CN115078326A - 一种结合光镊的受激拉曼显微成像装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于单细胞化学成像技术领域，具体为一种结合光镊的受激拉曼显微成像装置。本发明装置包括激光光镊光路、拉曼成像光路以及显微镜等；光镊光路将激光通过二向色镜耦合到显微镜物镜实现强聚焦而形成强的梯度力光阱；拉曼光路包含时域同步、空间重合的两路脉冲光，两路脉冲激光经扫描振镜扫描后由光路系统耦合到显微镜实现光束在样品上的二维扫描；光镊采用位置敏感探测器实现细胞等样品位置的实时记录，拉曼成像采用光电倍增管或光电探测器经锁相放大后输出。共定位的拉曼光源通过扫描可实现样品多种组分的化学成像。所发明的装置可用来对细胞中多种化学成分进行拉曼共定位成像，在细胞组分分析和组分分布测量等领域具有重要的应用。

Description

一种结合光镊的受激拉曼显微成像装置

技术领域

本发明属于单细胞化学成像技术领域，具体涉及一种受激拉曼显微成像装置。

背景技术

新陈代谢为一切生命活动提供物质和能量，也是最基本的生命特征。细胞代谢是人体细胞与外界物质进行能量交换和相互转化的过程。不同细胞代谢周期不同，如红细胞需要120天左右。新陈代谢过程中，细胞的成分和分布会发生变化。如何探测细胞组分的变化依赖于合适的探测手段。19世纪20年代，C.V. Raman发现拉曼散射效应。特定能量的光子照射到分子上，会发生非弹性散射，光子的部分能量被分子吸收，散射光子比入射光子具有更低的能量，该红移光子也叫斯托克斯光子。拉曼成像可特异性识别细胞中的核酸、蛋白质、脂质等成分。被吸收的能量依赖于分子的振动频率，一般在100cm^-1到3500 cm^-1之间。拉曼谱可用来区分化学结构，拉曼谱不仅具有特异性，且对环境干扰具有很强的鲁棒性。然而，自发拉曼信号通常很弱，得到可靠信噪比的图像通常需要较长时间。

受激拉曼散射（SRS，Stimulated Raman Scattering）比自发拉曼散射具有更强的信号。将泵浦光和斯托克斯光同时照到样品上，即可激发受激拉曼，如果两束光的频率差与样品分子振动频率吻合，可产生受激发射振动跃迁。通过对样品或者光束扫描可实现受激发拉曼显微成像。SRS信号与成分浓度成正比，是无标记定量分析某种化学成分浓度的强大工具。

相干反斯托克斯散射（CARS，Coherent Anti-stokes Raman Scattering）是四波混频过程，产生新的蓝移成分，即反斯托克斯波。当能量差与分子振动匹配时，产生信号会发生相干增强。CARS可以实现无损伤、无标记的分子成像。这在脂质体等小分子成像上尤其重要，因为荧光标记会显著地影响分子的性能。由分子振动引起的相干放大使得CARS光具有很好的方向性，有利于信号的收集。CARS的积分时间比自发拉曼小几个数量级，且仍能保持很好的图像保真度。CARS信号波长比激发波长小，容易在光谱上与单光子激发荧光分开。

现有技术对细胞的观测多在固态基底附近，或在生物组织支撑下观察。在离体培养时，细胞往往处于营养液环境，并不断发生位置变化，对细胞的实时动态观察往往受制于布朗运动以及成像速度。对游离细胞的成像受制于成像速度以及细胞的动态运动，特别地，对利用扫描生成图像的技术，难以对游离细胞进行成像，主要由于单帧扫描的时间长，且在单帧扫描时间内细胞做布朗运动会造成像模糊。

光学技术的发展不仅能促进人们观察细胞的形态，还能够使得用激光无接触地操控细胞和细胞器成为可能。光束在强汇聚后形成强的光强梯度，对其中的粒子施加光强梯度力。以梯度力光阱为特征的光镊由A. Ashkin发明后，在从单分子到单细胞等多尺度交叉学科具有广泛的应用。A.Ashkin因光镊的发明以及在生物学中的应用而获得2018年诺贝尔物理学奖。光镊具有亚皮牛力以及亚纳米位移测量精度，通过光镊可以捕获细胞、细菌等。

