CN109060736A - 用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法，成像装置包括光源整形模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源整形模块用于将圆形光整形为椭圆形光斑；光片生成模块用于根据椭圆形光斑生成片状光束；样品控制模块用于当片状光束照射在样品上时控制样品沿着与光轴垂直的方向运动；图像采集模块用于采集样品在运动时不同位置被激发出的荧光信号从而获得样品的三维图像序列。本发明能够在短光程下产生椭圆光，从而生成一种高而厚的光片，使光束形状更适于深层液滴原位封闭成像，同时由于无需用狭缝阻拦激光，激光能量利用率提高四倍以上，能在大视野下提升通光孔径，减小采集端的长度，体积小巧，集成度更高。

Description

用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法。
背景技术
乳液液滴是化学生物领域中实用并且正在迅速发展的有力工具之一。乳液液滴的尺寸通常在数微米到几百微米之间，在特定表面活性剂的作用下稳定存在于油包水乳液中。由于当前手段限制和技术惯例等原因，科研以及生产中的乳液液滴一般处于10微米到300微米之间。微乳液滴由于能够将样品(多为水溶液)均匀的分散为多份体积近乎相同的单元；这些单元相互隔绝，形成了独立的反应空间，从而可以极大的提高反应的通量。由于形成微乳液滴大小相同或相近，可以用于合成大量微小尺度的结晶颗粒、聚合物小球等；形成的固态颗粒物大小相近，并且合成过程容易调控。
微乳液滴独立分隔的特性可以让数字链式酶反应等基于极限稀释策略的检测定量方法极大程度的提高精确度和分辨率。目前常见的数字细菌计数、数字细胞计数，数字聚合酶链式反应等数字式定量技术都是基于微乳液滴的均匀分隔特点，其策略分为三步：样品液滴化分隔、信号放大反应以及计数处理。其中荧光液滴的计数处理常有两种办法：液滴逐个通过微流通道并在荧光探测点的时序性计数，以及液滴平铺在一个平面或者旋转圆柱表面上，通过荧光成像的办法获取荧光液滴的位置和数目等信息。以上两种，逐个探测计数以及平面拍照方法都存在不足。逐个探测计数中的液滴处于流动状态，需要稳定乳液的流速，因此需要额外微流体控制，对于黏度高或者液滴致密的乳液，还需要在乳液进入探测点前加入稀释油以间隔液滴。平面拍照的方法只能拍到至多三层液滴，由于折射的原因，如果不做特别折射率处理，更加深层的液滴的成像几乎无法实现。除此之外，两种计数方法都需要在特定的容器内成像，此中必将涉及扩增后产物的转移。这一做法将极有可能污染后续的实验，使得后续实验出现假阳性的概率大大增加。
为避免产物的转移带来的污染，在离心管内原位封闭读取微流孔板芯片的方法已经问世。然而此方法存在以下缺点：第一，涉及微流芯片加工工艺，成本不菲，且需要与芯片相匹配的反应设备(例如聚合酶链式反应所需的加热设备)以及减小蒸发设备；第二，在微流芯片上生产微乳液所需的气路、流路管道复杂，且微流芯片上得到的液滴数量、生成液滴的速度远小于微乳液滴的分隔方法，数字检测的动态范围和灵敏度因此掣肘。要实现原位封闭大量微乳液滴的光学信号读取，需要解决如何进行深层液滴成像的问题。
光片荧光显微技术是利用片状光源层析照明的办法，通过逐层扫描激发样品的荧光信号，得到序列荧光图像，然后将多帧图像进行三维重构。相比于普通的宽场照明，光片扫描通过选择性激发某一个平面，可以有效地避免焦外激发，从而很大程度上提高成像的对比度和分辨率，并具备三维成像能力。目前，光片显微技术通常采用扩束镜和可调狭缝光阑，产生高而薄或矮而厚的光片，高而薄的光片分辨率高但聚焦范围(可以理解为可用范围)窄，矮而厚的光片可用范围大但光片很矮。因此此类光片适用于小型生物体或组织成像，如斑马鱼胚胎，果蝇、鼠脑等，不适用于大量液滴这样一种大样品的深层原位封闭成像。此外，现有的光片显微镜系统体积较为庞大，价格高昂，操作繁琐，且部分激光被狭缝光阑阻拦，能量利用率降低。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法，旨在解决现有技术中大量微乳液滴检测通量低的问题。
