内容
本发明旨在解决现有技术的不足,提出模块化多模态显微光学分析系统,旨在克服现有单一显微成像技术在显微分析过程中存在的不足,实现样品结构与生化组成信息的多尺度成像观测与多角度光谱分析,从而,更为全面地获取各类样品的微观形貌及其分子组成信息。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
模块化多模态显微光学分析系统,包括:脉冲激光激发模块、脉冲激光共聚焦成像模块、拉曼光谱激发模块、连续激光共聚焦显微成像模块、显微拉曼光谱分析模块、扫描振镜模块、显微物镜模块、三维样品台模块、非线性显微成像模块、白光显微与荧光标记成像模块以及分析系统;
所述脉冲激光激发模块,用于提供非线性显微成像与脉冲激光共聚焦显微成像的脉冲激光光源;
所述脉冲激光共聚焦成像模块,用于检测样品反射的脉冲激光信号,并利用所述脉冲激光信号进行共聚焦显微成像;
所述拉曼光谱激发模块,用于提供激发样品拉曼光谱的连续激光光源;
所述连续激光共聚焦显微成像模块,用于检测样品反射的连续激光信号,并利用所述连续激光信号进行共聚焦显微成像;
所述显微拉曼光谱分析模块,用于检测连续激光光源所激发的样品拉曼光谱信号,并进行样品特征拉曼光谱特征分析;
所述扫描振镜模块,用于进行飞秒激光在样品平面XY方向上的连续点扫描;
所述显微物镜模块,用于结合不同放大倍率的显微物镜,进行样品光信号激发与采集;
所述三维样品台模块,用于放置样品,并在三维XYZ方向移动样品,进行不同范围、不同位置的样品显微成像与光谱分析;
所述非线性显微成像模块,用于收集样品受脉冲激光激发后所发出的光学信号,并利所述光学信号进行不同功能的显微成像;
所述白光显微与荧光标记成像模块,用于进行样品白光显微成像与荧光显微成像分析;
所述分析系统,用于进行显微光学成像与光谱分析。
优选的,样品成像包括双光子荧光显微成像、二次谐波显微成像、三次谐波显微成像、脉冲激光共聚焦显微成像、连续激光共聚焦显微成像、白光显微成像和荧光显微成像七种显微光学成像;所述光谱分析包括显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析三种显微光谱分析。
优选的,所述脉冲激光激发模块,包括脉冲光纤激光器、第一光纤准直器、1/2波长片以及1/4波长片;
所述脉冲光纤激光器,用于发射波长为λ1的飞秒脉冲激光,实现所述双光子荧光显微成像、所述二次谐波显微成像、所述三次谐波显微成像以及所述脉冲激光共聚焦显微成像的功能;
所述第一光纤准直器,用于对波长为λ1的飞秒脉冲激光进行准直;
所述1/2波长片,用于获得不同偏振方向准直后的波长为λ1的飞秒脉冲激光;
所述1/4波长片,用于基于所述波长为λ1的飞秒脉冲激光,选择调节输出形式;其中,所述输出形式包括线偏振输出、椭圆偏振输出以及圆偏振输出。
优选的,所述脉冲激光共聚焦成像模块,包括第一偏振分束器,第一平凸透镜,第一小孔和第一雪崩光电二极管;
所述第一偏振分束器,用于将样品表面或内部发射的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,反射到所述第一小孔中;
所述第一平凸透镜,用于将所述波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号聚焦于所述第一小孔;
所述第一小孔,用于对聚焦的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号进行整形滤波;
所述第一雪崩光电二极管,用于检测滤波后的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,完成飞秒激光光信号的采集。
优选的,所述拉曼光谱激发模块,包括单纵模激光器、第二光纤准直器以及第一带通滤波片;
所述单纵模激光器,用于发射波长为λ2的连续功率可调单纵模激光,完成所述共聚焦显微成像、所述显微拉曼光谱分析、所述显微拉曼光谱成像和所述显微荧光光谱分析,所述单纵模激光器种类包括:气体激光器、半导体激光器、染料激光器与固体激光器;
所述第二光纤准直器,用于对波长为λ2的连续功率可调单纵模激光进行准直;
