CN116438444A - 荧光编码的中红外光热显微镜 - Google Patents

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Abstract

对样品的显微分析包括置于样品内的荧光染料。中红外光源生成中红外光束，该中红外光束被引导到样品上，以通过中红外光束的吸收引起温度变化。光源生成探针束，探针束被引导以撞击样品。当探针束撞击样品时，检测器检测来自样品的荧光发射。数据采集和处理系统采集并处理来自样品的检测到的荧光发射，以：(i)生成指示通过样品进行的红外吸收的信号，(ii)基于指示通过样品进行的红外吸收的信号而生成指示样品中温度的信号，(iii)使用指示样品中的温度的信号而生成样品的图像。

Description

荧光编码的中红外光热显微镜
相关申请的交叉引用
本申请涉及并要求于2020年9月4日提交的美国临时申请号63/074,688的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及中红外(IR)光热(MIP)成像，并且特别涉及使用热敏荧光染料来感测由中红外吸收引起的样品中的温度升高的MIP成像的系统和方法。
背景技术
MIP成像是一种新兴技术，其中使用可见光束来感测由分子的红外吸收引起的光热透镜效应。该技术通常提供由可见探针束(probe beam)定义的亚微米空间分辨率。然而，对大多数材料来说，光热透镜效应是一种微弱的效应。例如，聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)的衍射系数每开尔文变化约0.1％。在对温度变化的敏感性如此低的情况下，无法获得具有高空间分辨率的测量结果。
发明内容
根据一个方面，提供了一种用于样品的显微分析的系统。荧光染料被置于样品内。中红外(IR)光源生成中红外光束，该中红外光束被引导到样品的至少一部分上，以通过吸收中红外光束引起样品的部分中的温度变化。光源生成探针束，该探针束被引导以撞击样品。当探针束撞击样品时，检测器检测来自样品的荧光发射。数据采集和处理系统采集并处理来自样品的检测到的荧光发射，以：(i)生成指示样品的部分的红外吸收的信号，(ii)基于指示样品的部分的红外吸收的信号来生成指示样品的部分的温度的信号，(iii)使用指示样品的部分中的温度的信号来生成样品的部分的图像。
在一些示例性实施例中，荧光染料包括罗丹明B、荧光素、cy2、cy3、尼罗红和绿色荧光蛋白中的至少一种。
在一些示例性实施例中，中红外光束是脉冲调制光束。中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率可以在1.0至1000kHz的范围内，并且标称可以是100kHz。中红外光束的脉冲的接通持续时间可以在1.0纳秒至1.0毫秒的范围内，并且在一些实施例中标称可以在50至1000纳秒之间。中红外光束的占空比可以在0.01％至50％的范围内，并且在一些实施例中可以在1％至10％之间。
在一些示例性实施例中，中红外光束在样品的多个部分上被扫描，从而生成用于样品的多个部分的图像。
在一些示例性实施例中，中红外光束被引导到样品的多个部分上，并且检测器包括二维检测器阵列，从而生成用于样品的多个部分的图像。在一些示例性实施例中，检测器包括摄像头。
在一些示例性实施例中，该系统还包括物镜，其被配置为将中红外光束聚焦到样品上。
根据另一方面，提供了一种用于样品的显微分析的方法。该方法包括在样品中引入荧光染料；将中红外光束引导到样品的至少一部分上，以通过中红外光束的吸收而引起样品的该部分中的温度变化；引导探针束撞击到样品上；当探针束撞击样品时，检测来自样品的荧光发射；以及接收和处理来自样品的荧光发射，该处理包括：(i)生成指示样品的部分的红外吸收的信号，(ii)基于指示样品的部分的红外吸收的信号而生成指示样品的部分中的温度的信号，(iii)使用指示样品的部分中的温度的信号来生成样品的部分的图像。
在一些示例性实施例中，荧光染料包含罗丹明B、荧光素、cy2、cy3、尼罗红和绿色荧光蛋白中的至少一种。
在一些示例性实施例中，中红外光束是脉冲调制光束。中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率可以在1.0至1000kHz的范围内，并且标称可以是100kHz。中红外光束的脉冲的接通持续时间可以在1.0纳秒至1.0毫秒的范围内，并且在一些实施例中标称可以在50至1000纳秒之间。中红外光束的占空比可以在0.01％至50％的范围内，并且在一些实施例中可以在1％至10％之间。
在一些示例性实施例中，中红外光束在样品的多个部分上被扫描，从而生成用于样品的多个部分的图像。
在一些示例性实施例中，中红外光束被引导到样品的多个部分上，并且检测器包括二维检测器阵列，从而生成用于样品的多个部分的图像。在一些示例性实施例中，检测器包括摄像头。
在一些示例性实施例中，该系统还包括物镜，其被配置为将中红外光束聚焦到样品上。
附图说明
通过本公开的实施例的非限制性示例，参考所述多个附图，在下面的详细描述中进一步描述了本公开，其中，在附图的多个视图中，相同的附图标记代表相似的部件。
图1A包括示出根据一些示例性实施例的荧光增强中红外光热显微镜的操作的示意图。
图1B是示出由加热引起的罗丹明B的分子结构变化的示意图。
图2A包括根据一些示例性实施例的点扫描FE-MIP显微镜的示意图。图2B是被分析样品处的效果的示意图。图2C包括示出根据一些示例性实施例的FE-MIP显微镜中用于控制和分析的组件的示意性功能框图。
图3A包括根据一些示例性实施例的宽场(wide-field)FE-MIP显微镜的示意图。图3B包括示出根据一些示例性实施例的用于图3A的FE-MIP显微镜中的用于控制和分析的组件的示意性功能框图。
图4A示出了DMSO的FE-MIP和FTIR光谱。图4B示出了水的FE-MIP和FTIR光谱。图4C和图4D示出了200nm聚苯乙烯珠的荧光和FE-MIP图像。
图5A是根据一些示例性实施例的获得的金黄色葡萄球菌的荧光图像。图5B-5D是金黄色葡萄球菌在1650cm-1、1080cm-1和1750cm-1IR泵浦激光器波数下的FE-MIP图像，分别对应于DNA、蛋白质和脂质。图5E是示出金黄色葡萄球菌的FE-MIP光谱和散射MIP光谱的曲线。
图6A是根据一些示例性实施例的获得的金黄色葡萄球菌的荧光图像。图6B-6D是金黄色葡萄球菌在1650cm-1、1080cm-1和1750cm-1IR泵浦激光器波数下的FE-MIP图像，分别对应于蛋白质酰胺I带、核酸磷酸带和偏共振。
图7A包括根据一些示例性实施例的点扫描FE-MIP显微镜的示意图。图7B示出了补充有各种热敏荧光染料的DMSO的F-MIP光谱。
图8A至图8G示出了对单个金黄色葡萄球菌的F-MIP成像和指纹识别。
图9A至图9I示出了活的MiaPaca2癌细胞的Sc-MIP和F-MIP图像。
图10A示出了IR泵浦脉冲、荧光激发脉冲和摄像头曝光的时间同步。图10B和图10C示出了在IR打开和IR关闭(分别指定为热和冷)的情况下Cy2染色的金黄色葡萄球菌的宽场荧光图像。图10D示出了1650cm-1处的宽场F-MIP，以及图10E示出了1400cm-1处的F-MIP偏共振。
图11A-11N示出了宽场SC-MIP和宽场F-MIP系统之间的性能比较。
图12A-12F示出了归一化的F-MIP图像，其展示了由染料标记的区域中的蛋白质产生的信号的更均匀分布。
具体实施方式