本发明拟针对生物医学工程应用中需要对细胞组分以及分布进行检测，结合单光束梯度力光镊和拉曼成像对细胞中化学成分分布进行分析。通过光镊可抑制布朗运动并减少拉曼成像的像模糊效应。本发明将有助于促进细胞水平对物质和能量分布以及细胞新陈代谢研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对悬浮细胞进行化学成像的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，用于对细胞中不同成分空间分布的测量以及细胞层次新陈代谢的监测。

本发明提供的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，采用激光光镊固定细胞并对细胞进行拉曼成像，包括，激光光镊、拉曼显微镜以及两者的耦合；装置可以做受激拉曼成像，也可以做相干反斯托克斯成像或者同时做两种模式的成像；其中：

所述激光光镊，包括依次光路连接的光镊激光、高数值孔径的显微镜物镜、微流道样品池、搜集物镜、成像管镜、位置敏感探测器以及必要的透镜和反射镜等；激光光镊主要由高数值孔径的显微镜物镜将激光束聚焦到衍射极限大小，通常约200-500 nm；在光斑附近的微米/纳米粒子会因光强梯度力的作用被吸引到光镊中；

所述光镊采用近红外激光对细胞等生物粒子进行无接触、无损伤捕获，并对细胞进行无接触的固定，为细胞实现较长时间扫描成像提供稳定的位置固定；对细胞等生物粒子，一般采用近红外激光进行无接触、无损伤捕获，以及对细胞进行无接触的固定；光镊无接触地稳定固定细胞，极大地抑制在较长扫描时间内的像模糊效应；

所述拉曼显微镜，包括依次光路连接的两个脉冲激光、扫描转镜、扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜、搜集透镜、成像管镜、滤波片、光电倍增管以及锁相放大器等；两个脉冲激光可在时域上以及空间上同步；

所述拉曼显微镜通过泵浦光和斯托克斯光与样品的相互作用实现共振拉曼成像（SRS）或者相干反斯托克斯（CARS）成像；通过调节光电倍增管前的滤波片的透过率波段，可以实现共振拉曼成像和相干反斯托克斯成像的切换；也可以设计双通道分别实现受激拉曼成像和相干反斯托克斯成像；

所述的激光光镊和拉曼成像的耦合，采用双色镜（如标号110）将光镊激光和拉曼激发光耦合到显微镜系统；再采用双色镜（如标号116）将光镊激光和拉曼信号光（包括受激拉曼散射或者相干反斯托克斯散射光）在空间上分开；

所述的激光光镊，采用与拉曼显微镜激发光与发射光光谱不重叠的激光实现；光镊的中心波长可以是比斯托克斯谱线更长的波长，或者比反斯托克斯谱线更短的波长，也可以是介于斯托克斯（反斯托克斯）谱线与拉曼激发光之间的任何波长。

其中，扫描转镜、扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜组成拉曼显微镜的扫描单元；由扫描振镜对共轴的拉曼泵浦光源和探测光进行二维角度扫描，再经扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜后，对空间上重合的两个光斑在样品上实现二维扫描。由于泵浦光和探测光在空间上重叠，因而在扫描过程中，能够在样品空间上重叠；同时由于在其中一条光路引出延迟调制单元，能够确保两个脉冲序列在样品上实现时间同步。时间和空间的同时同步为激发拉曼信号提供可能。

所述的拉曼成像通过扫描单元对两个空间上重合的激光束进行扫描，并经过激发样品后由光电倍增管搜集到受激拉曼散射或相干反斯托克斯信号后，再由计算机重构的二维图像。

光镊部分和拉曼显微镜分别设有各自的探测单元。

光镊部分的探测单元采用位置敏感探测器，并结合后焦面干涉法，对光镊中捕获的粒子的位置进行高精度的探测。由于直接探测捕获激光的信号，需要引入中性密度衰减片对激光功率进行适当调整。

拉曼显微镜部分的探测单元，采用高灵敏度的光电倍增管，对拉曼信号进行探测。由于拉曼信号的强度比较弱，需要结合锁相放大器对信号进行放大。为实现锁相放大，需要对拉曼激发光的强度进行调制，这里的调制信号将做为锁相放大的参考输入。光电倍增管的信号只有频率与拉曼激发光调制频率一致的信号被放大输出。