所述第一带通滤波片,用于过滤准直后的波长为λ2的连续功率可调单纵模激光的杂散光与边带光谱,获得选择性透过波长为λ2的特定波长激光。
优选的,所述连续激光共聚焦显微成像模块,包括第二偏振分束器、第二平凸透镜,第二小孔和第二雪崩光电二极管;
所述第二偏振分束器,用于将样品表面或内部发射的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号,反射到所述第二小孔中;
所述第二平凸透镜,用于将所述波长为λ2的连续共聚焦激光光信号聚焦于所述第二小孔;
所述第二小孔,用于对聚焦的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号进行整形滤波;
所述第二雪崩光电二极管,用于检测滤波后的波长λ2的连续共聚焦激光光信号,完成所述拉曼光光信号的采集。
优选的,所述显微拉曼光谱分析模块,包括第二二向色镜,长通滤波片,第三平凸透镜和光谱仪;
所述第二二向色镜,用于反射拉曼光谱信号;其中,所述拉曼光谱信号包括波长为λ2的激发光和透射样品反射的波长大于λ2的光谱信号光;
所述长通滤波片,用于滤除所述拉曼光谱信号中的瑞利散射光;
所述第三平凸透镜,用于聚焦滤除所述瑞利散射光的拉曼光谱信号;
所述光谱仪,用于测量聚焦后的所述拉曼光谱信号的波长和强度。
优选的,所述扫描振镜模块,包括扫描振镜,扫描透镜和套筒透镜;
所述扫描振镜,用于控制和调节激光光束方向,采用逐点扫描方式,实现扫描显微成像功能;
所述扫描透镜,用于提供平坦的像平面,固定整个扫描区域上的成像分辨率;
所述套筒透镜,用于调节所述激光光束聚焦位置和矫正像差。
优选的,所述非线性显微成像模块,包括二向色镜,带通滤波片,第四平凸透镜以及光电倍增管;
所述二向色镜,包括第四二向色镜和第五二向色镜,用于分离由波长为λ1的飞秒脉冲激发光及所述飞秒脉冲激光激发样品产生的波长分别为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号,将不同光信号导向到相应的检测通道;
所述带通滤波片,包括SHG带通滤波片、THG带通滤波片和TPEF带通滤波片,用于分别定向通过波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号并对光信号进行过滤,抑制背景噪声和非感兴趣的光信号;
所述第四平凸透镜,用于分别将过滤后的波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号进行聚焦;
所述光电倍增管,包括SHG光电倍增管、THG光电倍增管和TPEF光电倍增管,用于接收并放大聚焦光信号。
优选的,所述分析系统,包括控制软件系统与分析软件系统;
所述控制软件系统,用于协调所述脉冲激光光源、所述连续激光光源、所述扫描振镜模块、所述三维样品台模块、所述显微物镜模块、所述光谱仪、所述雪崩光电二极管、所述光电倍增管、CMOS相机之间的联合控制与运行,以实现显微光学成像与光谱分析功能。
所述分析软件系统,用于收集、记录、分析显微光学成像信号与光谱信号,并集成多种图像与光谱分析算法实现显微光学成像分析与光谱分析功能。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明模块化多模态显微光学分析系统可以获取双光子荧光显微成像、二次谐波显微成像、三次谐波显微成像、脉冲激光共聚焦显微成像、连续激光共聚焦显微成像、白光显微成像和荧光显微成像七种成像信息和显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析三种显微光谱分析功能,并在分析软件系统界面实现多种成像信息的同步观测;
(2)本发明模块化多模态显微光学分析系统操作简单,成像快速,检测难度降低;
(3)本发明模块化多模态显微光学分析系统采用扫描振镜与三维平移台的结合,再扫描过程中,极大的提高了扫描速度及扫描范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案,下面对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例的模块化多模态显微光学分析系统结构示意框图;