本发明提供了一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置，包括：光源整形模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源整形模块用于将圆形光整形为椭圆形光斑；光片生成模块用于根据椭圆形光斑生成片状光束；样品控制模块用于当片状光束照射在样品上时控制样品沿着与光轴垂直的方向运动；图像采集模块用于采集样品在运动时不同位置被激发出的荧光信号从而获得样品的三维图像序列。
更进一步地，所述光源整形模块包括：激光器、光纤准直器和扩束整形模块；所述光纤准直器用于对激光器出射的圆形光进行准直处理，所述扩束整形模块用于将经过准直后的圆形光整形为所述椭圆形光斑。
更进一步地，所述扩束整形模块包括：依次设置在光轴上的第一柱面镜、凸透镜和第二柱面镜，第一柱面镜的聚焦方向与第二柱面镜的聚焦方向呈90°。
更进一步地，所述椭圆形光斑的长、短轴分别为f2*d/f1和f3*d/f2；其中，f1，f2，f3，分别为所述第一柱面镜、所述凸透镜和所述第二柱面镜的焦距，d为入射光斑直径。
更进一步地，第一柱面镜的焦距f1为10mm～20mm，所述凸透镜的焦距f2为5mm～10mm，所述第二柱面镜的焦距f3为15mm～30mm。优选地，第一块柱面镜的焦距为12.7mm，第二块圆透镜的焦距为8mm，第三块柱面镜焦距为25mm。
更进一步地，所述凸透镜为圆透镜。
更进一步地，所述图像采集模块包括：依次设置在光轴上的物镜、管透镜、滤光片和相机，所述物镜探测到的荧光信号经所述管透镜聚焦到所述相机的传感器上形成图像；所述滤光片用于透过荧光波长的信号。
更进一步地，图像采集模块采用中高倍物镜加短焦管透镜组合，以实现无限远校正的大视野下高通光孔径的采集。所述物镜的放大倍率为4X-20X，所述管透镜的焦距为20mm-150mm。
作为本发明的另一个实施例，图像采集模块还可以采用短焦或微距镜头，如CanonEF 50mm f/1.8，Canon EF 35mm f/1.4L，Nikon 35mm f/1.8G ED，ZEISS Planar T*50mmf/2 ZM。
在本发明实施例中，可通过切换多波长激光器以及在采集端切换相应的滤光片进行多通道成像。另外，针对透明性欠佳的液滴，可以采用双侧光片照明激发。
本发明还提供了一种基于上述的光片荧光显微成像装置对透明化液滴进行成像检测的方法，包括下述步骤：
(1)配制包含油相和水相的透明化乳液，其中油相和水相的折射率匹配；
(2)将所述透明化乳液进行液滴化处理获得透明化液滴；
(3)通过将光片荧光显微成像装置中光片生成模块生成的片状光束照射在所述透明化液滴上，并控制所述透明化液滴沿着与光轴垂直的方向运动，从而采集所述透明化液滴在运动时不同位置被激发出的荧光信号，获得所述透明化液滴的三维图像序列。
更进一步地，步骤(1)中，油相和水相的折射率匹配具体是指油相和水相的折射率相同或相近。其中，折射率相近具体是指水相和油相的折射率差需在±0.1以内。优选地，水相和油相的折射率差为±0.01以内。
在步骤(2)和步骤(3)之间还有使透明化液滴进行生物化学反应的步骤，所述生物化学反应优选数字化反应，进一步优选数字链式酶反应。其中，使透明化液滴进行生物化学反应时，乳液中的水相配制为生物化学反应所需要的反应液，当进行数字链式酶反应时，乳液中的水相配制为数字链式酶反应所需要的反应液。
本发明采用两块正交的柱面镜夹一块圆透镜的结构代替现有技术的两个圆透镜作为扩束整形装置，能够在短光程下产生一种椭圆光，从而生成一种高而厚的光片，使光束形状更适于深层液滴原位封闭成像，装置整体长度更短，集成度更高，同时由于无需用狭缝阻拦激光，激光能量利用率提高了四倍以上。