拉曼成像通过光束扫描实现二维受激拉曼图像的采集，拉曼成像可针对细胞中特定成分，如脂质体、水、蛋白质等进行无标记、多组分成像。

本发明结合光镊和拉曼显微镜，实验时无标记的细胞通过微流道样品池流过激光光镊捕获区域。当待测细胞被光镊捕获时，位置敏感探测器上记录细胞的实时位置信号，减小微流道里流体速度，位置敏感探测器的信号涨落逐渐趋于稳定。光镊信号可通过功率谱密度进行标定。再测量位置信号的均方差，确保位置信号均方差小于拉曼成像扫描步长的一半，以减少像模糊。再启用拉曼成像单元，对待测细胞进行扫描拉曼成像，扫描区域大小可根据待测细胞大小进行调节，一般需覆盖光镊捕获细胞的区域。

结合光镊与拉曼扫描成像装置可以是基于自行搭建的显微镜系统，也可以在商用显微镜上改造实现。拉曼显微镜部分可以实现受激拉曼散射成像或者相干反斯托克斯成像。由于斯托克斯和反斯托克斯谱线在频谱空间自然分离，也可以集成两种成像模式。

本发明实验装置的优点、特点：

常规拉曼显微镜只能对固定在固态基底上的样品进行成像。对悬浮在液体中的颗粒物状样品，由于受布朗运动、拉曼扫描的时间迟滞等影响，并不能形成稳定的图像。而细胞等天然的成长环境多在液态或者软物质环境。因此，需要研发对细胞等进行无损伤、无接触地固定方法。本发明采用光镊束缚细胞，用拉曼显微镜实现化学成像。

结合光镊的拉曼成像显微镜实现两者各自无法实现的功能，如常规拉曼显微镜无法通过扫描实现液体中细胞的化学成像，而光镊本身也无法对细胞进行化学成像。

附图说明

图1为本发明结合激光光镊的受激拉曼成像系统示意图。

图2为本发明结合激光光镊的相干反斯托克斯拉曼成像系统示意图。

图3为受激拉曼散射成像的能级图。

图4为相干反斯托克斯拉曼成像的能级图。

图5为实验过程示意图。图中，圆球示意被光镊捕获的细胞。实线表示受激拉曼成像逐点扫描方向，虚线表示光束切换到下一行但并无信号记录。

图6光镊波长选择。

图中标号：101为第一激光器，102为延迟和调制单元，103为第一双色镜，104为第二激光器，105为第一反射镜，106为二维扫描转镜，107为扫描透镜，108为第一成像管镜，109为第三激光器，110为第二双色镜，111为显微镜物镜，112为微流道样品池，113为聚光镜，114为第二反射镜，115为第二成像管镜，116为第三双色镜，117为滤色片，118为光电倍增管，119为位置敏感探测器，120为锁相放大器。

201为第一激光器，202为延迟和调制单元，203为第一双色镜，204为二维扫描振镜，205为第二激光器，206为第一反射镜，207为扫描透镜，208为第一成像管镜，209为照明光源，210为第二反射镜，211为第三激光器，212为半波片，213为偏振分束棱镜，214为第一透镜，215为第二双色镜，216为第二透镜，217为第三双色镜，218为第一显微镜物镜，219为微流道样品池，220为第二显微镜物镜，221为第四双色镜，222为第二成像管镜，223为第一滤波片，224为成像相机，225为第五双色镜，226为第三成像管镜，227为第二滤波片，228为光电倍增管，229为第三反射镜，230为中继透镜，231为第三滤波片，232为位置敏感探测器。

具体实施方式

参照附图描述的结合光镊的受激拉曼成像系统。附图示出本发明的示例性实施例，不限制由权利要求限定的保护范围。

本发明结合激光光镊和拉曼成像于一体，能够在对细胞等颗粒物进行光学操控的同时，实现对其化学成分进行成像。实施例的说明仅结合具体某种拉曼成像进行描述。然而，拉曼成像可以采用受激拉曼散射成像模式，也可以采用相干反斯托克斯拉曼成像模式，也可以同时结合两种成像模式。已有拉曼成像显微镜只能对与玻片底部的细胞进行化学成像，本发明所要实现的成像方式能够对悬浮在培养液中的细胞进行捕获的同时进行化学成像，这有效地保证了细胞完全浸没在天然环境中。