图2为本发明实施例的模块化多模态显微光学成像模块结构示意图;
图3为本发明实施例的非线性显微成像模块和飞秒脉冲式激光共聚焦显微成像模块结构示意图;
图4为本发明实施例的实现拉曼成像和激光共聚焦拉曼光谱检测的结构示意图;
图5为本发明实施例的白光显微与标记荧光显微成像模块结构示意图;附图说明:1-脉冲激光激发模块、101-脉冲光纤激光器、102-第一光纤准直器、103-1/2波长片、104-1/4波长片、2-脉冲激光共聚焦成像模块、21-第一偏振分束器、22-第一平凸透镜、23-第一小孔、24-第一雪崩光电二极管、3-第一二向色镜、4-拉曼光谱激发模块、41-单纵模激光器、42-第二光纤准直器、43-第一带通滤波片、5-连续激光共聚焦显微成像模块、51-第二偏振分束器、52-第二平凸透镜、53-第二小孔、54-第二雪崩光电二极管、6-显微拉曼光谱分析模块、61-第二二向色镜、62-长通滤波片、63-第三平凸透镜、64-光谱仪、7-扫描振镜模块、71-扫描振镜、72-扫描透镜、73-套筒透镜、8-第三二向色镜、9-非线性显微成像模块、900-第四二向色镜、901-THG带通滤波片、902-聚焦波长为λ1/2光信号的第四平凸透镜、903-THG光电倍增管、904-第五二向色镜、905-TPEF带通滤波片、906-聚焦波长为λ1/3光信号的第四平凸透镜、907-TPEF光电倍增管、908-SHG带通滤波片、909-聚焦波长大于λ1/2光信号的第四平凸透镜、910-SHG光电倍增管、10-可插拔反射镜、11-显微物镜模块、12-三维样品台模块、13-白光显微与荧光标记成像模块、130-非相干光源、131-光子晶体光纤、132-第三光纤准直器、133-飞轮滤光片组、134-分束镜、135-第五平凸透镜、136-CMOS相机。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
如图1所示,模块化多模态显微光学分析系统,包括:脉冲激光激发模块1、脉冲激光共聚焦成像模块2、拉曼光谱激发模块4、连续激光共聚焦显微成像模块5、显微拉曼光谱分析模块6、扫描振镜模块7、显微物镜模块11、三维样品台模块12、非线性显微成像模块9、白光显微与荧光标记成像模块13以及分析系统;还包括第一二向色镜3和第三二向色镜8,用于反射光,形成光路。
进一步的实施方式在于,样品成像包括双光子荧光显微成像、二次谐波显微成像、三次谐波显微成像、脉冲激光共聚焦显微成像、连续激光共聚焦显微成像、白光显微成像和荧光显微成像七种显微光学成像;光谱分析包括显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析三种显微光谱分析。
脉冲激光激发模块1,用于提供非线性显微成像与脉冲激光共聚焦显微成像的脉冲激光光源;
进一步的实施方式在于,脉冲激光激发模块1,包括脉冲光纤激光器101、第一光纤准直器102、1/2波长片103以及1/4波长片104;
脉冲光纤激光器101,用于发射波长为λ1的飞秒脉冲激光,实现双光子荧光显微成像、二次谐波显微成像、三次谐波显微成像以及脉冲激光共聚焦显微成像的功能;
第一光纤准直器102,用于对波长为λ1的飞秒脉冲激光进行准直;
1/2波长片103,用于获得不同偏振方向准直后的波长为λ1的飞秒脉冲激光;
1/4波长片104,用于基于波长为λ1的飞秒脉冲激光,选择调节输出形式;其中,输出形式包括线偏振输出、椭圆偏振输出以及圆偏振输出。
脉冲激光共聚焦成像模块2,用于检测样品反射的脉冲激光信号,并利用脉冲激光信号进行共聚焦显微成像;
进一步的实施方式在于,脉冲激光共聚焦成像模块2,包括第一偏振分束器21,第一平凸透镜22,第一小孔23和第一雪崩光电二极管24;
第一偏振分束器21,用于将样品表面或内部发射的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,反射到第一小孔23中;
第一平凸透镜22,用于将波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号聚焦于第一小孔23;