本发明采用中高倍物镜加短焦管透镜组合作为图像采集模块，能够提升通光孔径，减少装置体积，或以短焦、微距镜头作为图像采集模块，能够增大视野，减少装置体积。
本发明提出利用光片进行液滴的扫描成像检测方法，利用片状光源照明和宽场采集，相较于传统串行检测方法，本发明可以进行并行化高通量检测。
由于扩束整形装置和图像采集模块的体积较现有技术都大大缩小，本发明装置体积小巧，尺寸控制在30cm×30cm×15cm以内；同时本装置可以实现液滴的无开盖原位封闭检测，操作简单，无污染。
附图说明
图1改变折射率增强剂的浓度，乳液液滴将呈现出不同的透明度。图中从左至右折射率增强剂的浓度增加，透明度先增大后减小，在合适浓度时最为透明(右三)。
图2为本发明的用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置示意图。
图3是光片荧光显微成像装置样品和夹持部分的局部放大图。
图4是现有的扩束整形装置与本发明的扩束整形装置示意图。
图5是现有的图像采集模块与本发明装置的图像采集模块的示意图。
图6利用本申请的装置对不同深度的液滴进行扫描检测。
图7透明化液滴数字链式酶反应单碱基突变检测结果图。
图8透明化液滴的荧光计数方法示意图。
在本发明实施例中相同的附图标记表示相同的物理量，其中11为激光光源，12为光纤，13为准直器，14为扩束整形装置，15为反射镜；2为柱面镜；31为样品，32为样品夹持，33为位移控制台，34为位移控制台驱动器；41为探测物镜，42为管透镜，43为滤光片，44为相机，311为装有样品的离心管，312为样品池，313为样品池底座。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明采用一种水相和油相折射率相同或相近的微乳液滴配方从而使微乳液滴透明化，使光线可以穿过浅层透明化液滴达到深层液滴，为深层次液滴的光学信号读取提供了前提。为高通量的读取透明化液滴的光学信号，本申请提供了一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置，通过对光学装置进行优化设计，产生一种高而厚的光片，能够实现深层液滴的原位封闭成像，具有通量高，无污染的优点。同时本装置在能实现上述功能的同时，体积小巧，操作简单，成本低。
本发明提供了一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置，包括：光源整形模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源整形模块用于将圆形光整形为椭圆形光斑；光片生成模块用于根据椭圆形光生成片状光束；样品控制模块用于当片状光束照射在样品上时控制样品沿着与光轴垂直的方向运动；图像采集模块用于采集样品在运动时不同位置被激发出的荧光信号从而获得样品的三维图像序列。
光源整形模块包括：激光器、光纤准直器和扩束整形模块，光纤准直器用于对激光器出射的圆形光进行准直处理，扩束整形模块用于将经过准直后的圆形光整形为椭圆形光斑；这种椭圆型光在无需狭缝阻拦的情况下，能够产生厚而高的光片，极大地提高了激光能量的利用率，适用于微乳液滴等大样品。
扩束整形模块包括：依次设置在光轴上的第一柱面镜、凸透镜和第二柱面镜，第一柱面镜的聚焦方向与第二柱面镜的聚焦方向呈90°；这种放置方式可以通过改变柱面镜的焦距去分别调节椭圆形光斑的长短轴。
其中，第一柱面镜、凸透镜、第二柱面镜的焦距依次为f1，f2，f3，入射光斑直径为d，生成长、短轴分别为f2*d/f1和f3*d/f2的椭圆形光斑。
作为本发明的一个实施例，为在不影响装置性能的前提下尽可能减小装置的尺寸，f1为10-20mm，f2为5-10mm，f3为15-30mm。优选地，第一柱面镜的焦距可以为12.7mm，凸透镜的焦距可以为8mm，第二柱面镜焦距可以为25mm。