所述的光镊部分由独立的激光光源通过双色镜与拉曼成像光源同时耦合进显微镜。

所述的拉曼成像光路中光源由两个时间上同步空间上重叠的激光实现。

所述的拉曼扫描单元由扫描振镜、扫描透镜等构成。

所述的显微镜部分由高数值孔径的显微镜物镜、微流道样品池、成像物镜等构成。

所述的探测部分包括光镊探测部分和拉曼成像探测部分。

所述的光镊探测通过位置敏感探测器实现，位置敏感探测器的安装位置为与探测物镜的后焦面经透镜成像的位置。

所述的拉曼成像的探测通过光电倍增管采集，并通过锁相放大器放大输出，拉曼成像泵浦光的调制信号同时输入给锁相放大器作为参考信号。

在以下有关附图的描述中，每个技术特征具有指示在哪个附图中给出所述技术特征的在前数字。下面结合实施例和附图来详细说明本发明。

实施例1，结合激光光镊的受激拉曼成像装置。

其结构如图1所示，包括：第一激光器101，延迟和调制单元102，第一双色镜103，第二激光器104，第一反射镜105，二维扫描转镜106，扫描透镜107，第一成像管镜108，第三激光器109，第二双色镜110，显微镜物镜111，微流道样品池112，聚光镜113，第二反射镜114，第二成像管镜115，第三双色镜116，滤色片117，光电倍增管118，位置敏感探测器119，锁相放大器120等。此实施例适合于无荧光标记的细胞。

拉曼激光器101和104经第一双色镜103在空间重叠，再由扫描振镜106对双光束进行角度扫描。经振镜二维角度扫描的这两个波长的激光经扫描透镜107，成像管镜108，和第一显微镜物镜111后，转化为两光束在样品平面的二维扫描。

拉曼散射成像可根据需求，使用飞秒或皮秒激光器激发。飞秒激发可使用光谱物理的超快激光器(InSight X3)，该激光器能输出两个同步光束，其中固定波长1045 nm，可调谐波长范围为690-1300nm，120fs，80MHz重复频率，两个同步的双光束输出能做受激拉曼散射成像和相干反斯托克斯成像。光镊激光波长可选为532 nm或者650 nm等，以与拉曼显微成像的激发和发射波长从光谱上错开。

皮秒双色激光器可采用NKT公司的绿光皮秒泵浦激光器与光学参量振荡器（如APE公司的Levante Emerald 2ps）实现，其中绿光泵浦的波长为515 nm，光学参量振荡器的调节波长为640至960nm。为避免光镊激光波长与拉曼成像的激发和探测波长在光谱上重叠，光镊激光可采用波长为1064 nm或者1500 nm的激光。

泵浦光与斯托克斯光的脉冲需要同时到达样品同一位置，因而在其中一路需要加上延迟单元调节两个脉冲序列的时间延迟，同时，在其中一路需要使用一对反射镜调节两束光的相对位置。为使系统的结构紧凑，这里将强度调制和时间延迟单元102集成在一起。

其中，对微米级介电粒子的操控采用单光镊实现，对粒子位置的监测采用后焦面探测实现。受激拉曼信号或相干反斯托克斯成像信号经光电倍增管（118）探测后，通过锁相放大器120输出，其中光强调制单元102的调制信号为锁相放大的参考信号。

光镊光路自光源109，经第二双色镜110耦合到主光路并经第一显微镜物镜111聚焦后形成激光光镊，前向透过样品池的捕获激光经第二显微镜物镜113搜集后，再经第二反射镜114反射以及第二成像管镜115，第三双色镜116，进入位置敏感探测器119。其中第二成像管镜115将第二显微镜物镜113的后焦面成像到位置敏感探测器119上。

优选地，扫描振镜106可使用Cambridge Technologies的6200H系列（Galvo），Thorlabs的双轴GVS102镀金膜的二维振镜系统，或者金海创科技的SG1105型高速二维振镜。