第一小孔23,用于对聚焦的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号进行整形滤波;
第一雪崩光电二极管24,用于检测滤波后的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,完成飞秒激光光信号的采集。
拉曼光谱激发模块4,用于提供激发样品拉曼光谱的连续激光光源;
进一步的实施方式在于,拉曼光谱激发模块4,包括单纵模激光器41、第二光纤准直器42以及第一带通滤波片43;
单纵模激光器41,用于发射波长为λ2的连续功率可调单纵模激光,完成共聚焦显微成像、显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析,单纵模激光器41种类包括:气体激光器、半导体激光器、染料激光器与固体激光器;
第二光纤准直器42,用于对波长为λ2的连续功率可调单纵模激光进行准直;
第一带通滤波片43,用于过滤准直后的波长为λ2的连续功率可调单纵模激光的杂散光与边带光谱,获得选择性透过波长为λ2的特定波长激光。
连续激光共聚焦显微成像模块5,用于检测样品反射的连续激光信号,并利用连续激光信号进行共聚焦显微成像;
进一步的实施方式在于,连续激光共聚焦显微成像模块5,包括第二偏振分束器51、第二平凸透镜52,第二小孔53和第二雪崩光电二极管54(Avalanche Photodiode,APD);
第二偏振分束器51,用于将样品表面或内部发射的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号,反射到第二小孔53中;
第二平凸透镜52,用于将波长为λ2的连续共聚焦激光光信号聚焦于第二小孔53;
第二小孔53,用于对聚焦的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号进行整形滤波;
第二雪崩光电二极管54,用于检测滤波后的波长λ2的连续共聚焦激光光信号,完成拉曼光光信号的采集。
显微拉曼光谱分析模块6,用于检测连续激光光源所激发的样品拉曼光谱信号,并进行样品特征拉曼光谱特征分析;
进一步的实施方式在于,显微拉曼光谱分析模块6,包括第二二向色镜61,长通滤波片62,第三平凸透镜63和光谱仪64;
第二二向色镜61,用于反射拉曼光谱信号;其中,拉曼光谱信号包括波长为λ2的激发光和透射样品反射的波长大于λ2的光谱信号光;
长通滤波片62,用于滤除拉曼光谱信号中的瑞利散射光;
第三平凸透镜63,用于聚焦滤除瑞利散射光的拉曼光谱信号;
光谱仪64,用于测量聚焦后的拉曼光谱信号的波长和强度。
扫描振镜模块7,用于进行飞秒激光在样品平面XY方向上的连续点扫描;
进一步的实施方式在于,扫描振镜模块7,包括扫描振镜71,扫描透镜72和套筒透镜73;
扫描振镜71,用于控制和调节激光光束方向,采用逐点扫描方式,实现扫描显微成像功能;
扫描透镜72,用于提供平坦的像平面,固定整个扫描区域上的成像分辨率;
套筒透镜73,用于调节激光光束聚焦位置和矫正像差。
显微物镜模块11,用于结合不同放大倍率的显微物镜,进行样品光信号激发与采集;
进一步的实施方式在于,显微物镜模块11,用于聚焦激发光并收集样品产生的信号光,并可根据实际需要更换不同类型(例如:干镜、水浸显微物镜、油浸显微物镜)、不同放大倍率(例如:30×、50×、60×、80×、100×等)、不同数值孔径(例如:数值孔径=0.6、0.8、1.1、1.2等)参数的显微物镜。
三维样品台模块12,用于放置样品,并在三维XYZ方向移动样品,进行不同范围、不同位置的样品显微成像与光谱分析;
进一步的实施方式在于,三维样品台模块12,包括压电平移台和步进平移台,均可由控制软件系统控制;
压电平移台,用于在纳米级精度中实现物镜的精细对焦调节和高速Z-stack图像采集,以实现3D快速扫描;
步进平移台,用于在微米级精度中实现样品在XYZ方向上精确的运动;
非线性显微成像模块9,用于收集样品受脉冲激光激发后所发出的光学信号,并利光学信号进行不同功能的显微成像;
进一步的实施方式在于,非线性显微成像模块9,包括二向色镜,带通滤波片,第四平凸透镜以及光电倍增管(PhotomultiplierTube);