其中，凸透镜可以为圆透镜。
在扩束整形装置中，两块柱面镜聚焦方向呈90度放置，产生一个椭圆形光斑。可根据对实际需求调整第一块透镜和第三块透镜的焦距，例如增大第一块透镜焦距可使短轴边短，增大第三块透镜可使长轴边长。假设三枚透镜焦距依次为f1，f2，f3，入射光斑直径为d，可以生成长短轴分别为f2*d/f1和f3*d/f2的光斑，形成长短轴之比为f1*f3/f22的椭圆光。优选的，例如针对无开盖液滴检测，大概需要产生一个约20μm厚10mm高的光片，可以选择使用第一块柱面镜的焦距为12.7mm，第二块圆透镜的焦距为8mm，第三块柱面镜焦距为25mm。现有的光片显微镜扩束整形装置常采用两种扩束手段，一种是采用两块圆透镜扩束，并用狭缝阻拦以调节光片厚度及视野，一种是Dodt等人(“Image enhancement inultramicroscopy by improved laser light sheets”，Saiedeh et al；《JBiophotonics》3，NO.10-11，686-695页)提出的采用凹透镜后接两枚正交放置的柱面镜的扩束整形装置。生成同样厚度的光片时，如20μm厚10mm高的光片，入射光在聚焦方向的尺寸约为2毫米，上述第一种扩束整形装置，若使用2毫米的光斑则光片高度不够，若使用大光斑则需要阻拦大量激光，本发明的装置能产生合适的光片并无需阻拦激光，能量利用率能够提高四倍以上。相较于上述第二种扩束整形方法，本发明的装置有以下优点：第一，本发明的装置更加灵活，可通过更换合适焦距的第一块透镜(柱面镜)或第三块透镜(柱面镜)获得不同形状的椭圆光束，满足不同需求；如采用f＝15mm的第一柱面镜，f＝10mm的圆透镜，f＝30mm的第二柱面镜时，可形成一个2.2mm*10mm的椭圆形光束(入射光直径3.3mm)，扩束整形装置长度65mm，最终可以形成20μm厚10mm高的光片，适用于液滴原位成像。第二，扩束装置体积小，如果采用Dodt的方法，当产生类似大小的椭圆形光束时，需采用f＝20mm的圆透镜，f＝15mm和f＝60mm的柱面镜，可以形成2.5mm*10mm的椭圆形光斑，但扩束整形装置整体长度为80mm，可见本发明装置缩小了扩束整形装置的体积。
在本发明实施例中，光片生成模块包括：依次设置在光轴上的反射镜和第三柱面镜，反射镜将椭圆形光反射至第三柱面镜上并在第三柱面镜的焦点处形成片状光束。
在本发明实施例中，样品控制模块包括：三维位移台及其控制器，样片夹持器和样品池。将样品放置在上述装置的夹持器中，样品下端浸没在充满折射率匹配液的样品池中；调节液滴位置使光片照射在液滴上，位移台带动液滴扫描，同时相机连续记录不同位置的图像，得到一系列图像。通过算法或软件可以液滴进行三维重构，实现计数及定位。
作为本发明的一个实施例，样品通过夹持器固定在位移控制台上，夹持器可直接兼容装有透明液滴的容器，例如离心管，装有透明液滴的容器下端装有透明液滴的部分浸没在装有折射率匹配液的容器中，以实现无开盖检测。容器下端装有透明液滴的部分浸没在装有折射率匹配液(如水，甘油等)的样品池中。对于数字PCR计数，还需要维持一定的温度，可采用电热器、半导体制冷片等制热或者制冷办法，或循环冷却或者循环加热等保温办法是样品维持一定的温度。夹持器固定在三维位移台上，通过控制位移台带动样品的扫描。
在本发明实施例中，图像采集模块包括：依次设置在光轴上的物镜、管透镜、滤光片和相机，物镜的放大倍率可以为4X-20X，管透镜的焦距可以为20mm-150mm。物镜探测到的荧光信号，经管透镜聚焦到相机传感器上，记录形成图像。滤光片能够透过荧光波长附近信号，阻拦非荧光波段信号。
作为本发明的一个实施例，可以采用100mm焦距的管透镜；物镜与管透镜之间的距离为0-100mm，管透镜与相机之间的距离为60mm物镜。