根据本公开，高灵敏度探针被用于提高MIP显微镜的检测灵敏度。根据本公开的技术，提供了一种具有高灵敏度的荧光增强中红外光热(FE_MIP)显微镜。通常，MIP显微术使用泵浦-探针方法，其中中红外光振动地激发样品，并且可见光探测产生的热效应。根据本公开，不是如传统MIP显微术中通常所做的那样测量由中红外吸收所调制的散射，而是在样品中部署热敏荧光染料作为探针，并测量调制的荧光强度。根据示例性实施例，可以在共焦模式和宽场模式下测量调制的荧光强度。结果是通过荧光标记获得高成像灵敏度和成分特异性。
化学成像在研究生物系统中发挥着越来越重要的作用。它将分子光谱与高分辨率空间信息相结合，以创建分子分布的定量图像。许多传统的化学成像工具包括受激拉曼散射显微术、傅里叶变换红外(FTIR)光谱、原子力显微镜红外(AFM-IR)光谱和瞬态吸收显微术。在这些方法中，基于红外的成像方法特别有吸引力，因为与拉曼散射相比，它们可以无创地提取分子特定信息，并且具有更大的截面。然而，传统FTIR的化学成像受到微米级上固有的低空间分辨率的阻碍。AFM-IR提供纳米级分辨率，但仅适用于环境条件下极其平坦的样本。根据本公开，提供了一种用于化学成像的无接触、易于操作且高度敏感的方法。
最近开发的中红外光热(MIP)显微术大大改进。根据本公开的技术，通过荧光增强中红外光热(FE-MIP，本文也被称为“F-MIP”)显微镜克服了传统MIP显微术的局限性。在本公开的该系统和方法中，用热敏染料标记样品，并且在脉冲红外激发时荧光强度的调制由PMT探测。
图1A包括示出根据一些示例性实施例的荧光增强中红外光热显微镜100的操作的示意图。参考图1A，被分析的样品102包括荧光染料，在一些特定示例性实施例中，荧光染料可以是罗丹明B。脉冲调制的中红外“泵浦”光束104撞击在样品102上。红外脉冲导致样品102的材料中的温度增加，并且在样品102的被红外脉冲照射的区域附近的荧光相应增加。也就是说，由于红外吸收引起的温度增加改变了罗丹明B荧光染料的分子结构，并且因此改变了当样品102被可见光的连续波(CW)照明光束108照射时所诱发的荧光强度。因此，由CW照明光束108诱发的荧光发射106由脉冲红外光束104调制。检测和测量荧光的这种调制，使得样品102中调制的温度变化可以被分析并与样品相关联，诸如产生具有极高分辨率和灵敏度的样品图像。因此，本公开的FE-MIP不仅利用了MIP的高空间分辨率，而且利用了一些荧光染料对温度的高敏感性。荧光标记进一步使本公开的技术能够探测细胞内特定细胞器的振动光谱。
在一些示例性实施例中，中红外光束是脉冲调制光束。中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率可以在1.0至1000kHz的范围内，并且标称可以是100kHz。中红外光束的脉冲的持续时间可以在1.0纳秒至1.0毫秒的范围内，并且在一些实施例中标称可以在50至1000纳秒之间。中红外光束的占空比可以在0.01％至50％的范围内，并且在一些实施例中可以在1％至10％之间。
当考虑荧光作为由中红外吸收引起的温度升高的报告者时，根据本公开，荧光分子温度计应同时满足某些特性，即高热敏性、高荧光强度和对激发的鲁棒性。此类染料包括例如罗丹明、荧光素、cy2、cy3、尼罗红和绿色荧光蛋白。在一些示例性实施例中，如上所述，选择罗丹明6G和罗丹明B作为荧光分子温度计，因为它们表现出这些优选的特性。罗丹明染料是氧杂蒽衍生物，其呈现非常适合广泛的应用的光物理性质。罗丹明及其衍生物长期以来以其荧光对温度的敏感性而闻名。罗丹明B的荧光量子产率随着温度的升高而下降，这是二乙基氨基(diethylamino group)在氧杂蒽环上旋转的结果，如图1B所示，该图是示出由加热引起的罗丹明B的分子结构变化的示意图。具体地，图1B示出了罗丹明B的氧杂蒽环上二乙基氨基随温度变化的旋转。在加热过程中，罗丹明B将从两性离子形式的若丹明B(RhBZ)变为内酯形式的RhB L，反之亦然。
根据本公开的技术，使用荧光染料作为探针，通过中红外泵浦测量光热效应，可以显著提高MIP成像的灵敏度。MIP信号对比度通常归因于温度引起的局部折射率变化。传统系统中的热诱导折射率变化导致有效样品/介质光散射截面的瞬时变化。米氏散射理论被用于描述散射光与折射率之间的关系。大多数材料的折射率都有温度依赖性。以PMMA为例，在0至80℃的温度下，折射率每开尔文变化约为0.02％。在MIP成像中，由中红外光引起的温度增加约为1至5开尔文。因此，散射强度估计为每开尔文变化约0.1％。作为比较，罗丹明荧光强度对温度的响应要大得多。以罗丹明B为例，荧光强度每开尔文下降约2％，这比折射率变化引起的散射调制深度大两个数量级。
本公开的FE-MIP显微镜100为化学成像提供了另一个益处，即，记录复杂环境中特定成分的振动光谱的能力。例如，哺乳动物细胞包含许多空间组织的细胞器。复杂细胞系统中特定细胞器的化学成像过程具有挑战性。到目前为止，通过相干拉曼散射显微术，仅对密集堆积有C-H键的脂滴进行了大量研究。相比之下，荧光探针具有特异性标记细胞中的每一种成分的能力。例如，罗丹明鬼笔环肽可以附着在细胞骨架上。因此，FE-MIP显微镜100可以获得呈现细胞骨架化学信息的IR光谱。总之，FE-MIP显微镜100的这些益处提供了纳米颗粒的高灵敏度和选择性化学成像、细菌的指纹识别和哺乳动物细胞中的细胞骨架的振动成像。
图2A包括根据一些示例性实施例的点扫描FE-MIP显微镜100A的示意图。图2B是正在被分析的样品102处的效果示意图。参考图2A和图2B，显微镜100A被用于分析样品102，样品102包括荧光染料，在一些特定的示例性实施例中，荧光染料可以是罗丹明B。量子级联激光器(QCL)110向反射光学器件112提供脉冲中红外泵浦光束，反射光学器件112通过氟化钙(CaF2)光学器件114将中红外泵浦光束反射到反射物镜118，反射物镜118将IR泵浦光束107聚焦到样品102上的受控位置。IR光束可以具有在100至4000cm-1范围内的波数。中红外泵浦光束的一部分被CaF2光学器件114反射到测量光束的碲化镉汞(MCT)检测器116。标称波长为532nm的CW探针束由源120生成并输出，并穿过分色镜124，并由水浸物镜126聚焦在样品102上，从而在样品102处产生荧光105。分色镜124将从样品102返回的CW光束反射到光电倍增管(PMT)130，光电倍增管130收集并检测和测量光，包括来自样品102的调制荧光的效应，如109处所示。
图2C包括示出根据一些示例性实施例的用于FE-MIP显微镜中的控制和分析的组件的示意性功能框图。参考图2C，包括来自样品102的调制荧光的效应的光热信号由PMT130收集。来自PMT 130的信号由谐振放大器134放大并由锁定放大器136检测。包括IR激光器(QCL)110、锁定放大器136、谐振放大器134、PMT 130、MCT 116和定位台138在内的所有系统组件与处理器/计算机132对接，处理器/计算机132被用于控制样品台138的定位和IR泵浦调制和照明的同步，以及数据采集和分析。
