CN116678853A - 一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法,其中所述干涉散射显微镜包括样本放置模块、干涉散射模块、光增强模块和成像模块;所述样本放置模块用于放置待测样本溶液;所述干涉散射模块用于产生第一光束并入射到待测样本溶液,激发待测样本溶液中的纳米颗粒产生干涉散射光;所述光增强模块用于产生第二光束并入射到待测样本溶液,激发待测样本溶液发生光热效应以增强干涉散射光;所述干涉散射模块还用于接收增强的干涉散射光并传输至成像模块;所述成像模块用于实时采集增强的干涉散射光并进行成像处理,以得到待测样本溶液对应的光学视频数据。本发明通过引入光热效应原理,可适用于弱散射样本进行清晰可靠的成像操作。
Description
技术领域
本发明涉及成像技术领域,具体是涉及一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法。
背景技术
干涉散射成像技术在单个纳米颗粒的检测与分析领域中起到较为关键作用,有助于对蛋白质、病毒、微囊泡等生物纳米颗粒进行快速检测和长时动态分析。但是,目前为实现干涉散射成像技术所设计出来的干涉散射显微镜大多数仅能对高散射样本进行稳健且准确地成像处理,而对于弱散射样本明显存在成像效果差的缺陷。
发明内容
本发明提供一种基于光热效应的干涉散射显微镜及成像方法,以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题,至少提供一种有益的选择或创造条件。
第一方面,提供一种基于光热效应的干涉散射显微镜,包括:
样本放置模块,用于放置待测样本溶液;
干涉散射模块,用于产生第一光束并入射到所述待测样本溶液,激发所述待测样本溶液中的纳米颗粒产生干涉散射光;
光增强模块,用于产生第二光束并入射到所述待测样本溶液,激发所述待测样本溶液发生光热效应以增强所述干涉散射光;
所述干涉散射模块还用于接收增强的干涉散射光并将其传输至成像模块;
成像模块,用于实时采集增强的干涉散射光并对其进行成像处理,以得到所述待测样本溶液对应的光学视频数据;
其中,所述第一光束和所述第二光束处于同一垂直线上,且所述第一光束的入射方向与所述第二光束的入射方向相反。
进一步地,所述干涉散射模块包括第一激光器、反射镜组、聚光透镜、分束器、第一远心套筒透镜和物镜;
由所述第一激光器发射第一激光,所述第一激光经由所述反射镜组改变自身高度之后经由所述聚光透镜汇聚到所述分束器的反射区域中心,经反射的第一激光再经由所述第一远心套筒透镜聚焦到所述物镜的后焦平面上,最后由所述物镜输出第一光束。
进一步地,所述反射镜组包括两个反射镜,所述两个反射镜通过标准光学爬高架进行固定设置,且所述两个反射镜的反射面相对设置。
进一步地,所述第一激光的波长为589nm。
进一步地,所述光增强模块包括第二激光器、光纤和光纤准直器;
由所述第二激光器发射第二激光,所述第二激光经由所述光纤输出至所述光纤准直器,再由所述光纤准直器输出第二光束。
进一步地,所述第二激光的波长为808nm。
进一步地,所述成像模块包括宽场套筒透镜、第二远心镜筒透镜和成像传感器;
所述增强的干涉散射光经由所述物镜和所述第一远心套筒透镜穿过所述分束器的透射区域中心,再经由所述宽场套筒透镜和所述第二远心镜筒透镜聚焦到所述成像传感器。
进一步地,所述样本放置模块包括三维精密工作台、样本放置架和样本容器,所述样本放置架是由多个玻片堆叠形成的;
所述样本容器用于盛放待测样本溶液,所述样本放置架内设有空腔,所述空腔用于放置所述样本容器,所述三维精密工作台固定所述样本放置架的两端,用于根据所述第一光束与所述第二光束的交点位置调整所述样本容器的位置。
第二方面,提供一种成像方法,应用到如第一方面所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,所述成像方法包括:
采用光热试剂对待测样本进行预处理,得到待测样本溶液;
控制干涉散射模块和光增强模块启动并在设定时间段内进行预热操作;
当所述待测样本溶液放置在样本放置模块,且所述干涉散射模块产生的第一光束和所述光增强模块产生的第二光束同时入射到所述待测样本溶液时,控制成像模块启动以获取所述待测样本溶液对应的光学视频数据。
进一步地,所述采用光热试剂对待测样本进行预处理的方法包括电穿孔法、超声波法和偶联法中的一种。
本发明至少具有以下有益效果:在利用干涉散射模块激发待测样本溶液发生干涉散射的过程中,同时利用光增强模块激发待测样本发生光热效应以使其所在介质的折射率发生改变,从而增强该待测样本溶液的干涉散射效果,使得成像模块可以针对该待测样本溶液生成更为清晰可靠的光学视频数据以供实验人员进行检测分析;本发明可适用于对弱散射样本进行成像操作。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明的技术方案,并不构成对本发明技术方案的限制。
图1是本发明实施例中的一种基于光热效应的干涉散射显微镜的结构组成示意图;
图2是本发明实施例中的样本放置架的简易结构组成示意图;
图3是本发明实施例中的一种成像方法的流程示意图;
图4是本发明实施例中的增加光热效应处理后得到的光学图像示意图;
图5是本发明实施例中的未增加光热效应处理得到的光学图像示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
需要说明的是,虽然在系统示意图中进行了功能模块划分,在流程图中示出了逻辑顺序,但是在某些情况下,可以以不同于系统中的模块划分,或流程图中的顺序执行所示出或描述的步骤。本申请的说明书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序,应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或装置不必限定于清楚列出的那些步骤或单元,而是可以包含没有清楚列出的对于这些过程、方法、产品或装置固有的其他步骤或单元。
请参考图1,图1是本发明实施例提供的一种基于光热效应的干涉散射显微镜的结构组成示意图,所述干涉散射显微镜主要包括样本放置模块、干涉散射模块、光增强模块和成像模块。
在具体实施过程中,利用所述样本放置模块来放置待测样本溶液,且所述待测样本溶液应当是利用光热试剂对待测样本进行制备得到的;利用所述干涉散射模块产生第一光束,并控制所述第一光束入射到所述待测样本溶液,由此激发所述待测样本溶液中的纳米颗粒发生干涉散射现象以产生干涉散射光;利用所述光增强模块产生第二光束,并控制所述第二光束入射到所述待测样本溶液,由此激发待测样本发生光热效应以使其所在介质的折射率发生改变,从而对所述干涉散射光起到增强作用;利用所述干涉散射模块接收增强的干涉散射光并将其引导至所述成像模块;利用所述成像模块实时采集增强的干涉散射光并对其进行成像处理,以获取所述待测样本溶液所对应的光学视频数据。
需要说明的是,所述第一光束和所述第二光束应当保持在同一垂直线上,即所述第一光束与所述第二光束之间的交点位置落在所述待测样本溶液中的同个纳米颗粒上,以使得所述待测样本溶液中的该纳米颗粒达到最佳的光吸收和光热效应,并且要求所述第一光束的入射方向和所述第二光束的入射方向是相反的,以避免所述第一光束和所述第二光束在传输过程中的相互干扰;优选地,所述第一光束垂直于所述待测样本溶液的水平面进行由下往上的均匀照射,所述第二光束垂直于所述待测样本溶液的水平面进行由上往下的均匀照射。
更为具体的,所述样本放置模块主要包括可以自由拆卸下来的样本容器110、样本放置架120和三维精密工作台130;其中,所述样本容器110和所述样本放置架120均是由可透光的材料制成的,所述样本容器110可以选择实验室用的透明玻璃容器,所述样本放置架120则是由多个玻片堆叠形成的;所述三维精密工作台130的分辨率优选为50nm。