透镜等可采用商业器件，唯有在对应波长处具有较高的透过率，以及适当的能够覆盖对应波长激光的频率宽度。

反射镜可选择任一家商业公司的产品，唯有在对应带宽处具有较高的反射率，对可见光波段，优先选择镀银膜的反射镜；对近红外波段，优先选择镀金属膜（金，银）的反射镜；也可以选择在各自波段具有较高反射率的介质膜反射镜。

实施例2，结合激光光镊的相干反斯托克斯拉曼成像装置。

其结构如如图2所示。包括：第一激光器201，延迟和调制单元202，第一双色镜203，二维扫描振镜204，第二激光器205，第一反射镜206，扫描透镜207，第一成像管镜208，照明光源209，第二反射镜210，第三激光器211，半波片212，偏振分束棱镜213，第一透镜214，第二双色镜215，第二透镜216，第三双色镜217，第一显微镜物镜218，微流道样品池219，第二显微镜物镜220，第四双色镜221，第二成像管镜222，第一滤波片223，成像相机224，第五双色镜225，第三成像管镜226，第二滤波片227，第一光电倍增管228，第六双色镜229，第一中继透镜230，第三滤波片231，位置敏感探测器232，第三反射镜233，第四成像管镜234，第四滤波片235，第二光电倍增管236。

其中，激光光镊光路起始于第三激光器211，半波片212和偏振分束棱镜213调节激光器的功率，第一透镜214和第二透镜216对光镊光束进行扩束，以与第一显微镜物镜218的后瞳大小进行匹配，第二显微镜物镜220搜集前向散射的光镊光束，经第四双色镜221反射，透过第五双色镜225，再由第六双色镜229反射，最终被位置敏感探测器232探测。位置敏感探测器232通过中继透镜230对第二显微镜物镜220后焦面成像。

光镊采用独立的明场成像系统，从照明光源209开始，经第二反射镜210以及第二双色镜215反射后于光镊捕获光合成后进入显微镜系统。成像光透过第四双色镜221，并经过第二成像管镜222和第一滤波片223后被成像相机224采集。

拉曼成像部分有两个在时间上同步的光源，分别为第一激光器201和第二激光器205。由于光脉冲序列在空间传播时会引起时间迟滞，需要在其中一路加上延迟单元以调节两个激光器所产生的脉冲序列相对延迟。同时，在做拉曼探测时需要有一路调制信号供锁相探测器做参考信号，兼顾系统紧凑性，这里将延迟和调制两个功能集成在一个单元202。

第一光电倍增管228探测受激拉曼散射信号，第二光电倍增管236采集相干反斯托克斯散射信号。两个光电倍增管的信号分别与调制和延迟模块202所提供的调制信号进行锁相放大。因此，本实施例可以分别实现受激拉曼成像和相干反斯托克斯成像，也可以同时实现两种模式的成像。

此实施例适用于没有荧光标记且具有多种化学组分的细胞。

作为实施例，优选地，激光器可以选光谱物理的光学参量振荡器（OPO，Inspire），其波长调节范围为345 nm到2500 nm，脉冲宽度80-350 fs。具体型号例如Inspire Auto50，所产生的信号光在490-750 nm，闲置光(idle)在930-2500 nm间可调谐。采用信号光作为相干反斯托克斯拉曼散射的泵浦光源，闲置光作为斯托克斯光。优选地，显微镜物镜106可以选择奥林巴斯公司的60x WIR数值孔径1.2，或者尼康IR 60x NA=1.27，或者奥林巴斯的25x NIR数值孔径1.05的显微镜物镜。

优选地，光电倍增管228和236，采用可见光双碱PMT（Thorlabs，PMM01，280nm-630nm）或者滨松公司H7827系列的光电倍增管，如H7827-001的光谱响应涵盖300-650nm，或者根据具体应用需求选择合适波段的光电倍增管。

光电倍增管信号采用与激光器同步的信号进行锁相放大（未画出）输出，以探测微弱的反斯托克斯信号。结合扫描单元204，实现对细胞等俘获在光镊中的颗粒进行多组分二维化学成像。

中继透镜230将第二物镜220的后焦面成像到位置敏感探测器232上。优选地，生物细胞的样品通过缓冲液送入微流道样品池219，缓冲液通过微流体泵获得特定的流速。

优选地，光镊可选在频域与拉曼成像相关波长无重叠的激光（见图6所示），如选择1.5μm或者532 nm波长的激光。对蛋白质、核酸等拉曼频移比较大的分子，也可以将光镊波长选在斯托克斯光和拉曼激发光的波长之间，或者拉曼激发光和反斯托克斯谱线之间。