图2A示出了FE-MIP显微镜100A的点扫描配置。继续参考图2A至图2C，由以100kHz重复率操作的可调谐(从1000到1886cm-1)量子级联激光器(QCL)110(其可以是例如由Daylight Solutions制造和/或销售的MIRcat2400 QCL)生成的脉冲中-IR泵浦光束穿过氟化钙(CaF2)盖玻片光学器件114，并且然后通过金涂层反射物镜118(例如，52×；NA，0.65；Edmund Optics，#66589)聚焦到样品102上。连续波探针激光器120(例如，Cobolt，Samba532nm)光束通过高NA折射物镜126(例如，60×；NA，1.2；水浸；Olympus，UPlanSApo)从相对侧聚焦到样品102的同一点上。探针束被对准成与中-IR泵浦光束共线，以确保两个焦点的重叠，从而达到良好的信号电平。最大扫描速度为200μs/像素的扫描压电工作台(例如，MadCity Labs，Nano-Bio 2200)被用于扫描样品102。然后由探针激光器120激发的荧光被高NA折射物镜126收集，并被分色镜124(例如，DMSP550R，550nm截止，THorlabs)反射。然后荧光通过长通滤波器128(例如，FEL0550，550nm截止，THorlabs)进行滤波，并被PMT 130(例如，Hamamatsu H10721-110)收集。在根据本公开的成像程序中，CaF2盖玻片上的样品102首先被荧光信号定位。然后，打开脉冲红外泵。调制的散射由PMT 130收集，并且MIP信号由锁定放大器136提取，锁定放大器136检测/解调该信号以恢复IR调制信号。在反射物镜118之前，红外激光束穿过光学器件114中的CaF2滑片，并且红外激光的反射由MCT检测器116测量，用于每个波长的IR功率的归一化。
图3A包括根据一些示例性实施例的宽场FE-MIP显微镜100B的示意图。图3B包括示出根据一些示例性实施例的图3A的FE-MIP显微镜100B中用于控制和分析的组件的示意性功能框图。参考图3A和图3B，激光器150(例如1040nm全光谱激光器150)被用作CW激发光源。在一些特定示例性实施例中，激光器150是520nm的双频。该光束被声光调制器(AOM)162斩波以产生探针束脉冲。激发光束152聚焦在物镜154的后孔径上以实现落射式照明(epiillumination)。摄像头164被设置成收集由长通滤波器166(其可以是520nm长通滤波器)滤波的荧光信号。中红外脉冲信号由QCL 160生成以加热样品102，并与摄像头164的帧速率同步。由摄像头164生成的热帧和冷帧被记录，热帧是在存在IR泵浦效应时被生成的，而冷帧是它们不存在时被生成的。热帧和冷帧之间的差异被用于创建光热图像。
继续参考图3A和图3B，在一些示例性实施例中，函数发生器170可被用于触发和同步系统组件，包括由激光器150生成和调制脉冲IR信号、由激光器150生成的CW照明信号以及由摄像头164进行的检测和数据采集。处理器或计算机172提取FE-MIP信号并进一步处理来自摄像头164的图像。
在图3A和图3B所示的特定示例性实施例中，与图2A-2C的实施例中使用的相同的中-IR激光源160被用于IR-泵浦样品102。由以100kHz重复率操作的可调谐(例如，从1000到1886cm-1)量子级联激光器(QCL)160(例如，QCL，Daylight Solutions，MIRcat-2400)生成的脉冲中-IR泵浦光束由抛物面镜聚焦以照亮样品102。作为探针的520nm飞秒脉冲激光器150被落射在样品102上。聚焦在物镜154的后孔径上的激光器150因此在样品102上形成均匀的照明。荧光束然后由550nm长通滤波器166进行滤波并由摄像头164(例如，FLIRGrasshopper3 GS3-U3-32S4M)收集。在一些示例性实施例中，摄像头164以100Hz的标称帧速率操作。总帧的一半被调谐掉，并且通过从IR-off帧中减去IR-on帧，获得荧光编码的MIP图像。
根据一些示例性实施方案，为了制备用于FE-MIP成像的细菌样品，金黄色葡萄球菌ATCC 6538可被用作模型菌株。首先用10％福尔马林溶液(Thermo Fisher Scientific)固定活的金黄色葡萄球菌细胞，并且然后离心并用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤。可以加入Triton-X溶液(Sigma)来渗透细胞膜，以促进荧光染色。荧光标记可以通过将细菌细胞与10-4M罗丹明6G(Sigma)溶液在黑暗中室温下孵育1小时来执行。在最后的结合和洗涤步骤之后，细菌细胞可以被沉积并干燥在CaF2盖玻片上用于成像。
根据本公开，描述了用于测量标准样品的中红外光谱的本公开的FE-MIP系统的光谱保真度。如上所述，选择二甲基亚砜(DMSO)中的罗丹明6G和水溶液作为标准样品。使用图2A-2C的点扫描实施例，并且用0.02mW激发功率和1000至1750cm-1的中IR调谐来测量FE-MIP光谱。光谱扫描速度为50cm-1/s。通过将MIP光谱与傅里叶变换红外(FTIR)光谱进行比较来确认光谱保真度，如图4A所示。在图4A中，示出了DMSO的FE-MIP光谱。FE-MIP光谱显示10μMol/L R6G DMSO溶液，光谱扫描速度为50cm-1。图4B中示出了水的FE-MIP光谱。单个200nm RhB PS珠的FE-MIP光谱，光谱扫描速度为50cm-1。图4C和图4D示出了200nm珠的荧光和FE-MIP图像。像素停留时间：1ms。步长：100nm；比例尺：1μm。
通过映射用罗丹明B染料标记的200nm聚苯乙烯(PS)珠来确认FE-MIP的灵敏度。这些珠分散在氟化钙盖玻片上。图4C和图4D示出了在IR激光器被调谐到1450cm-1的情况下PS珠的荧光和FE-MIP图像。为了验证光谱保真度，分析单个珠，并在指纹区域中记录FE-MIP光谱。光谱与FTIR光谱一致。基于散射的MIP和FE-MIP是一致的。然而，在IR激光器的16mW的相同功率下，探针中的30mW被用于基于散射的MIP。相比之下，只有探针的0.02mW被用于记录FE-MIP图像。
当对生物样品，特别是活细胞成像时，必须考虑光毒性。与散射方法相比，本公开的FE-MIP在照片预算方面非常节省。对于FE-MIP方法，探针束的功率密度约为1KW/cm^2。而散射MIP使用100kW/cm2的探针功率密度，其比FE-MIP高2-3个数量级。
本公开的FE-MIP显微术适用于细菌的化学成像。根据一些示例性实施例，使用根据以上结合图2A-2C详细描述的实施例的点扫描方法对金黄色葡萄球菌进行成像。获得的图像在图5A至图5D中示出。图5A是根据一些示例性实施例，针对金黄色葡萄球菌获得的荧光图像。图5B-5D是金黄色葡萄球菌在1650cm-1、1080cm-1和1750cm-1IR泵浦激光器波数下的FE-MIP图像，分别对应于DNA、蛋白质和脂质。图5E是示出金黄色葡萄球菌的FE-MIP光谱和散射MIP光谱的曲线。由于本公开的FE-MIP的灵敏度特性，使用小得多的探针强度来成像细菌的光谱，这可以最小化光毒性。
如图6A至图6D所示，根据本公开，还验证了用于细菌成像的宽场FE-MIP的性能。根据一些示例性实施例，还使用根据上文结合图3A-3B详细描述的实施例的宽场方法对金黄色葡萄球菌进行成像。获得的图像在图6A至图6D中被示出。图6A是根据一些示例性实施例获得的金黄色葡萄球菌细菌的荧光图像。图6B-6D是金黄色葡萄球菌在1650cm-1、1080cm-1和1750cm-1IR泵浦激光器波数下的FE-MIP图像，分别对应于蛋白质酰胺I带、核酸磷酸带和偏共振。
根据本公开，荧光成像是应用于FE-MIP以提供重要改进的复杂技术。例如，照明显微镜可以有效地将分辨率提高两倍，并且可以直接应用于宽场系统，并实现超分辨率化学成像。其他超分辨率显微镜方法，包括例如受激发射耗尽(STED)显微镜方法也可以应用于本文所述的技术。
如本文所述，本公开的FE-MIP显微术可以应用于获取被埋在细胞内部的细胞骨架的指纹光谱。通过荧光标记，可以定位细胞骨架，并测量其光谱。值得注意的是，该技术不仅适用于细胞骨架。例如，罗丹明123具有标记线粒体的能力。已知用于标记细胞的绿色荧光蛋白也是热敏的。因此，可以根据本公开应用绿色荧光来对化学信息进行成像。