此处对所述样本放置架120的结构组成进行展开描述:参见图2所示,所述样本放置架120是由两个载玻片121和四个盖玻片122所组成的,其中每个载玻片的长度为76mm、宽度为25mm、厚度为1mm,每个盖玻片的长度为24mm、宽度为24mm、厚度为0.17mm,实验人员首先用75%酒精对所述两个载玻片121和所述四个盖玻片122进行消毒擦拭干净,接着用吸管在第一个载玻片的最左侧滴一滴甘油PBS封片剂之后盖上第一个盖玻片且尽量保持干净无气泡,用吸管在第一个载玻片的最右侧滴一滴甘油PBS封片剂之后盖上第二个盖玻片且尽量保持干净无气泡,用吸管在第一个盖玻片上滴一滴甘油PBS封片剂之后盖上第三个盖玻片,尽量保持干净无气泡且尽量满足第一个盖玻片与第三个盖玻片完全重合,用吸管在第二个盖玻片上滴一滴甘油PBS封片剂之后盖上第四个盖玻片,尽量保持干净无气泡且尽量满足第二个盖玻片与第四个盖玻片完全重合,最后用吸管在第三个盖玻片上滴一滴甘油PBS封片剂以及在第四个盖玻片上滴一滴甘油PBS封片剂之后盖上第二个载玻片,尽量保持干净无气泡且尽量满足第一个载玻片与第二个载玻片保持相互平行;需要说明的是,由于第一个载玻片与第二个载玻片之间并没有完全重合,第一个载玻片与第二个载玻片之间实际形成一个空腔结构,也就是所述样本放置架120的内部设置有一个空腔123。
在具体实施过程中,通过所述空腔123来容纳放置已经盛放有所述待测样本溶液的所述样本容器110,通过所述三维精密工作台130来根据所述第一光束和所述第二光束之间的交点位置调整所述样本放置架120的空间位置,进而调整其内部放置的所述样本容器110的空间位置;需要说明的是,所述三维精密工作台130在使用时主要是夹紧所述样本放置架120的两端,可以是所述两个载玻片121的所有长边,又或者是所述两个载玻片121的所有宽边,以此确保所述三维精密工作台130对所述样本容器110的顶部和底部均是毫无遮挡的,使得所述第一光束和所述第二光束可以正常入射到所述待测样本溶液。
更为具体的,所述干涉散射模块主要包括第一激光器210、反射镜组220、聚光透镜230、分束器240、第一远心套筒透镜250和物镜260;其中,所述反射镜组220是由两个反射镜组成的,利用标准光学爬高架上所设置的两个完全可调的反射镜支架对所述两个反射镜进行安装,并且限定所述两个反射镜的反射面是相对设置的;所述第一远心套筒透镜250的焦距优选为180mm,所述物镜260的放大倍数优选为20倍,所述分束器240优选采用立方体结构。
在具体实施过程中,由所述反射镜组220、所述聚光透镜230、所述分束器240、所述第一远心套筒透镜250和所述物镜260形成第一光路通道,首先控制所述第一激光器210发射出波长为589nm的第一激光,接着通过所述反射镜组220改变所述第一激光的高度之后,再通过所述聚光透镜230将当前的第一激光汇聚到所述分束器240的反射区域中心,使得当前的第一激光经过反射之后经由所述第一远心套筒透镜250松散地聚焦到所述物镜260的后焦平面261上,最后由所述物镜260直接输出由所述第一激光经过所述第一光路通道处理之后得到的第一光束,以照射落在所述物镜260的光轴上且位于其共轭焦平面上的所述待测样本溶液中的纳米颗粒。
更为具体的,所述光增强模块主要包括第二激光器310、光纤320和光纤准直器330;其中,所述第二激光器310采用光纤耦合激光器,所述光纤320的入纤端与所述第二激光器310进行耦合连接,所述光纤320的出纤端通过光纤帽与所述光纤准直器330进行连接。
在具体实施过程中,由所述光纤320和所述光纤准直器330形成第二光路通道,首先控制所述第二激光器310发射出波长为808nm的第二激光,再通过所述光纤320将所述第二激光传输至所述光纤准直器330,最后由所述光纤准直器330直接输出由所述第二激光经过所述第二光路通道处理之后得到的第二光束,以照射在所述第一光束当前照射的所述待测样本溶液中的纳米颗粒上。