二向色镜,包括第四二向色镜900和第五二向色镜904,用于分离由波长为λ1的飞秒脉冲激发光及飞秒脉冲激光激发样品产生的波长分别为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号,将不同光信号导向到相应的检测通道;
带通滤波片,包括SHG带通滤波片908、THG带通滤波片901和TPEF带通滤波片905,用于分别定向通过波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号并对光信号进行过滤,抑制背景噪声和非感兴趣的光信号;
第四平凸透镜,用于分别将过滤后的波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号进行聚焦;第四平凸透镜具体包括聚焦波长为λ1/2光信号的第四平凸透镜902、聚焦波长为λ1/3光信号的第四平凸透镜906以及聚焦波长大于λ1/2光信号的第四平凸透镜909;
光电倍增管,包括SHG光电倍增管910、THG光电倍增管903和TPEF光电倍增管907,用于接收并放大聚焦光信号。
白光显微与荧光标记成像模块13,用于进行样品白光显微成像与荧光显微成像分析。
进一步的实施方式在于,白光显微与荧光标记成像模块13,包括非相干光源130,光子晶体光纤131,第三光纤准直器132,飞轮滤光片组133,分束镜134,第五平凸透镜135和CMOS相机136;
非相干光源130,用于发射波长为400nm至760nm的可见光光源,实现白光显微成像和荧光显微成像;
光子晶体光纤131,传导波长为380-750nm可见光,有效控制白光传输过程中的色散特性,并确保在很宽带宽范围内仅有一个模式的光传输;
第三光纤准直器132,用于对所述白光光源进行准直;
飞轮滤光片组133,用于选择光源波长作为标记荧光激发波长;
分束镜134,用于将白光显微成像过程中样品产生的透射以及反射的光信号以及荧光标记成像过程中样品中荧光标记染料所产生的光信号,反射向第五平凸透镜;
第五平凸透镜135,用于将所述光信号聚焦;
CMOS相机136,用于捕获被观察样品的图像。
特别的,本实施例中,参见图2所示,第一二向色镜3可透过波长为λ1的脉冲激光和反射波长为λ2的连续激光,实现拉曼光谱激发模块4、连续共聚焦显微成像模块5、显微拉曼光谱分析模块6在光路中的引入,可插拔反射镜10用于将和白光显微和标记荧光显微成像模块13引入系统光路中。
进一步的,本实施例中,参见图2所示,白光显微与荧光标记成像需独立探测,不能与其他探测模块同时进行测量。
进一步的,本实施例中,参见图3所示,所述的非线性显微成像和脉冲激光共聚焦成像包括脉冲激光激发模块1、扫描振镜模块3、显微物镜11、三维样品台模块12、第三二向色镜8、非线性显微成像模块9和脉冲激光共聚焦成像模块2。波长为的λ1脉冲光纤激光器101发射的激光通过光纤传输至第一光纤准直器102进行激光准直,准直后的激光光源照射到1/2波长片103和1/4波长片104上,进行激光偏振态的选择,得到想要的激发光,激发光依次入射到扫描振镜71、扫描透镜72和套筒透镜73上,经显微物镜模块11会聚光束,调节三维样品台模块12,使样品被定位到显微物镜模块11焦平面处,启动扫描振镜71对样品实现逐点扫描,样品发射出的信号光被非线性显微成像模块9中的光电倍增管和脉冲激光共聚焦成像模块6的第一雪崩光电二极管24探测。
进一步的,本实施例中,参见图3所示,所述的非线性显微成像模块9中的光电倍增管从左到右依次采集三次谐波信号、双光子荧光信号和二次谐波信号。首先,样品激发出的信号光经第四二向色镜900进行分离,滤除参与λ1激发光的成分。然后,反射的三次谐波信号经过THG带通滤波片901,滤除杂散光和边带光谱,并通过平凸透镜902聚焦到THG光电倍增管903中。接着,经过第四二向色镜900的双光子荧光信号和二次谐波信号被第五二向色镜904分开,分别透射和反射。对于二次谐波信号光和双光子荧光信号,它们分别经过SHG的带通滤波片908和TPEF带通滤波片905,滤除杂散光和边带光谱,然后分别通过平凸透镜(聚焦波长为λ1/2光信号的第四平凸透镜902、聚焦波长为λ1/3光信号的第四平凸透镜906以及聚焦波长大于λ1/2光信号的第四平凸透镜909),最终被聚焦到SHG光电倍增光电倍增管910和TPEF光电倍增管907中。这个模块的配置允许从样品中获取不同类型的信号,并通过适当的光学滤波和透镜来精确采集这些信号,以实现非线性显微成像。