根据本公开的中红外光热显微术是一种化学成像技术，其中可见光束感测由脉冲红外激光诱发的光热效应。该技术提供亚微米空间分辨率的红外光谱信息，并且能够实现活细胞和生物体的红外光谱和成像。然而，目前的中红外光热成像灵敏度受到散射对温度的弱依赖性的影响，并且图像质量容易受到散射引起的斑点的影响。本公开涉及一种新型的中红外光热显微术，其中使用热敏荧光探针来感测中红外光热效应。根据示例性实施例，荧光强度可以以每开尔文1％的水平被调制，这比散射强度的调制大100倍。此外，荧光发射不受干扰，从而大大提高了图像质量。此外，荧光团可以靶向特定的细胞器或生物分子，从而增强光热成像的特异性。光谱保真度通过对单一细菌进行指纹识别来确认。最后，荧光团分子被可见光破坏的光漂白问题通过开发宽场荧光检测中红外光热显微镜得以成功解决，该显微镜允许对生物样本进行视频速率键选择成像(video rate bond-selectiveimaging)。
使分子组成可视化并监测复杂生命系统中的分子动力学是生命科学的中心主题。荧光显微术在生物医学研究中被广泛采用，因为它提供了高速无背景成像，具有精细的分子特异性和达到纳米级的优异分辨率。虽然荧光显微术擅于对标记的细胞器(诸如线粒体)和生物分子(诸如葡萄糖和胆固醇)的分布和动态进行映射，但它不能提供标记的细胞或细胞器的化学信息。缺乏这种信息阻碍了功能分析，诸如对细胞代谢活动的评估。
提供化学特异性、高速和高灵敏度振动光谱成像是一个新兴平台。最近开发的基于相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)或受激拉曼散射(SRS)的相干拉曼散射显微术已经允许对活细胞和组织中的生物分子进行实时振动成像。先进的仪器已将受激拉曼光谱的采集速度推至微秒级。采用稳定同位素探针和基于炔烃的拉曼标计大大提高了SRS显微术的检测灵敏度、特异性和功能性。由于对C-H振动高度敏感，CARS和SRS成像揭示了多种生物系统中脂质代谢的新特征。相比之下，指纹拉曼谱带的高速CARS或SRS成像仍然困难。
中红外光谱是拉曼光谱的补充。与拉曼散射不同，指纹区域的红外吸收截面大于高波数C-H振动区域。傅里叶变换红外(FTIR)光谱是用于生物细胞和组织的化学表征和分析的最广泛使用的技术之一。生物大分子(包括蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸)对中红外光子的固有振动吸收显示出独特的吸收谱带。吸收谱带的相对高度、峰位和峰形的变化提供了丰富的生物分子信息，包括浓度、构象(conformation)和方向。FTIR光谱在组织分类药物和组织相互作用、神经退行性疾病、癌症进展等方面提供了新的见解。然而，红外光谱成像的空间分辨率受到长的中红外照明波长(范围为5至20μm)的限制。强吸水性进一步阻碍了其在活细胞中的应用。
为了克服红外光谱的这些限制，开发了一种称为中红外光热(MIP)显微术的新平台，以达到亚微米空间分辨率。MIP效应依赖于光热过程，其中红外吸收对应于特定的分子振动键，导致目标分子附近的局部温度升高。这种光热效应因此导致折射率的变化和热膨胀。然后通过使用可见光束探测这些变化来获得MIP信号，该可见光束提供比中红外照明小得多的衍射极限，使得空间分辨率低至300nm。在首次演示活细胞的MIP成像之后，已经进行了技术创新，以使用散射或相位信号在宽场中实现MIP检测。同时，MIP显微术及其商业产品在研究活细胞、药物、病毒和细菌方面已经发现了各种应用。然而，由于颗粒尺寸和折射率的弱的热依赖性，光热效应仅引起散射探测光的强度和角度分布的微小变化。典型的分数变化在10-4/K的数量级上，由大多数材料的固有热性质设定。这种小的调制深度限制了信噪比(SNR)，尤其是在宽场模式下，其中每个像素处的探针束强度受到CMOS摄像头的井深的限制。
根据本公开，提供了一种荧光检测MIP(F-MIP，本文也被称为“FE-MIP”)显微镜，例如图2A的显微镜100A和图3A的显微镜100B，其利用热敏荧光染料作为光热效应的探针。F-MIP原理在图7A中被示出。参考图1A和图7A，用热敏染料染色的样品102在目标分子进行IR吸收后被加热。红外脉冲串104加热荧光探针的周围并引起温度升高，这随后对荧光发射效率进行调制。然后通过锁定放大器(诸如例如，图2C所示的锁定放大器136)测量这种调制。使用荧光染料测量温度是已知的。然而，它还没有被用作红外光谱成像的探针。本技术提供了优于基于散射的MIP显微术的重要优点。一个优点是与散射相比，利用了荧光染料的大得多的光热响应。包括FITC、Cy2、Cy3、罗丹明和绿色荧光蛋白在内的常见荧光团具有约1％/K的温度依赖性发射效率，这比散射对温度的依赖性大近100倍。因此，原则上可以将中红外光热成像速度提高两个数量级。第二个优点是，由于荧光出现在入射光束的新波长处，它对激光相对强度噪声不敏感。第三个优点是，与散射不同，荧光是不相干的，并且因此不会生成干涉图案。第四个优点是，荧光探针可以靶向特定细胞、细胞内的细胞器或特定分子，从而提供了基于散射的MIP显微术无法达到的增强的特异性。在本公开中，提供了两个F-MIP系统，一个处于点扫描模式，如图2A中的系统100A所示，另一个处于宽场模式，如图3A中的系统100B所示，如本文详细描述的。
实验部分
对于使用扫描F-MIP显微镜100A的实验：脉冲中-IR泵浦光束由可调谐(从1000到1886cm-1)量子级联激光器(QCL，Daylight Solutions，MIRcat-2400)生成，其以100kHz重复率和900ns脉冲持续时间进行操作。IR光束穿过氟化钙(CaF2)盖玻片，并且然后通过金涂层反射物镜(52×；数值孔径(NA)，0.65；Edmund Optics，#66589)聚焦到样品上。532nm的连续波探针激光(Cobolt，Samba)通过折射物镜(60×；NA，1.2；水浸；Olympus，UPlanSApo)从相对侧聚焦到同一点上。探针束被对准成与中IR泵浦光束共线。反射物镜在3D中进行微调，以确保两个焦点的重叠。使用最大扫描速度为200μs/像素的扫描压电工作台(Mad CityLabs，Nano-Bio 2200)来扫描样品。荧光由相同的折射物镜收集，由分色镜(Thorlabs，DMSP550R，550nm截止)反射，由长通滤波器(Thorlbs，FEL0550，550nm截止)滤波，并且然后由PMT(Hamamatsu，H10721-110)收集。CaF2盖玻片上的样本首先通过荧光成像。然后，打开脉冲IR激光器，并由同一PMT收集调制的荧光信号。F-MIP信号由锁定放大器(苏黎世仪器，HF2LI)提取。实验室构建的谐振电路被用于放大来自PMT的光电流，然后将其发送至锁定装置。在反射物镜之前，红外激光穿过CaF2滑片，并且反射的红外激光强度由碲化镉汞(MCT)检测器测量，用于每个波长的IR功率的归一化。
对于使用宽场F-MIP显微镜100B的实验：IR脉冲由扫描F-MIP中使用的相同QCL生成。荧光激发的可见探针光束(波长为488nm或520nm)通过调谐至976nm或1040nm的准连续飞秒激光器(相干公司，Chameleon，140fs，80MHz)的二次谐波生成获得。在二次谐波生成之前，飞秒光束被声光调制器(AOM、Gooch和Housego)斩波成200kHz脉冲串(300ns脉冲宽度)。IR光束穿过衬底，并通过抛物面镜(f＝15mm，Thorlabs，MPD00M9-M01)弱聚焦到样品上。使用科勒照明配置，通过聚光器(f＝75mm，AC254-075-A，Thorlabs)将探针束聚焦在物镜(50×，0.8NA，尼康)的后焦平面上。荧光发射由同一物镜收集，并且在长通滤波器之后，由CMOS摄像头(FLIR，Grasshopper3GS3-U3-51S5M)收集。通过虚拟锁定摄像头方法采集F-MIP图像。简言之，脉冲发生器(Emerald脉冲发生器，9254-TZ50-US，Quantum Composers)以200kHz生成主时钟信号，并从外部触发QCL、AOM和CMOS摄像头，以同步IR泵浦脉冲、探针脉冲和摄像头曝光。示意图在图3A中被示出。