本发明实施例中，图像采集模块采用中高倍物镜加短焦管透镜组合，以实现无限远校正的大视野下高通光孔径的采集。其中，短焦管透镜的焦距可以为20mm-150mm，中高倍物镜的放大倍率可以为4X-20X，优选4X。实际的放大倍率是由管透镜焦距和物镜焦距之比决定的，比如4X镜的焦距是50mm，配200mm标准管透镜放大倍率就是四倍，配100mm短焦管透镜则放大倍率等效为2倍。在观察同样大小的样品时，现有的图像采集模块通常使用放大倍率为2X的物镜与200mm焦距管透镜的组合来实现无限远校正成像。例如，采用4X/0.13物镜和f＝100mm的管透镜时，实际放大倍率为2，相较于标准的2X/0.06物镜和f＝200mm的管透镜，本发明装置可以提升五倍的进光量，有利于采集大视野下的弱信号，同时整个探测部分装置的长度能够减小16cm及以上。本发明在同等放大倍率下，能提升物镜的通光孔径，增大视野，减小装置的体积。可选地，可使用更高倍率的物镜和更短焦距的管透镜，能够实现更大的通光孔径和进一步减小尺寸。但不建议使用特高倍物镜和特别短焦管透镜组合形式，特高倍物镜工作距离短，大视场下边缘畸变明显。
作为本发明的一个实施例，图像采集模块还可采用短焦或微距镜头(如Canon EF50mm f/1.8，Canon EF 35mm f/1.4L，Nikon 35mm f/1.8G ED，ZEISS Planar T*50mm f/2ZM等)代替物镜-透镜构成有限远校正系统，能够增大视野，减小装置体积和系统复杂度。使用微距镜头时光片荧光显微成像装置与市售光片荧光显微成像装置的视野大小等数据对比如下表一所示：
表一
光片荧光显微成像装置可适用于多通道成像，只需切换多波长激光器以及在采集端切换相应的滤光片。
在本发明实施例中，针对透明性欠佳的液滴，可在光片荧光显微成像装置上采用双侧光片照明激发，横向有效穿透能够提升一倍，轴向穿透深度提升也比较明显。具体地，采用两面柱面镜对射式照明，实施中需要两束光片精准对齐。
本发明还提供了一种利用光片荧光显微成像装置对透明化液滴进行成像检测的方法，包含如下步骤：(1)配制包含油相和水相的透明化乳液，其中油相和水相的折射率匹配；(2)将乳液液滴化得到透明化液滴；(3)利用光片荧光显微成像装置对透明化液滴进行检测。通过对油相和水相折射率的匹配，得到透明化的微乳液滴，可以实现深层液滴的成像及检测。将装有微乳液滴的离心管放置在上述装置的夹持器中，调节液滴位置使光片照射在液滴上，位移台带动液滴扫描，同时相机连续记录不同位置的图像，得到一系列图像。通过算法或软件可以液滴进行三维重构，实现计数及定位。
为了能够实现微乳液滴的原位封闭成像和计数，需要能够获取深层液滴图像信号的方法。采取的策略是让微乳液滴透明化，使光线可以穿过浅层透明液滴达到深层液滴，为深层次液滴的光学信号读取提供了前提。
透明化乳液包含水相和油相，水相占乳液体积的5％－90％，优选10％－30％，水相中添加折射率增强剂，油相中添加表面活性剂，水相和油相的折射率相同或相近，以保证产生的微乳液滴透明。
其中，折射率相近具体是指水相和油相的折射率差需在±0.1以内，优选±0.01以内。
本发明实施例中，将透明化乳液液滴化的方法可以是震荡乳化，微流T型流道液滴化或者如专利(申请号CN201610409019.0，公开号CN106076443A)中描述的离心液滴乳化的办法，用该方法可获得直径可调、均一性良好的液滴。
在本发明实施例中，利用光片荧光显微成像装置对透明化液滴进行检测具体包括：对乳液进行三维扫描，实现乳液所在空间的三维信息，最后将这些图像三维重建并计算其中荧光液滴的数目。此装置可以实现液滴的高速扫描，达到高通量检测的目的，可用于数字链式酶反应检测，细胞检测等。利用光片荧光显微成像装置得到了乳液中的各平面荧光图像信号后，则需要将此图片信号进行处理。得到的信号可以是终点的单次读取信号，也可以是时间序列中多次信号。对于数字式定量检测等终点信号读取的情况，目的是要从信号中得到荧光液滴的数目；对于长时间的观察，如乳液液滴内的细胞、细菌运动情况或者增殖数目的监测等，要得到时间序列上的信号。