探测部分，光电倍增管与位置敏感探测器工作在不同频率波段，减少串扰。优选地，位置敏感探测器232选用Thorlabs的四象限探测器PDQ80A具有响应400-1050nm或者First sensor的位置敏感探测器（DL100-7）。

作为公知的理论，受激拉曼散射的能级图如图3所示。当泵浦光将分子从基态抽运到高能级的虚态，分子再由虚态跃迁到振动能级会产生斯托克斯光子。采用与斯托克斯光子相同能量的探测光激发可以实现斯托克斯光的增强，即受激拉曼散射。

相干反斯托克斯拉曼散射的能级图如图4所示，探测光将分子从高能级振动态再次抽运到高能级的虚态，分子再次跃迁到基态后产生高能量的光子，即反斯托克斯光子。

实施例1中，可通过更换不同波段的滤光片，实现受激拉曼成像，或者通过更换滤波片实现相干拉曼散射成像。

实施列2中，通过光电倍增管228与236同时探测受激拉曼信号和相干反斯托克斯拉曼信号，即实现多模态成像。该组合进示意单个成像模式或者双模态成像模式，并不影响与光镊结合探测细胞化学成分的发明主体。

对拉曼显微镜采用图5所示的逐行扫描方式实现二维扫描成像。扫描图像大小NxM，所获得图像有N行，M列。当M=N时，图像扫描区域为正方形。一般可以根据需要设为2的整数次方，如256，512，1024等。这里按照逐行扫描实现，即逐点扫描第一行，再扫描第二行，依此类推。以扫描精度2μm/pixel估计，需要光镊中细胞位置涨落小于半个像素大小，即1μm。根据光镊中粒子位置的能量均分原理，可估计光阱刚度的下限

。为使得光镊能够稳定俘获细胞，需要将光阱刚度调节到大于此下限。一般可取

或者更高的强度。

本发明针对拉曼成像与光镊协同工作，实施例给出的受激拉曼散射成像或相干反斯托克斯成像用于对发明进行说明。本发明包含单个成像模式与光镊的耦合，也包含两种成像模式同时结合到光镊上。目的为检测细胞等液相中颗粒化学组分提供一个有效的实验手段。同时该装置也可以拓展到气相中颗粒，如气溶胶的化学成分监测。

Claims (10)

1.一种结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，包括激光光镊部分、拉曼显微镜部分以及两者的耦合；用于做受激拉曼成像，或者做相干反斯托克斯成像，或者同时做两种模式的成像；其中：

所述激光光镊部分，包括依次光路连接的光镊激光、显微镜物镜、微流道样品池、搜集物镜、成像管镜、位置敏感探测器以及必要的透镜和反射镜；由高数值孔径的显微镜物镜将激光束聚焦到衍射极限大小，具体为200-500 nm；在光斑附近的微米/纳米粒子因光强梯度力的作用被吸引到光镊中；

所述光镊采用近红外激光对细胞等生物粒子进行无接触、无损伤捕获，并对细胞进行无接触的固定，为细胞实现较长时间扫描成像提供稳定的位置固定；

所述拉曼显微镜部分，包括依次光路连接的两个脉冲激光、扫描转镜、扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜、搜集透镜、成像管镜、滤波片、光电倍增管以及锁相放大器；两个脉冲激光在时域上以及空间上同步；

所述拉曼显微镜通过泵浦光和斯托克斯光与样品的相互作用实现共振拉曼成像（SRS）或者相干反斯托克斯（CARS）成像；通过调节光电倍增管前的滤波片的透过率波段，实现共振拉曼成像和相干反斯托克斯成像的切换，或者设计双通道分别实现受激拉曼成像和相干反斯托克斯成像；

所述的激光光镊和拉曼成像的耦合，采用双色镜将光镊激光和拉曼激发光耦合到显微镜系统；再采用双色镜将光镊激光和拉曼信号光在空间上分开，拉曼信号包括受激拉曼散射或者相干反斯托克斯散射光。