癌症细胞培养和染色：Mia Paca2细胞购自美国模式培养物保藏中心(ATCC)。细胞在补充有10％ FBS和1％ P/S的RPMI 1640培养基中培养。所有细胞均在37℃的有5％ CO2供应的加湿培养箱中维持。对于尼罗红染色，将细胞与10μM尼罗红(Invitrogen)在室温下孵育30分钟，随后在10％中性缓冲福尔马林中固定15分钟。对于罗丹明123(Invitrogen)染色，细胞在37℃下与10μg/ml罗丹明123孵育30分钟。
细菌培养和染色：将金黄色葡萄球菌(S.aureus)在MHB培养基中孵育10小时。在离心并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤之后，用福尔马林溶液固定细菌0.5小时。然后将10-4M的罗丹明6G或Cy2添加到细菌沉淀物中。然后将该沉淀物再悬浮并孵育1小时。在最后的洗涤步骤中，将2μL样品在CaF2盖玻片上干燥以进行成像。表达GFP的福氏志贺氏菌在37℃的胰蛋白酶大豆琼脂平皿上生长过夜。带有绿色荧光的菌落由无菌接种环采集，并且然后再悬浮于PBS中。将细菌溶液通过600nm处的光密度(OD600)稀释至0.1。然后在室温下用10％福尔马林固定细菌30分钟。在成像前用PBS洗涤细菌溶液两次。
图7A示出了使用点扫描显微镜100A和光谱保真度的荧光检测的中红外光热(F-MIP)感测方法。参考图7A，示出了周围分子的脉冲红外泵浦对荧光团发射强度的调制。如上详细所述，图2A示出了点扫描F-MIP显微镜100A的示意图。来自量子级联激光器(QCL)的脉冲中-IR泵浦光束和连续可见荧光激发光束分别用反射物镜和水浸物镜被聚焦在样品上。荧光发射由分色镜(DM)反射、滤波并导向光电倍增管(PMT)。放置分束器以将散射的可见光束反射到光电二极管，用于基于散射的MIP(Sc-MIP)成像。图2C示出了电子连接。光热信号由连接到谐振放大器(RA)的PMT检测，以及由锁定放大器检测。PC被用于控制扫描阶段和数据采集。图7B示出了补充有各种热敏荧光染料的DMSO的F-MIP光谱。对于每种染料，在每个波数处显示三次独立测量的标准偏差。出于比较，显示了DMSO(黑色)的FTIR光谱。
结果和讨论
点扫描F-MIP显微镜100A和光谱保真度
基于图7A所示的原理，我们构建了如图2B所示的扫描F-MIP显微镜。QCL激光器提供在整个指纹区域可调谐的IR脉冲。重复率和脉冲宽度分别被设定为100kHz和900纳秒。532nm和488nm的两个CW激光器被用于荧光激发。荧光由光电倍增管检测，并且F-MIP信号由锁定放大器提取。在同一装置上，还安装了光电二极管，以用于使用532nm激光作为探针束的基于散射的MIP(Sc-MIP)成像。电子连接在图2C中被示出。
使用该系统，我们已经验证了F-MIP显微镜100A的光谱保真度。我们将各种热敏染料溶解在DMSO中，浓度为100μM。然后，我们在扫描QCL激光时记录F-MIP信号。在每个波数处，F-MIP强度通过由MCT测量的IR强度进行归一化。在所有情况下(图7B)，F-MIP光谱显示出与DMSO的FITR光谱相同的峰值强度和宽度。重要的是，由于染料浓度(100μM)远低于DMSO浓度(14M)，所以染料不会干扰F-MIP光谱。这些数据表明F-MIP显微镜能够产生可靠的光谱信息。
图8A至图8G示出了对单个金黄色葡萄球菌的F-MIP成像和指纹识别。图8A示出了用R6G染色的金黄色葡萄球菌的荧光图像。比例尺：1μm。像素停留时间：1ms。荧光激发：在532nm处为0.025mW。图8B示出了相同金黄色葡萄球菌在1650cm-1处的F-MIP图像。图8C示出了用Cy2染色的金黄色葡萄球菌的荧光图像。荧光激发：在488nm处为0.025mW。图8D示出了相同金黄色葡萄球菌在1650cm-1处的F-MIP图像。图8E示出了金黄色葡萄球菌的散射图像。像素停留时间：1ms。可见探针功率：1.5mW。图8F示出了相同金黄色葡萄球菌在1650cm-1处的Sc-MIP图像。图8G示出了分别通过F-MIP和Sc-MIP测量的金黄色葡萄球菌的指纹图谱。对于F-MIP和Sc-MIP，样品处的IR激光功率1650cm-1为10.2mW。从干燥的金黄色葡萄球菌膜记录的FTIR光谱采用自Li,X.；Zhang,D.；Bai,Y.；Wang,W.；Liang,J.；Cheng,J.-X.，“用拉曼集成中红外光热显微镜对活细胞进行指纹识别(Fingerprinting a living cell byRaman integrated mid-infrared photothermal microscopy)”，Analytical Chemistry2019,91(16),10750-10756。
单一细菌的F-MIP成像和指纹识别
我们应用F-MIP显微镜100A对单个金黄色葡萄球菌进行成像，以评估其在生物样本上的化学成像能力(图8A-8D)。将金黄色葡萄球菌培养物稀释至约5×105/mL的浓度，并且然后在CaF2基质上干燥。金黄色葡萄球菌颗粒分别用荧光染料Cy2和R6G染色。对于每个样本，我们采集了1650cm-1处相同细菌的荧光和F-MIP图像，目标是酰胺I带。对于F-MIP图像，在样品处0.025mW的荧光激发功率下，R6G和Cy2标记的细菌的SNR达到26和34。为了进行比较，我们记录了同一样本的散射和MIP图像(图8E-8F)。为了获得类似为37的SNR，在样本处需要1.5mW的激发功率，这是用于F-MIP的探针功率的60倍。对于单一细菌，我们记录了振动指纹图谱(图8G)。基于R6G和Cy2的F-MIP光谱与FTIR光谱匹配良好，显示了蛋白酰胺I、蛋白酰胺II和核酸磷酸振动分别在1650、1550和1080cm-1处的不同峰值。该比较表明了F-MIP在单一细菌分析中的光谱保真度。值得注意的是，散射和Sc-MIP图像均显示出环形结构，与细胞外围形成明亮对比度(图8E-8F)，而F-MIP图像(图8B、图8D)显示出与整个细胞的明亮对比度。这一结果表明，F-MIP对来自相当大颗粒的边缘增强背散射是免疫的。
图9A至图9I示出了活的MiaPaca2癌细胞的Sc-MIP和F-MIP图像。图9A示出了MiaPaca2细胞的散射图像。图9B示出了相同细胞在1650cm-1处的Sc-MIP图像。图9C示出了在1750cm-1处的Sc MIP图像。图9D示出了用尼罗红染色的相同MiaPaca2细胞的荧光图像。探针激光在532nm处。图9E示出了在1650cm-1处的F-MIP图像。图9F示出了在1750cm-1处的F-MIP图像。图9G示出了用罗丹明123(Rho123)染色的不同MiaPaca2细胞的荧光图像。探针激光在488nm处。图9H示出了在1650cm-1处的F-MIP图像。图9I示出了在1750cm-1处的F-MIP图像。比例尺：5μm。
癌细胞的Sc-MIP和F-MIP成像
与细菌相比，真核细胞包含细胞核和细胞质中高度组织化的细胞器。在图9A所示的透射图像中，基于散射的对比度显示了整个细胞形态。因此，对应于酰胺I带的1650cm-1处的Sc-MIP图像(图9B)显示了细胞核内部的蛋白质含量和细胞质中富含蛋白质的结构，而对某一细胞器没有特异性。当IR激光器被调谐到1750cm-1时，对比度降低(图9C)，显示了化学特异性。相反，荧光显微术能够经由多功能荧光探针而使特定的生物分子和/或细胞内的细胞器可视化。例如，尼罗红可以选择性地对细胞内的脂滴和膜进行染色，而罗丹明123是用于定位活细胞中线粒体的特异性探针。通过用尼罗红对同一细胞进行染色并在532nm处激发染料，细胞中的磷脂膜被可视化(图9D)，其中最亮的对比度可能来自ER膜。1650cm-1处的F-MIP图像给出了尼罗红标记区域中的蛋白质的分布(图9E)。当IR激光器被调谐到1750cm-1时，对比度几乎消失(图9F)，显示了化学特异性。为了表明我们的方法适用于其他染料，我们进行了一项独立的实验，其中活的MiaPaca2细胞被罗丹明123标记，目标是细胞内的线粒体(图9G)。相应地，1650cm-1处的F-MIP图像显示了来自罗丹明123标记区域的选择性和明亮对比度(图9H)，并且对比度在1750cm-1处消失(图9I)。