进一步的,本实施例中,参见图3所示,脉冲激光共聚焦成像模块2包括第一偏振分束器21对光信号进行反射至第一平凸透镜22聚焦于滤光第一小孔23对非焦点处光信号滤光,滤除后的信号光被第一雪崩光电二极管24采集。
进一步的,本实施例中,参见图4所示,连续激光共聚焦显微成像模块5包括反射的拉曼信号光经第二偏振分束器51反射,经过第二平凸透镜52聚焦于滤光第二小孔53滤除非焦点信号光,滤除后的信号光被第二雪崩光电二极管54采集。
进一步的,本实施例中,参见图4所示,显微拉曼光谱分析模块6是在扫描振镜71不在扫描状态时对样品固定位置进行拉曼信号采集的系统。对样品感兴趣区域进行拉曼信号采集时,在控制软件系统上调节扫描振镜71扫描点的位置信息,将其定位到探测样品的感兴趣区域,激光照射样品激发的信号光被显微拉曼光谱分析模块6接收,其中样品拉曼信号光被第二二向色镜61反射,样品拉曼光谱被第二二向色镜61透射,透射的拉曼光谱信号通过长通滤波片62滤除样品拉曼光谱信息中的瑞利散色光,得到滤除后拉曼光谱信息,并通过第三平凸透镜63聚焦于光谱仪64光纤当中,获取拉曼光谱信息。
进一步的,本实施例中,参见图5所示,所述的白光显微和荧光标记成像将由置于扫描振镜模块2与显微物镜模块11之间的可插拔反射镜10引入系统当中,非相干光源130用于发射白光光源并选用光子晶体光纤131耦合传输,飞轮滤光片组133中装有不同波段的带通滤波片,用于选择性的透过不同波段的光源,光源透过分束镜134后经可插拔反射镜反射并在显微物镜中聚焦于样品,样品被激发产生的信号光经分束镜134反射与第五平凸透镜135聚焦于CMOS相机136当中。
实施例二
分析系统,用于进行显微光学成像与光谱分析。
进一步的实施方式在于,分析系统,包括控制软件系统与分析软件系统;
控制软件系统,用于协调脉冲激光光源、连续激光光源、扫描振镜模块7、三维样品台模块12、显微物镜模块11、光谱仪64、雪崩光电二极管、光电倍增管、CMOS相机136之间的联合控制与运行,以实现显微光学成像与光谱分析功能。
分析软件系统,用于收集、记录、分析显微光学成像信号与光谱信号,并集成多种图像与光谱分析算法实现显微光学成像分析与光谱分析功能。
实施例三
本发明模块化多模态显微成像及其分析系统的操作步骤如下:
(1)首先进行非线性显微成像和脉冲激光共聚焦成像。将可插拔反射镜10开光置于off档位,以确保其不在系统光路当中。将样品置于三维样品台模块12上,接着打开脉冲光纤激光器101,通过调节1/2波长片和1/4波长片选取所需的偏振态,可以是线偏振、椭圆偏振或圆偏振,调节步进平移台,使样品粗略置于显微物镜焦平面处,启动光电倍增管和雪崩光电二极管并打开控制软件系统,对样品进行连续逐点扫描,利用分析软件系统实时图像显示功能观察成像效果,并通过调节压电平移台控制软件来改变物镜焦平面在样品上Z方向的位置,实现精准对焦。通过实时观测图像,获取样品的双光子荧光、二次谐波、三次谐波和脉冲激光共聚焦信号的最佳成像位置。
(2)步骤(1)中信号探测完毕后,关掉脉冲光纤激光光源与信号探测器,再控制软件系统中暂停振镜的扫描状态。
(3)然后进行连续共聚焦显微成像。打开单纵模激光器41,启动雪崩光电二极管并开启振镜的扫描状态,进而在分析软件系统实时图像显示界面观察共聚焦拉曼成像效果。
(4)再然后进行拉曼光谱信号检测。暂停上述步骤(3)中振镜的扫描状态,开启光谱仪,对上述步骤(3)所成图像的感兴趣区域用控制软件系统对扫描振镜71的位置进行固定,使其打到目标区域,最终在光谱仪64上得到光谱数据。
(5)步骤(3)(4)信号探测完毕后,关掉单纵模激光器41与信号探测器,关掉扫描振镜电源。
(6)最后进行白光显微与荧光标记成像。将插拔式反射镜10开启ON挡位,将白光显微与荧光标记成像模块13引入系统光路中,根据研究目的选择适当的荧光标记物(荧光染料、荧光蛋白等),并对样品进行标记。选取滤光片,以适应所选的荧光标记物的激发波长和荧光发射波长。启动非相干光源,调整激发波长和强度,确保适当的激发条件。荧光信号由样品发射,并通过显微物镜收集后被CMOS相机136采集获取图像。