2.根据权利要求1所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述的激光光镊，采用与拉曼显微镜激发光与发射光光谱不重叠的激光实现；光镊的中心波长是比斯托克斯谱线更长的波长，或者比反斯托克斯谱线更短的波长，或者是介于斯托克斯或反斯托克斯谱线与拉曼激发光之间的任何波长。

3.根据权利要求2所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，拉曼显微镜部分中的扫描转镜、扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜组成扫描单元；由扫描振镜对共轴的拉曼泵浦光源和探测光进行二维角度扫描，再经扫描透镜、成像透镜、显微镜物镜后，对空间上重合的两个光斑在样品上实现二维扫描；由于泵浦光和探测光在空间上重叠，因而在扫描过程中，能够在样品空间上重叠；同时在其中一条光路引出延迟调制单元，确保两个脉冲序列在样品上实现时间同步；时间和空间的同时同步为激发拉曼信号提供可能；

所述的拉曼成像通过扫描单元对两个空间上重合的激光束进行扫描，并经过激发样品后由光电倍增管搜集到受激拉曼散射或相干反斯托克斯信号后，再由计算机重构的二维图像。

4.根据权利要求3所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，光镊部分和拉曼显微镜分别设有各自的探测单元；

光镊部分的位置敏感探测器作为探测单元，并结合后焦面干涉法，对光镊中捕获的粒子的位置进行高精度的探测；由于直接探测捕获激光的信号，引入中性密度衰减片对激光功率进行适当调整；

拉曼显微镜部分的以光电倍增管作为探测单元，对拉曼信号进行探测；由于拉曼信号的强度比较弱，需要结合锁相放大器对信号进行放大；为实现锁相放大，需要对拉曼激发光的强度进行调制，这里的调制信号将做为锁相放大的参考输入；光电倍增管的信号只有频率与拉曼激发光调制频率一致的信号被放大输出。

5.根据权利要求4所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，拉曼成像通过光束扫描实现二维受激拉曼图像的采集，拉曼成像可针对细胞中特定成分，包括脂质体、水、蛋白质，进行无标记、多组分成像。

6.根据权利要求5所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，实验时，无标记的细胞通过微流道样品池流过激光光镊捕获区域；当待测细胞被光镊捕获时，位置敏感探测器上记录细胞的实时位置信号，减小微流道里流体速度，位置敏感探测器的信号涨落逐渐趋于稳定；光镊信号通过功率谱密度进行标定；再测量位置信号的均方差，确保位置信号均方差小于拉曼成像扫描步长的一半，以减少像模糊；再启用拉曼成像单元，对待测细胞进行扫描拉曼成像，扫描区域大小根据待测细胞大小进行调节，需要覆盖光镊捕获细胞的区域。

7.根据权利要求1-6之一所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，具体包括：第一激光器（101），延迟和调制单元（102），第一双色镜（103），第二激光器（104），第一反射镜（105），二维扫描转镜（106），扫描透镜（107），第一成像管镜（108），第三激光器（109），第二双色镜（110），显微镜物镜（111），微流道样品池（112），聚光镜（113），第二反射镜（114），第二成像管镜（115），第三双色镜（116），滤色片（117），光电倍增管（118），位置敏感探测器（119），锁相放大器（120）；其中：

拉曼激光器（101）和（104）经第一双色镜（103）在空间重叠，再由扫描振镜（106）对双光束进行角度扫描；经振镜二维角度扫描的这两个波长的激光经扫描透镜（107），成像管镜（108），和第一显微镜物镜（111）后，转化为两光束在样品平面的二维扫描；

泵浦光与斯托克斯光的脉冲需要同时到达样品同一位置，因而在其中一路加上延迟单元调节两个脉冲序列的时间延迟；同时，在其中一路使用一对反射镜调节两束光的相对位置；这里将强度调制和时间延迟单元（102）集成在一起，使系统的结构紧凑；

其中，对微米级介电粒子的操控采用单光镊实现，对粒子位置的监测采用后焦面探测实现；受激拉曼信号或相干反斯托克斯成像信号经光电倍增管（（118））探测后，通过锁相放大器120输出，其中光强调制单元（102）的调制信号为锁相放大的参考信号；