从点扫描到宽场F-MIP
在上述实验中，用于F-MIP成像的功率为微瓦级，并且比用于散射MIP成像的功率低60倍。F-MIP成像的极低光子预算为经由具有IR泵浦脉冲和可见探针脉冲的宽场照明增加吞吐量提供了机会。重要的是，与扫描F-MIP相比，基于以下考虑，宽场F-MIP显著降低了荧光团光漂白速率。在实验中，IR脉冲的持续时间为900ns，以及脉冲间持续时间为10μs。在水环境中，温度曲线在很大程度上遵循IR脉冲。因此，在使用连续波探针激光的扫描实验中，占空比约为10％。然而，在宽场测量中，仅需要两个可见脉冲来测量IR-on和IR-off状态。因此，占空比可以是50％。以这种方式，探针激光功率可以显著降低，从而缓解光漂白问题。值得注意的是，我们的团队最近展示了基于散射的宽场MIP成像。然而，高速模式下的信噪比受到散射对温度的弱依赖性和CMOS摄像头的小井深的限制。因此，需要大量积分来累积足够的光子以探测MIP信号。与散射光子不同，荧光通常不会使摄像头饱和。由于荧光探针的高热敏性，预计MIP信号可以从两个连续帧(热和冷)中被提取，而无需进一步平均。
宽场F-MIP成像系统
如上文详细描述，图3A示出了示例性实施例的宽场F-MIP显微镜100B。由QCL 160生成的红外激光由抛物面镜聚焦。由AOM 162调制的可见光照射样品并激发荧光。荧光由CMOS摄像头164滤波和收集。图10A示出了IR泵浦脉冲、荧光激发脉冲和摄像头曝光的时间同步。图10B和图10C示出了在IR打开和IR关闭情况下Cy2染色的金黄色葡萄球菌的宽场荧光图像，分别指定为热和冷。图10D示出了1650cm-1处的宽场F-MIP，以及图10E示出了1400cm-1处的F-MIP偏共振。比例尺：10μm。荧光激发：488nm，1mW。IR脉冲速率：200KHz。摄像头帧速率：40Hz。
在图3A所示的宽场F-MIP显微镜100B中，脉冲红外激光通过抛物面镜微弱地聚焦到样品上。80-MHz飞秒激光由AOM调制并倍频到可见窗口。飞秒脉冲的宽的带宽减少了基于散射的MIP成像中的斑点。虚拟锁定检测方案在图10A中示出。荧光激发脉冲与IR泵浦脉冲同步。在冷帧中，没有IR泵浦脉冲加热样品。摄像头以示例性的40Hz帧速率依次检测热帧和冷帧。差异(冷-热)生成MIP图像。平均探针激光功率约为1mW，并且曝光时间约为300ns。根据所检查的光谱窗，IR功率在5至15mW的范围内。为了表征空间分辨率，我们绘制了直径为500nm的Cy2标记的聚苯乙烯珠，F-MIP强度曲线显示了610nm的半峰全宽。在用颗粒尺寸去卷积后，空间分辨率被估计为390nm，其接近0.8NA物镜的衍射极限。
为了证明宽场F-MIP对生物样本的适用性，我们将用Cy2染色的金黄色葡萄球菌沉积在硅衬底上，并在IR打开和IR关闭的情况下依次测量荧光。热帧和冷帧分别在图10B和图10C中示出。通过从冷帧中减去热帧，强度差生成图10D所示的F-MIP图像。当IR激光器被调谐到1650cm-1时，对应于蛋白质的酰胺I带，获得的信噪比为30。IR脉冲仅加热视场的上半部分。由于这个原因，只有上部的金黄色葡萄球菌颗粒给出了F-MIP对比度。当IR激光器被调谐到1400cm-1时，偏共振到主IR峰，对比度几乎消失，如图10E所示。注意，每秒20帧的宽场F-MIP成像速度比扫描F-MIP成像速度(每帧100秒，像素停留时间为1.0毫秒)快2000倍。
宽场Sc-MIP和F-MIP之间的性能比较
图11A-11N示出了宽场SC-MIP和宽场F-MIP系统之间的性能比较。图11A示出了沉积在硅衬底上的金黄色葡萄球菌的荧光图像。图11B示出了相同细胞在20Hz速度下的单帧F-MIP图像。图11C示出了相同细胞的在100帧平均情况下的F-MIP图像。图11D示出了沉积在硅衬底上的金黄色葡萄球菌的散射图像。图11E示出了以20Hz速度显示在面板d中的相同细胞的单帧Sc-MIP。图11F示出了在100帧平均的情况下的相同视场的Sc-MIP。图11G示出了沿图11B和图11E中标记的白线的强度曲线。图11H示出了沿图11C和图11F中标记的白线的强度曲线。图11I示出了顺序采集的热帧和冷帧中单个金黄色葡萄球菌的荧光强度。图11J示出了顺序采集的热帧和冷帧中单个金黄色葡萄球菌的散射强度。对于图11A-11K中的数据，IR激光器被调谐到1650cm-1。图11K示出了表达GFP的Sheila Flexneri细菌的荧光图像。图11L示出了相同细菌在1650cm-1处的单帧F-MIP。图11M示出了在100帧平均的情况下的相同视场的F-MIP图像。图11N示出了顺序采集的热帧和冷帧中正方形区域的荧光强度。
使用作为试验台的硅衬底上的金黄色葡萄球菌，比较宽场模式下荧光增强和基于散射的MIP成像的性能。图11A-11C示出了在IR激光器被调谐至1650cm-1的情况下单个金黄色葡萄球菌的荧光和F-MIP图像。单一细菌的信噪比在单帧F-MIP中达到33，并且在100帧平均后达到275。图11D-11F示出了在IR激光器被调谐到1650cm-1的情况下单个金黄色葡萄球菌的散射和SC-MIP图像。图11G-11H示出了穿过图像中指示的白线的强度曲线。在单帧采集中，Sc-MIP对比度完全隐藏在斑点图案中。在100帧平均后，信噪比达到14，其比相同样品的F-MIP低20倍。F-MIP中高得多的信噪比可以归因于散射光子的散粒噪声的缺乏和荧光探针的大得多的热敏性。图11H示出了Sc-MIP和F-MIP中细菌的相似线宽。然而，F-MIP强度不受Sc-MIP图像中遇到的干扰(即，峰值周围的暗环)的影响。图11I-11J示出了在顺序采集的热帧和冷帧中单个细菌的F-MIP和Sc-MIP强度。对于F-MIP，被定义为热帧和冷帧之间的强度差的百分比的调制深度被发现约为4％，但在Sc-MIP中被隐藏在帧间波动中。此外，图11I示出了在1.25秒的时间段内记录的50帧中可忽略的光漂白。
除了荧光染料，还测试了表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞的F-MIP成像的可行性。已经表明，GFP是高度热敏的，温度每升高一度，强度降低1％。因此，在表达GFP的SheilaFlexneri细菌的F-MIP成像中(图11K-11M)，观察到冷帧和热帧之间2％的荧光强度差异(图11N)。在单帧和100帧平均中信噪比分别达到10和97。记录的50帧只经历了3％的光漂白。帧与帧间的荧光波动是由于激光不稳定造成的。
光热显微术是一种泵浦探针技术，涉及通常通过锁定进行的泵浦光束的调制和信号的解调。在本公开中，灵敏度被定义为调制深度，ΔIpr/Ipr＝σIp，其中σ与热敏性相关，Ip是IR泵浦，以及Ipr是探针强度。在这个意义上，荧光检测的MIP比基于散射的MIP更灵敏，因为荧光团的热敏性大得多。实验上，如图11A-11N所示，F-MIP中的调制深度约为2％，而调制被隐藏在Sc-MIP中的帧间强度波动中。
我们已经将成像SNR定义为单个粒子的信号强度与像素间背景波动的比值。因此，在Sc-MIP中，SNR＝Signal/(Noise_PD+Noise_photon)。在F-MIP中，SNR＝Signal/Noise_PMT。在散粒噪声极限下，光子噪声与