图片信号的处理过程主要分为去噪和计数两步骤。利用Matlab编写程序，经过光场校正，三维液滴重构，高斯滤波和平滑，腐蚀和信号增强，局部极值点计算等步骤得到透明乳液中荧光液滴的数目。其中去噪办法可以是邻域平均法、中值滤波、高斯滤波、傅里叶滤波，最优阈值分割法等单独使用或者组合。计数的办法中可以使用局部极值，连通域等原理对荧光液滴进行定位和计数。
在本发明实施例中，步骤(2)和步骤(3)之间还有使透明化液滴进行生物化学反应的步骤，生物化学反应。作为本发明的一个实施例，生物化学反应优选数字化反应。进一步优选数字链式酶反应。
在本发明实施例中，使透明化液滴进行生物化学反应时，乳液中的水相配制为生物化学反应所需要的反应液，当进行数字链式酶反应时，乳液中的水相配制为数字链式酶反应所需要的反应液。
本发明采用两块正交的柱面镜夹一块圆透镜的结构代替现有技术的两个圆透镜作为扩束整形装置，能够在短光程下产生一种椭圆光，从而生成一种高而厚的光片，使光束形状更适于深层液滴原位封闭成像，装置整体长度更短，集成度更高，同时由于无需用狭缝阻拦激光，激光能量利用率提高了四倍以上。
本发明采用中高倍物镜加短焦管透镜组合作为图像采集模块，能够提升通光孔径，减少装置体积，或以短焦、微距镜头作为图像采集模块，能够增大视野，减少装置体积。
由于扩束整形装置和图像采集模块的体积较现有技术都大大缩小，本发明装置体积小巧，尺寸控制在30cm×30cm×15cm以内；同时本装置可以实现液滴的无开盖原位封闭检测，操作简单，无污染。
本发明实施例中针对透明化液滴的制备，为选择合适的折射率增强剂浓度，将Gelest DMS-T01.5硅油与表面活性剂Dow Corning ES5612，按照质量比19:1配制，混合均匀后在20，000rcf条件下离心10分钟，得到上层清液用于下一步的乳化油。水相中甜菜碱为折射率增强剂，每个样本水相体积为20μL，体系中加入240μL上述配制好的油，图1由左至右示出了分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0摩尔每升折射率增强剂的情况。由图1可见随着折射率增强剂的浓度增加，透明度先增大后减小，在折射率增强剂的浓度为3.0摩尔每升时最为透明(右三)。
图2示出了本发明实施例提供的光片荧光显微成像装置总体结构，图3示出了光片荧光显微成像装置样品和夹持部分的局部放大图，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关的部分，现结合附图详述如下：
光片荧光显微成像装置包括：激光光源11产生的激光经光纤12传输到准直器13，后经扩束整形装置14扩束整形成椭圆光，经反射镜15反射到柱面镜2上，在柱面镜2的焦点处形成光片；光片照射在样品31上，样品通过样品夹持器32固定在位移控制台33上，通过位移控制台驱动器34控制位移台进行扫描；激发的信号经过物镜41探测，管透镜42聚焦到相机44上，相机前会放置滤光片43以滤除杂散光。其中311为装有样品的离心管，312为样品池，313为样品池底座。
图4示出了现有的扩束整形装置(左图)与本发明的扩束整形装置(右图)的结构，其中左图为现有的扩束整形装置，采用两个圆透镜，右图为本发明的扩束整形装置，由左至右依次为第一柱面镜、圆透镜和第二柱面镜。扩束整形装置的柱面镜-圆透镜-柱面镜的焦距分别为12.7mm，8mm，25mm。激光光源发出的光经过光纤传输并通过准直器后形成3.3mm的光斑，经光源及其调节装置的扩束整形，可形成2mm*10mm的椭圆形光斑。
在本发明实施例中，图像采集模块可以采用4X/0.13的物镜和f＝100mm的管透镜，可实现2X的大视野，相较于标准的2X物镜和f＝200的管透镜，有效进光量提升五倍以上，尺寸减小16cm及以上。整个装置三维尺寸控制在30cm×30cm×15cm，重量在5kg以内，小巧轻便，如图2和图5。