需要说明的是,所述第一激光器210可以发射出其他波长的第一激光,同理所述第二激光器310也可以发射出其他波长的第二激光,在一般情况下,确保所述第一激光和所述第二激光的波长不相同即可。
更为具体的,所述成像模块主要包括宽场套筒透镜410、第二远心镜筒透镜420和成像传感器430,所述第二远心镜筒透镜420的焦距优选为180mm。
在具体实施过程中,由所述物镜260、所述第一远心套筒透镜250、所述分束器240、所述宽场套筒透镜410和所述第二远心镜筒透镜420形成第三光路通道,通过所述物镜260接收到所述增强的干涉散射光之后经由所述第一远心套筒透镜250传输至所述分束器240的透射区域中心,使得当前增强的干涉散射光经过透射之后再经由所述宽场套筒透镜410和所述第二远心镜筒透镜420聚焦到所述成像传感器430,最后由所述成像传感器430对从所述第三光路通道实时接收到增强的干涉散射光进行成像处理。
需要说明的是,上述四个模块中所包含的各个部件均是在三维空间中悬挂布设的,也就是应当借助外部的固定器将各个部件按照图1所示方式进行布设,但该固定器并未在图1中绘制出,仅在此处作出说明。
请参考图3,图3是本发明实施例提供的一种成像方法的流程示意图,所述成像方法需要应用到图1所提供的一种基于光热效应的干涉散射显微镜,具体包括如下:
步骤S100、采用光热试剂对待测样本进行预处理,得到待测样本溶液;
步骤S200、控制干涉散射模块和光增强模块启动并在设定时间段内进行预热操作;其中,所述设定时间段优选设置为15分钟;
步骤S300、当所述待测样本溶液放置在样本放置模块,且所述干涉散射模块产生的第一光束和所述光增强模块产生的第二光束同时入射到所述待测样本溶液时,控制成像模块启动以获取所述待测样本溶液对应的光学视频数据。
在上述步骤S100中,可以采用的预处理方式包括但不仅限于偶联法、超声波法和电穿孔法中的任意一种。
在上述步骤S300中,可以通过所述样本放置模块对所述待测样本溶液的空间位置进行调整,使得所述成像模块可以对所述待测样本溶液的不同区域进行成像处理,同时可以根据自身需求设置所述成像模块的单次工作时长,也就是限定所述成像模块针对单个区域生成的光学视频数据的总时长,本发明优选设置为30秒。
在本发明实施例中,以利用图1所示出的所述干涉散射显微镜对来源于乳腺癌细胞的胞外囊泡进行检测为例,所述胞外囊泡即为所述待测样本,对上述成像方法进行展开说明如下:
步骤一,制备黑磷量子点以作为所述胞外囊泡所需要应用到的光热试剂,相应的制备过程为:
称取134.3mg的BP(磷化硼)晶体粉末,将其倒入50mL的离心管中再加入25mL的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液;
将该离心管夹紧至架物台上,设置超声波粉碎仪的超声功率为95%以及单次超声操作的时间为45分钟,再将该超声波粉碎仪的探头伸入到该离心管,以对其内部装有的BP-NMP溶液进行重复五次的超声操作,并且在整个超声操作过程中对该离心管进行冰水浴,以减缓整个超声操作所产生的热量造成BP氧化降解;
设置P系列液晶无极调功超声波清洗机(以下简称超声波清洗机)的超声功率为85%,在该架物台上固定住该离心管之后整体放入到该超声波清洗机,利用该超声波清洗机对该离心管中的BP-NMP溶液进行持续一小时的超声操作,并且在整个超声操作过程中需要对该超声波清洗机更换一次水;
将该离心管放入到离心机中,设置该离心机的转速为5000rpm以及单次离心操作的时间为15分钟,控制该离心机对该离心管内部装有的BP-NMP溶液进行配平离心取上清,以去除掉其中未破碎的晶体粉末;
设置该离心机的转速为15000rpm以及单次操作时间为15分钟,控制该离心机对该离心管内部装有的BP-NMP溶液进行取沉淀,以去除掉其中的NMP溶液;