光镊光路自光源（109），经第二双色镜（110）耦合到主光路并经第一显微镜物镜（111）聚焦后形成激光光镊，前向透过样品池的捕获激光经第二显微镜物镜（113）搜集后，再经第二反射镜（114）反射以及第二成像管镜（115），第三双色镜（116），进入位置敏感探测器（119）；其中第二成像管镜（115）将第二显微镜物镜（113）的后焦面成像到位置敏感探测器（119）上。

8.根据权利要求7所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，拉曼散射成像根据需求，使用飞秒或皮秒激光器激发；飞秒激发使用光谱物理的超快激光器，该激光器能输出两个同步光束，其中固定波长1045 nm，可调谐波长范围为690-1300nm，120fs，80MHz重复频率，两个同步的双光束输出能做受激拉曼散射成像和相干反斯托克斯成像；光镊激光波长选为532 nm或者650 nm，以与拉曼显微成像的激发和发射波长从光谱上错开；

皮秒双色激光器采用绿光皮秒泵浦激光器与光学参量振荡器实现，其中绿光泵浦的波长为515 nm，光学参量振荡器的调节波长为640至960nm；为避免光镊激光波长与拉曼成像的激发和探测波长在光谱上重叠，光镊激光采用波长为1064 nm或者1500 nm的激光。

9.根据权利要求1-6之一所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，具体包括：第一激光器（201），延迟和调制单元（202），第一双色镜（203），二维扫描振镜（204），第二激光器（205），第一反射镜（206），扫描透镜（207），第一成像管镜（208），照明光源（209），第二反射镜（210），第三激光器（211），半波片（212），偏振分束棱镜（213），第一透镜（214），第二双色镜（215），第二透镜（216），第三双色镜（217），第一显微镜物镜（218），微流道样品池（219），第二显微镜物镜（220），第四双色镜（221），第二成像管镜（222），第一滤波片（223），成像相机（224），第五双色镜（225），第三成像管镜（226），第二滤波片（227），第一光电倍增管（228），第六双色镜（229），第一中继透镜（230），第三滤波片（231），位置敏感探测器（232），第三反射镜（233），第四成像管镜（234），第四滤波片（235），第二光电倍增管（236）；其中：

激光光镊光路起始于第三激光器（211），半波片（212）和偏振分束棱镜（213）调节激光器的功率，第一透镜（214）和第二透镜（216）对光镊光束进行扩束，以与第一显微镜物镜（218）的后瞳大小进行匹配，第二显微镜物镜（220）搜集前向散射的光镊光束，经第四双色镜（221）反射，透过第五双色镜（225），再由第六双色镜（229）反射，最终被位置敏感探测器（232）探测；位置敏感探测器（232）通过中继透镜（230）对第二显微镜物镜（220）后焦面成像；

光镊采用独立的明场成像系统，从照明光源（209）开始，经第二反射镜（210）以及第二双色镜（215）反射后于光镊捕获光合成后进入显微镜系统；成像光透过第四双色镜（221），并经过第二成像管镜（222）和第一滤波片（223）后被成像相机（224）采集；

拉曼成像部分有两个在时间上同步的光源，分别为第一激光器（201）和第二激光器（205）；由于光脉冲序列在空间传播时会引起时间迟滞，需要在其中一路加上延迟单元以调节两个激光器所产生的脉冲序列相对延迟；同时，在做拉曼探测时需要有一路调制信号供锁相探测器做参考信号，兼顾系统紧凑性，这里将延迟和调制两个功能集成在一个单元（202）；

第一光电倍增管（228）探测受激拉曼散射信号，第二光电倍增管（236）采集相干反斯托克斯散射信号；两个光电倍增管的信号分别与调制和延迟模块（202）所提供的调制信号进行锁相放大；

可以分别实现受激拉曼成像和相干反斯托克斯成像，或者同时实现两种模式的成像。

10. 根据权利要求9所述的结合光镊的受激拉曼显微成像装置，其特征在于，所述激光器选用光谱物理的光学参量振荡器，其波长调节范围为345 nm到2500 nm，脉冲宽度80-350fs；所产生的信号光在490-750 nm，闲置光在930-2500 nm间可调谐；采用信号光作为相干反斯托克斯拉曼散射的泵浦光源，闲置光作为斯托克斯光。

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