本发明中图像采集模块的另一种实施方式可以采用短焦或微距镜头(如Canon EF50mm f/1.8)构成有限远校正系统。
在本发明实施例中，可以采用两块正交的柱面镜夹一块非球面镜组成的扩束装置，柱面镜-圆透镜-柱面镜焦距分别为12.7mm，8mm，25mm，可以产生一个20μm厚，10mm高的光片；采用4X/0.13的物镜和f＝100mm的管透镜组合方式作为图像采集模块。将GelestDMS-T01.5硅油与表面活性剂Dow Corning ES5612，按照质量比19:1配制，混合均匀后在20，000rcf条件下离心10分钟，得到上层清液用于下一步的乳化油。水相中甜菜碱为折射率增强剂，水相体积为20μL，体系中加入240μL上述配制好的油，加入3.15摩尔每升折射率增强剂，并加入带有绿色荧光染料，制得透明化乳液。使用CN106076443A中的方法对透明化乳液进行离心液滴乳化，所用孔板孔数37，转速15，000rcf，时间4分钟，以产生大量直径约41μm的微乳液滴。用本装置进行扫描成像，激光器激发波长488nm，扫描步长为5μm，帧率为100FPS。图6是选取不同深度的液滴成像效果图，1～12表示不同深度的激发平面的荧光图像，间隔200μm。可以看到，本装置对深层液滴也能进行清晰成像。
本发明实施例中包含透明化微乳液滴的数字链式酶反应，反应结束后对微乳液滴进行光片扫描成像检测。
利用MGB(Applied BiosystemTM)探针检测基因组单碱基突变。单碱基突变中仅有一个碱基的差别，是核酸检测中要求最高的。在所测志愿者的基因组在8号染色体上存在一个突变，其SNP号为rs10092491，突变序列为ATTCCAGATAGAGCTAAAACTGAAG[C/T]TTTCCTTATAGAGATTTATCCTAGT。
1、检测用的引物和探针：
将上述寡核苷酸按照上表第三列中的浓度配制成20X混合液。
2、配制链式酶反应液：
*均由产品中附带。
3、乳化油配制：
将Gelest DMS-T01.5硅油与表面活性剂Dow Corning 5612，按照质量比19:1配制，混合均匀后在20，000rcf条件下离心10分钟，得到上层清液用于下一步的乳化油。
4、离心液滴生成：
采用专利(申请号CN201610409019.0)所述的方法生成液滴。采用37孔，6μm的微通道阵列孔板，向微通道阵列板和收集装置的配合物中加入15μl配制好的链式酶反应液，收集装置为200μL PCR管，在PCR管中盛有240μL上述乳化油，离心速度15，000rcf，离心时间4分钟，生成60万个直径为41微米的透明化液滴。
5、热循环：
将上述液滴置于热循环仪中，按下表中程序加热。
经计算，链式酶反应液待检测样品DNA的数量符合预期。液滴大小为41μm，总计数目6.0*10^5个。投入DNA分子数目利用商业数字PCR定量后约为1.26x 10^4，本发明的检测方法中得到约1.23^4个荧光液滴，符合泊松分布预期。
热循环反应结束后使用与实施例6相同的装置进行检测。对透明化液滴采用多个波长的照明激光进行多通道检测，每个荧光通道设置扫描400张，两个通道800张图片，扫描时常4s每通道，加上转换时长两秒，共计耗时10s。图7(1)是信号的叠加的结果，图7(2)和图7(3)是同一样品的同一片面的荧光图像，其中图7(2)是488nm通道的荧光信号，图7(3)是532nm的荧光信号。可以看出，(2)和(3)中亮点的位置是不同的，表明该方法可以有效的区分同一位点的两个不同碱基。
在本发明实施例中，对采集到的多帧图像进行数据处理可以实现三维重构，实现液滴的三维定位及计数。如图8所示，其中1是三维液滴重构，2高斯滤波去噪，3腐蚀，增强信号，4局部极值或连通域计算亮点数目。
本发明采用两块正交的柱面镜夹一块圆透镜的结构代替现有技术的两个圆透镜作为扩束整形装置，能够在短光程下产生一种椭圆光，从而生成一种高而厚的光片，使光束形状更适于深层液滴原位封闭成像，装置整体长度更短，集成度更高，同时由于无需用狭缝阻拦激光，激光能量利用率提高了四倍以上。