在该离心管的内部加入10mL的离子水,设置该超声波清洗机的超声功率为85%以及单次超声操作的时间为5分钟,在该架物台上固定住该离心管之后整体放入到该超声波清洗机,再利用该超声波清洗机对该离心管中的黑磷量子点进行单次超声清洗以使其分布均匀;
将该离心管放入到离心机中,设置该离心机的转速为15000rpm以及单次操作时间为15分钟,控制该离心机对该离心管内部装有的BP-NMP溶液再次进行取沉淀,以完全去除掉其中的NMP溶液;
在该离心管的内部加入10mL的离子水,设置该超声波清洗机的超声功率为85%以及单次超声操作的时间为10分钟,在该架物台上固定住该离心管之后整体放入到该超声波清洗机,再利用该超声波清洗机对该离心管中的黑磷量子点进行单次超声清洗,得到最终所需的黑磷量子点。
步骤二,基于超声波法,采用所述黑磷量子点对所述胞外囊泡进行预处理以得到待测样本溶液,相应的预处理过程为:
取适量的黑磷量子点和去离子水倒入至第一离心管中进行超声混匀,以制备成浓度为100μg/mL的黑磷量子点溶液;
按照1:2.5的配比,从所述胞外囊泡中提取出400uL原液以及从该第一离心管中提取出1mL黑磷量子点溶液并倒入至第二离心管中进行超声混匀,设置超声功率为20%,单次超声操作的时间为30秒,重复超声操作六次,并且在每次超声操作结束时进行冷却两分钟;
将该第二离心管放置于37℃室温环境下进行孵育一小时,使得所述胞外囊泡的膜微粘度完全恢复;
对该第二离心管中的溶液进行离心操作12分钟直至低于7000g,取沉淀,去离子水清洗两次,去离子水重悬;
对该第二离心管中的溶液稀释20倍左右,以配置得到待测样本溶液。
步骤三,控制所述光增强模块和所述干涉散射模块均处于启动状态,再进行15分钟的预热操作。
步骤四,采用1mL量程的移液枪将所述待测样本溶液均匀地在所述样本容器110中铺展开,再将所述样本容器110放置到所述样本放置架120的空腔123。
步骤五,当所述干涉散射模块所产生的第一光束和所述光增强模块所产生的第二光束可以同时入射到所述待测样本溶液,且已经满足所述第一光束和所述第二光束保持在同一垂直线上时,控制所述成像模块处于启动状态以获取所述待测样本溶液所对应的光学视频数据,其中的任意一帧光学图像数据可参见图4所示。
此外,作为效果对比的一个实施例,首先从所述胞外囊泡中提取出400uL原液倒入至第三离心管,对该第三离心管中的原液稀释10倍左右以配置得到待测样本溶液;其次仅控制所述干涉散射模块处于启动状态即可,再进行15分钟的预热操作;接着采用1mL量程的移液枪将该待测样本溶液均匀地在所述样本容器110中铺展开,再将所述样本容器110放置到所述样本放置架120的空腔123中;最后直接控制所述成像模块处于启动状态以获取该待测样本溶液所对应的光学视频数据,其中的任意一帧光学图像数据可参见图5所示。
将图4与图5进行比较可知,图4所呈现出来的成像效果更优于图5所呈现出来的成像效果,图4中可以明显地观察到待测样本(已用白色圆圈框出),但图5中存在较多的噪声干扰,很难从图5中清晰快速地观察到该待测样本。
在本发明实施例中,在利用干涉散射模块激发待测样本溶液发生干涉散射的过程中,同时利用光增强模块激发待测样本发生光热效应以使其所在介质的折射率发生改变,从而增强该待测样本溶液的干涉散射效果,使得成像模块可以针对该待测样本溶液生成更为清晰可靠的光学视频数据以供实验人员进行检测分析;本发明可适用于对弱散射样本进行成像操作。
尽管本申请的描述已经相当详尽且特别对几个所述实施例进行了描述,但其并非旨在局限于任何这些细节或实施例或任何特殊实施例,而是应当将其视作是通过参考所附权利要求,考虑到现有技术为这些权利要求提供广义的可能性解释,从而有效地涵盖本申请的预定范围。此外,上文以发明人可预见的实施例对本申请进行描述,其目的是为了提供有用的描述,而那些目前尚未预见的对本申请的非实质性改动仍可代表本申请的等效改动。
Claims (10)