Figure GDA0004281884600000201
成比例。基于该模型，如果我们假设使用相同的IR泵浦光束，则SNR取决于σ的值和探针束强度。在扫描MIP显微镜中，散射模式下的探针功率(～10mW)可以比荧光模式下的功率(～1μW)大10000倍。在这种情况下，Sc-MIP中的SNR受光子噪声支配，并且/>
Figure GDA0004281884600000202
在F-MIP中，SNR＝σfIpIpr/Noise_PMT。在这种情况下，F-MIP中的SNR是在所使用的更大的σ和更小的Ipr之间的权衡。实验上，与Sc-MIP相比，我们观察到F-MIP中类似的SNR(见图8A-8G)。然而，在宽场MIP显微术中，受普通CMOS摄像头的井深限制，对于散射和荧光模态，每个像素处的探针功率都处于nW水平。在这种情况下，检测器噪声占主导地位，并且F-MIP中的SNR理论上可以比Sc-MIP中的SNS大两个数量级。在实验中，我们发现宽场MIP中的SNR是宽场Sc-MIP中的20倍。
理论上，F-MIP显微术是基于从目标分子到荧光探针的热扩散。热扩散长度被定义为
Figure GDA0004281884600000211
其中α是热扩散率。在水环境中，α的值为1.4×10-7m2/s。在我们的宽场F-MIP实验中，IR脉冲持续时间为900ns，以及荧光激发脉冲为300nm。如果我们将泵浦探针延迟设定为900ns，则热扩散长度为～700nm，其略大于可见探针束的衍射极限。如果可以使用持续时间为5ns的IR泵浦和可见探针脉冲，并且泵浦探针延迟被设定为5ns，则热扩散长度可以减小到50nm。在这种情况下，可以在纳米级上检测荧光探针周围的化学成分。如果探针与目标分子偶联，就像GFP与蛋白质偶联一样，皮秒级的分子内振动重分布可能比分子间振动重分布快得多。原则上，假设使用皮秒红外泵浦和探针脉冲，它可以产生分子内F-MIP信号。
先前已经研究了热敏性对两个重要环境因素(盐浓度和粘度)的依赖性。结果表明，在10至100mM范围内，热敏性几乎与盐浓度无关。此外，还表明PEG-BODIPY在细胞中的寿命是由温度决定的，并且与粘度的变化无关。这些数据表明，荧光团的热敏性可以被用作中红外光热效应的可靠读数。
F-MIP显微术为活细胞化学成像开辟了新的机会。首先，F-MIP大大增强了MIP显微镜的特异性。为了说明该优点，可以用直接荧光信号归一化F-MIP信号。如图12A-12F所示，归一化的F-MIP图像展示了染料标记区域中蛋白质产生的信号的更均匀分布。相反，由于线粒体中罗丹明123的富集，因此在F-MIP图像(图9H)中可以清楚地看到单个线粒体。第二，通过由热敏荧光团(例如BODIPY)特异性标记的特定细胞器(例如脂滴)的F-MIP光谱成像，不仅能够分辨出脂质的数量和分布，而且可以分辨出脂质的组成，这是单靠荧光显微术无法达到的。这种能力将允许在各种条件下(例如，响应于应激)对细胞中的脂质代谢进行定量。第三，F-MIP显微术开辟了推进中红外光热显微术边界的新途径。例如，红外激光激发和光场荧光探针的集成有望实现亚微米空间分辨率的单次体积红外光谱成像。此外，可以利用结构化照明来打破可见光束的衍射极限，这有望将MIP显微术的空间分辨率推向新的水平。
与MIP显微术相比，F-MIP显微术依赖于用热敏染料标记样本，并且信号水平取决于染料浓度。与基于散射的MIP不同，F-MIP不能在荧光染料不存在的位置检测振动激发。当解释F-MIP对比度时，应该使用荧光图像作为参考。为了定量比较不同颗粒之间的F-MIP信号水平，需要用荧光强度进行归一化。可替代的方法是测量荧光寿命的热调制而不是强度。出于同样的原因，F-MIP显微术的SNR取决于待检测颗粒中荧光团的数量。对于生物纳米颗粒，诸如病毒颗粒，少量荧光标记可能给出低信号水平，并相应地限制SNR。在这种情况下，干涉散射的检测成为更合适的方法。事实上，单个病毒颗粒的检测和指纹识别已经通过干涉式中红外光热显微镜实现。
结论
为了推动检测极限以及提高光学检测的中红外光热显微术的特异性，开发了一种称为荧光增强中红外光热(F-MIP)显微术的新平台。我们的平台利用热敏荧光探针来感测由脉冲红外激发引起的周围温度升高。在DMSO溶液中和生物细胞内荧光探针被证明具有高光谱保真度。在点扫描模式中，我们展示了单一细菌的F-MIP成像和指纹识别。当使用荧光作为读数时，指纹信息将允许对生物样本进行功能评估，诸如细菌对抗生素治疗的代谢反应。此外，实现了细胞器特定的F-MIP成像，这为探索细胞内细胞器的化学含量提供了令人兴奋的机会。在宽场模式中，我们展示了单一细菌的视频速率、高信噪比、无斑点F-MIP成像。最后，我们的平台适用于表达GFP的生物细胞。这种方法为监测GFP标记的特定蛋白质的二级结构提供了新的机会，这是单靠IR光谱或荧光光谱无法达到的。
尽管本领域普通技术人员在阅读了前面的描述后，对本公开的许多变更和修改将变得显而易见，但应当理解，以说明的方式示出和描述的特定实施例决不旨在被认为是限制性的。此外，已经参考特定实施例描述了主题，但是本领域技术人员将会想到在本公开的精神和范围内的变化。应当注意，提供前面的示例仅仅是为了解释的目的，并且决不能解释为对本公开的限制。
虽然本发明概念已经参考其示例性实施例进行了具体显示和描述，但本领域普通技术人员将理解，在不脱离由以下权利要求限定的本发明概念的精神和范围的情况下，可以对其在形式和细节上进行各种改变。

Claims (22)

1.一种用于对荧光标记的样品的显微分析的系统，包括：
用于生成中红外光束的中红外(IR)光源，所述中红外光束被引导到所述样品的至少一部分上，以通过所述中红外光束的吸收而引起所述样品的部分中的温度变化；
用于生成探针束的光源，所述探针束被引导以撞击所述样品；
检测器，用于当所述探针束撞击所述样品时检测来自所述样品的荧光发射；以及
数据采集和处理系统，用于采集和处理来自所述样品的所检测到的荧光发射，以：(i)生成指示通过所述样品的部分进行的红外吸收的信号，(ii)基于指示通过所述样品的部分进行的红外吸收的信号而生成指示所述样品的部分中的温度的信号，(iii)使用指示所述样品的部分中的温度的信号而生成所述样品的部分的图像。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述荧光标记的样品包括用荧光染料标记的样品，所述荧光染料包括罗丹明B、荧光素、cy2、cy3、尼罗红和绿色荧光蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述中红外光束是脉冲调制光束。
4.根据权利要求3所述的系统，其中，所述中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率在1.0至1000kHz的范围内。
5.根据权利要求3所述的系统，其中，所述中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率为标称上的100kHz。
6.根据权利要求3所述的系统，其中，所述中红外光束的脉冲的接通持续时间在1.0纳秒至1.0毫秒的范围内。
7.根据权利要求3所述的系统，其中，所述中红外光束的占空比在0.01％至50％的范围内。
8.根据权利要求1所述的系统，其中，所述中红外光束在所述样品的多个部分上被扫描，从而生成用于所述样品的多个部分的图像。
9.根据权利要求1所述的系统，其中：
所述中红外光束被引导到所述样品的多个部分上；并且
所述检测器包括二维检测器阵列，从而生成用于所述样品的多个部分的图像。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，所述检测器包括摄像头。