(7)在完成成像后,检查关闭所有光源和成像系统。
本发明能够实现从分子、细胞到组织的高分辨率、高对比对、高灵敏度的结构与功能成像。并且通过将不同的成像技术结合起来,可以同时获得组织的不同结构与功能参数。
以上所述的实施例仅是对本发明优选方式进行的描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,包括:脉冲激光激发模块、脉冲激光共聚焦成像模块、拉曼光谱激发模块、连续激光共聚焦显微成像模块、显微拉曼光谱分析模块、扫描振镜模块、显微物镜模块、三维样品台模块、非线性显微成像模块、白光显微与荧光标记成像模块以及分析系统;
所述脉冲激光激发模块,用于提供非线性显微成像与脉冲激光共聚焦显微成像的脉冲激光光源;
所述脉冲激光共聚焦成像模块,用于检测样品反射的脉冲激光信号,并利用所述脉冲激光信号进行共聚焦显微成像;
所述拉曼光谱激发模块,用于提供激发样品拉曼光谱的连续激光光源;
所述连续激光共聚焦显微成像模块,用于检测样品反射的连续激光信号,并利用所述连续激光信号进行共聚焦显微成像;
所述显微拉曼光谱分析模块,用于检测连续激光光源所激发的样品拉曼光谱信号,并进行样品特征拉曼光谱特征分析;
所述扫描振镜模块,用于进行飞秒激光在样品平面XY方向上的连续点扫描;
所述显微物镜模块,用于结合不同放大倍率的显微物镜,进行样品光信号激发与采集;
所述三维样品台模块,用于放置样品,并在三维XYZ方向移动样品,进行不同范围、不同位置的样品显微成像与光谱分析;
所述非线性显微成像模块,用于收集样品受脉冲激光激发后所发出的光学信号,并利所述光学信号进行不同功能的显微成像;
所述白光显微与荧光标记成像模块,用于进行样品白光显微成像与荧光显微成像分析;
所述分析系统,用于进行显微光学成像与光谱分析。
2.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,样品成像包括双光子荧光显微成像、二次谐波显微成像、三次谐波显微成像、脉冲激光共聚焦显微成像、连续激光共聚焦显微成像、白光显微成像和荧光显微成像七种显微光学成像;所述光谱分析包括显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析三种显微光谱分析。
3.根据权利要求2所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述脉冲激光激发模块,包括脉冲光纤激光器、第一光纤准直器、1/2波长片以及1/4波长片;
所述脉冲光纤激光器,用于发射波长为λ1的飞秒脉冲激光,实现所述双光子荧光显微成像、所述二次谐波显微成像、所述三次谐波显微成像以及所述脉冲激光共聚焦显微成像的功能;
所述第一光纤准直器,用于对波长为λ1的飞秒脉冲激光进行准直;
所述1/2波长片,用于获得不同偏振方向准直后的波长为λ1的飞秒脉冲激光;
所述1/4波长片,用于基于所述波长为λ1的飞秒脉冲激光,选择调节输出形式;其中,所述输出形式包括线偏振输出、椭圆偏振输出以及圆偏振输出。
4.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述脉冲激光共聚焦成像模块,包括第一偏振分束器,第一平凸透镜,第一小孔和第一雪崩光电二极管;
所述第一偏振分束器,用于将样品表面或内部发射的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,反射到所述第一小孔中;
所述第一平凸透镜,用于将所述波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号聚焦于所述第一小孔;
所述第一小孔,用于对聚焦的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号进行整形滤波;
所述第一雪崩光电二极管,用于检测滤波后的波长为λ1的飞秒脉冲激光光信号,完成飞秒激光光信号的采集。