1.一种基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,包括:
样本放置模块,用于放置待测样本溶液;
干涉散射模块,用于产生第一光束并入射到所述待测样本溶液,激发所述待测样本溶液中的纳米颗粒产生干涉散射光;
光增强模块,用于产生第二光束并入射到所述待测样本溶液,激发所述待测样本溶液发生光热效应以增强所述干涉散射光;
所述干涉散射模块还用于接收增强的干涉散射光并将其传输至成像模块;
成像模块,用于实时采集增强的干涉散射光并对其进行成像处理,以得到所述待测样本溶液对应的光学视频数据;
其中,所述第一光束和所述第二光束处于同一垂直线上,且所述第一光束的入射方向与所述第二光束的入射方向相反。
2.根据权利要求1所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述干涉散射模块包括第一激光器、反射镜组、聚光透镜、分束器、第一远心套筒透镜和物镜;
由所述第一激光器发射第一激光,所述第一激光经由所述反射镜组改变自身高度之后经由所述聚光透镜汇聚到所述分束器的反射区域中心,经反射的第一激光再经由所述第一远心套筒透镜聚焦到所述物镜的后焦平面上,最后由所述物镜输出第一光束。
3.根据权利要求2所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述反射镜组包括两个反射镜,所述两个反射镜通过标准光学爬高架进行固定设置,且所述两个反射镜的反射面相对设置。
4.根据权利要求2所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述第一激光的波长为589nm。
5.根据权利要求1所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述光增强模块包括第二激光器、光纤和光纤准直器;
由所述第二激光器发射第二激光,所述第二激光经由所述光纤输出至所述光纤准直器,再由所述光纤准直器输出第二光束。
6.根据权利要求5所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述第二激光的波长为808nm。
7.根据权利要求2所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述成像模块包括宽场套筒透镜、第二远心镜筒透镜和成像传感器;
所述增强的干涉散射光经由所述物镜和所述第一远心套筒透镜穿过所述分束器的透射区域中心,再经由所述宽场套筒透镜和所述第二远心镜筒透镜聚焦到所述成像传感器。
8.根据权利要求1所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,其特征在于,所述样本放置模块包括三维精密工作台、样本放置架和样本容器,所述样本放置架是由多个玻片堆叠形成的;
所述样本容器用于盛放待测样本溶液,所述样本放置架内设有空腔,所述空腔用于放置所述样本容器,所述三维精密工作台固定所述样本放置架的两端,用于根据所述第一光束与所述第二光束的交点位置调整所述样本容器的位置。
9.一种成像方法,其特征在于,应用到如权利要求1-8中任一项所述的基于光热效应的干涉散射显微镜,所述成像方法包括:
采用光热试剂对待测样本进行预处理,得到待测样本溶液;
控制干涉散射模块和光增强模块启动并在设定时间段内进行预热操作;
当所述待测样本溶液放置在样本放置模块,且所述干涉散射模块产生的第一光束和所述光增强模块产生的第二光束同时入射到所述待测样本溶液时,控制成像模块启动以获取所述待测样本溶液对应的光学视频数据。
10.根据权利要求9所述的成像方法,其特征在于,所述采用光热试剂对待测样本进行预处理的方法包括电穿孔法、超声波法和偶联法中的一种。
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