采集部分采用中高倍物镜加短焦管透镜组合，能够提升通光孔径，减少装置体积，或以短焦、微距镜头作为图像采集模块，能够增大视野，减少装置体积。
由于扩束整形装置和图像采集模块的体积较现有技术都大大缩小，本发明装置体积小巧，尺寸控制在30cm×30cm×15cm以内；同时本装置可以实现液滴的无开盖原位封闭检测，操作简单，无污染。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置，其特征在于，包括：光源整形模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源整形模块用于将圆形光整形为椭圆形光斑；光片生成模块用于根据椭圆形光斑生成片状光束；样品控制模块用于当片状光束照射在样品上时控制样品沿着与光轴垂直的方向运动；图像采集模块用于采集样品在运动时不同位置被激发出的荧光信号从而获得样品的三维图像序列。
2.如权利要求1所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述光源整形模块包括：激光器、光纤准直器和扩束整形模块；
所述光纤准直器用于对激光器出射的圆形光进行准直处理，所述扩束整形模块用于将经过准直后的圆形光整形为所述椭圆形光斑。
3.如权利要求2所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述扩束整形模块包括：依次设置在光轴上的第一柱面镜、凸透镜和第二柱面镜，第一柱面镜的聚焦方向与第二柱面镜的聚焦方向呈90°。
4.如权利要求1-3任一项所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述椭圆形光斑的长、短轴分别为f2*d/f1和f3*d/f2；
其中，f1，f2，f3，分别为所述第一柱面镜、所述凸透镜和所述第二柱面镜的焦距，d为入射光斑直径。
5.如权利要求4所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，第一柱面镜的焦距f1为10mm～20mm，所述凸透镜的焦距f2为5mm～10mm，所述第二柱面镜的焦距f3为15mm～30mm。
6.如权利要求3-5任一项所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述凸透镜为圆透镜。
7.如权利要求1-6任一项所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述图像采集模块包括：依次设置在光轴上的物镜、管透镜、滤光片和相机，所述物镜探测到的荧光信号经所述管透镜聚焦到所述相机的传感器上形成图像；所述滤光片用于透过荧光波长的信号。
8.如权利要求7所述的光片荧光显微成像装置，其特征在于，所述物镜的放大倍率为4X-20X，所述管透镜的焦距为20mm-150mm。
9.一种基于权利要求1-8任一项所述的光片荧光显微成像装置对透明化液滴进行成像检测的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)配制包含油相和水相的透明化乳液，其中油相和水相的折射率匹配；
(2)将所述透明化乳液进行液滴化处理获得透明化液滴；
(3)通过将光片荧光显微成像装置中光片生成模块生成的片状光束照射在所述透明化液滴上，并控制所述透明化液滴沿着与光轴垂直的方向运动，从而采集所述透明化液滴在运动时不同位置被激发出的荧光信号，获得所述透明化液滴的三维图像序列。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，油相和水相的折射率匹配具体是指油相和水相的折射率相同或相近。
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