11.根据权利要求1所述的系统，还包括物镜，其被配置为将所述中红外光束聚焦到所述样品上。
12.一种用于对荧光标记的样品的显微分析的方法，包括：
将中红外光束引导到所述样品的至少一部分上，以通过所述中红外光束的吸收而引起所述样品的部分中的温度变化；
引导探针束撞击所述样品；
当所述探针束撞击所述样品时，检测来自所述样品的荧光发射；以及
接收并处理来自所述样品的荧光发射，所述处理包括：(i)生成指示通过所述样品的部分进行的红外吸收的信号，(ii)基于指示通过所述样品的部分进行的红外吸收的信号而生成指示所述样品的部分中的温度的信号，(iii)使用指示所述样品的部分中的温度的信号而生成所述样品的部分的图像。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述荧光标记的样品包括用荧光染料标记的样品，所述荧光染料包括罗丹明B、荧光素、cy2、cy3、尼罗红和绿色荧光蛋白中的至少一种。
14.根据权利要求12所述的方法，还包括对所述中红外光束进行脉冲调制，使得所述中红外光束是脉冲调制光束。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率在1.0至1000kHz的范围内。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述中红外光束中的脉冲的脉冲重复频率标称为100kHz。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述中红外光束的脉冲的接通持续时间在1纳秒至1毫秒的范围内。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，所述中红外光束的占空比在0.01％至50％的范围内。
19.根据权利要求12所述的方法，还包括在所述样品的多个部分上扫描所述中红外光束，从而生成用于所述样品的多个部分的图像。
20.根据权利要求12所述的方法，其中：
所述中红外光束被引导到所述样品的多个部分上；并且
所述检测器包括二维检测器阵列，从而生成用于所述样本的多个部分的图像。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述检测器包括摄像头。
22.根据权利要求12所述的系统，还包括用物镜将所述中红外光束聚焦到所述样品上。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116678853A (zh) * 2023-08-03 2023-09-01 汕头大学 一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11913881B2 (en) * 2022-07-15 2024-02-27 Trustees Of Boston University Bond-selective intensity diffraction tomography and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2615017C (en) * 2005-07-18 2015-06-02 Andreas Mandelis Method and apparatus using infrared photothermal radiometry (ptr) and modulated laser luminescence (lum) for diagnostics of defects in teeth
WO2013078471A1 (en) * 2011-11-25 2013-05-30 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Chemical mapping using thermal microscopy at the micro and nano scales
WO2016123088A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods and apparatus for infrared and mid-infrared sensing
US11369965B2 (en) * 2016-03-10 2022-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Light-mediated polymerase chain reaction amplification and product detection system and methods of use
KR102457857B1 (ko) * 2016-08-22 2022-10-24 브루커 나노, 아이엔씨. 진동 모드를 이용한 샘플의 적외선 특성
WO2018165591A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Photothermal Spectroscopy Corp. Method and apparatus for infrared scanning near-field optical microscopy based on photothermal effect
US10942116B2 (en) * 2017-10-09 2021-03-09 Photothermal Spectroscopy Corp. Method and apparatus for enhanced photo-thermal imaging and spectroscopy
US10989903B2 (en) * 2018-02-26 2021-04-27 Washington State University Modular scanning confocal optical profile microscopy with digital imaging processing
US11592652B2 (en) * 2018-09-04 2023-02-28 California Institute Of Technology Enhanced-resolution infrared photoacoustic microscopy and spectroscopy
WO2022020356A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 Photothermal Spectroscopy Corp. Fluorescence enhanced photothermal infrared spectroscopy and confocal fluorescence imaging

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116678853A (zh) * 2023-08-03 2023-09-01 汕头大学 一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法
CN116678853B (zh) * 2023-08-03 2023-11-14 汕头大学 一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法

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