5.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述拉曼光谱激发模块,包括单纵模激光器、第二光纤准直器以及第一带通滤波片;
所述单纵模激光器,用于发射波长为λ2的连续功率可调单纵模激光,完成共聚焦显微成像、显微拉曼光谱分析、显微拉曼光谱成像和显微荧光光谱分析,所述单纵模激光器种类包括:气体激光器、半导体激光器、染料激光器与固体激光器;
所述第二光纤准直器,用于对波长为λ2的连续功率可调单纵模激光进行准直;
所述第一带通滤波片,用于过滤准直后的波长为λ2的连续功率可调单纵模激光的杂散光与边带光谱,获得选择性透过波长为λ2的特定波长激光。
6.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述连续激光共聚焦显微成像模块,包括第二偏振分束器、第二平凸透镜,第二小孔和第二雪崩光电二极管;
所述第二偏振分束器,用于将样品表面或内部发射的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号,反射到所述第二小孔中;
所述第二平凸透镜,用于将所述波长为λ2的连续共聚焦激光光信号聚焦于所述第二小孔;
所述第二小孔,用于对聚焦的波长为λ2的连续共聚焦激光光信号进行整形滤波;
所述第二雪崩光电二极管,用于检测滤波后的波长λ2的连续共聚焦激光光信号,完成所述拉曼光光信号的采集。
7.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述显微拉曼光谱分析模块,包括第二二向色镜,长通滤波片,第三平凸透镜和光谱仪;
所述第二二向色镜,用于反射拉曼光谱信号;其中,所述拉曼光谱信号包括波长为λ2的激发光和透射样品反射的波长大于λ2的光谱信号光;
所述长通滤波片,用于滤除所述拉曼光谱信号中的瑞利散射光;
所述第三平凸透镜,用于聚焦滤除所述瑞利散射光的拉曼光谱信号;
所述光谱仪,用于测量聚焦后的所述拉曼光谱信号的波长和强度。
8.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述扫描振镜模块,包括扫描振镜,扫描透镜和套筒透镜;
所述扫描振镜,用于控制和调节激光光束方向,采用逐点扫描方式,实现扫描显微成像功能;
所述扫描透镜,用于提供平坦的像平面,固定整个扫描区域上的成像分辨率;
所述套筒透镜,用于调节所述激光光束聚焦位置和矫正像差。
9.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述非线性显微成像模块,包括二向色镜,带通滤波片,第四平凸透镜以及光电倍增管;
所述二向色镜,包括第四二向色镜和第五二向色镜,用于分离由波长为λ1的飞秒脉冲激发光及所述飞秒脉冲激光激发样品产生的波长分别为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号,将不同光信号导向到相应的检测通道;
所述带通滤波片,包括SHG带通滤波片、THG带通滤波片和TPEF带通滤波片,用于分别定向通过波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号并对光信号进行过滤,抑制背景噪声和非感兴趣的光信号;
所述第四平凸透镜,用于分别将过滤后的波长为λ1/2,λ1/3以及波长大于λ1/2的三种特定波段范围的光信号进行聚焦;
所述光电倍增管,包括SHG光电倍增管、THG光电倍增管和TPEF光电倍增管,用于接收并放大聚焦光信号。
10.根据权利要求1所述的模块化多模态显微光学分析系统,其特征在于,所述分析系统,包括控制软件系统与分析软件系统;
所述控制软件系统,用于协调所述脉冲激光光源、连续激光光源、扫描振镜模块、三维样品台模块、显微物镜模块、光谱仪、雪崩光电二极管、光电倍增管、CMOS相机之间的联合控制与运行,以实现显微光学成像与光谱分析功能;
所述分析软件系统,用于收集、记录、分析显微光学成像信号与光谱信号,并集成多种图像与光谱分析算法实现显微光学成像分析与光谱分析功能。
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