CN109870441A - 基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法和装置，将准直的激光改变为横截面为椭圆形的平行光，椭圆形光斑入射到空间光调制器上后取空间光调制器的正负一级衍射光，两路光分别通过透镜后会聚到光阑，每束光在通过光阑之后被分割为若干的长条形光斑，两路光分别从物镜出射后在探测物镜的焦平面处进行干涉激发样品得到荧光，收集荧光信号得到结构光照明下的一幅二维图像；利用振镜改变结构光的方向，利用空间光调制器改变两路结构光之间的相位差，在二维平面上得到多张结构光照明下的图像；之后用另外一个方向的振镜进行扫描，结合探测物镜压电的移动对三维物镜进行成像，得到超分辨率的三维光片照明图像。

Description

基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法和装置

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，具体地说，涉及一种基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法和装置。

背景技术

十六世纪末期，世界上首个光学显微镜诞生，它极大地拓展了人们对微观世界的认识，在之后的几个世纪里，光学显微镜被不断地改进，成像速度、分辨率、灵敏度等方面都得到了长足的发展，在生物成像领域发挥着越来越重要的作用。而随着生物技术的高速发展，需要对生理过程具有更加深刻的理解，这也对3D实时成像技术提出了更高的要求。但是，3D实时成像技术的发展，也面临着许多挑战——成功的3D实时成像技术，需要同时达到高空间分辨率、高成像速度、良好的光切片能力、低光损伤和光漂白能力。

目前已经有了许多3D实时成像的技术，比如宽场显微技术、共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、以及光切片荧光显微技术。其中，光切片荧光显微技术，由于其高速、低光漂白性和成像的无创性等优势，在这几年里得到了极其迅速的发展。

由于光切片荧光显微技术的无创性，它的在生物成像领域具有十分重要的地位。如公开号为CN108680544A的一种结构化照明的光切片荧光显微成像方法和系统，包括光源、承载荧光样品的样品台和检测荧光样品发出荧光的检测系统；光源和样品台间设有沿光路依次布置的：将光束变为径向偏振光的偏振片和径向偏振转换器；对径向偏振光进行相位调制的相位掩模板；对调制后的光束进行衍射的衍射光栅；以及移动荧光样品上照明图案的振镜；由振镜出射的光束从Y向照射到荧光样品上，检测系统从Z向收集荧光；还包括一处理器，控制振镜从X向移动照明的照明图案和控制样品台在Z向移动，并对检测系统收集的光强分布图像进行处理和重构，生成样品的三维图像。以及公开号为CN108956562A的一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置，包括沿光路依次布置的激光器、柱面镜和承载有荧光样品的样品台，以及收集荧光样品发出荧光的检测系统；检测系统包括第一检测器、分束器、第二检测器和第三检测器，还包括与检测系统和样品台连接的处理器，控制样品台以固定的步长沿Z轴移动，并对荧光图像I和荧光图像I进行比较，得到图中各个部分荧光在Z轴的位置信息，根据位置信息，对荧光图像I中的荧光信息进行重新定位和三维重构，得到荧光样品的三维成像结果。

但是，由于光切片荧光显微技术的宽场接收方式，得到图片的横向分辨率较低，使用结构光照明可以提高图像的分辨率，之前的双物镜光切片结构光显微成像方法由于光片显微镜的内在结构特点，只能在至多两个方向实现超分辨成像效果。

本发明解决了传统光片照明显微镜只能在两个方向上实现超分辨成像的问题，使用三个物镜，在三维实现超分辨成像效果；在系统中使用空间光调制器可用于结构光的移相，可以实现高速结构光照明成像，使用振镜产生不同方向的结构光。综上所述，本发明可以通过三个物镜，使用振镜和空间光调制器进行三维超分辨的高速成像。

发明内容

本发明的目的为提供一种实现上述方法的光切片荧光显微成像装置，该装置可用于实现的方法，该装置将激光平行入射四片柱面镜，通过柱面镜将本来的圆形光斑变成椭圆形，椭圆形光斑入射到空间光调制器上后取空间光调制器的正负一级衍射光，两路光分别通过透镜后会聚到光阑，每束光在通过光阑之后被分割为四个小的长条形光斑，通过两个垂直方向摆动的透镜后在物镜的后焦面上会聚，两路光分别从物镜出射后在探测物镜的焦平面处进行干涉，干涉的激光激发得到荧光，经过探测物镜，滤光片，场镜进入SCMOS，得到结构光照明下的一幅二维图像。利用振镜改变结构光的方向，利用空间光调制器改变两路结构光之间的相位差，在二维平面上得到九张结构光照明下的图像。之后用另外一个方向的振镜进行扫描，结合探测物镜压电的移动对三维物镜进行成像，得到超分辨率的三维光片照明图像。

为了实现上述目的，本发明提供的一种基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，包括以下步骤：

1)将激光准直后入射到两组，每组两片柱面镜上，出射得到一个横截面为椭圆形的平行光；

2)平行光入射到空间光调制器上，由于衍射效应，取衍射光中的正负一级光，分别进入各自的支路；

3)两路衍射光分别经过透镜会聚，入射到经过设计的光阑面上，光阑将入射的椭圆形光斑分为四部分小的长条形光斑；

4)经过光阑的光继续传播，分别经过与物面共轭和与物镜后焦面共轭的不同方向的振镜后会聚在物镜的后焦面；

5)会聚在物镜后焦面的光斑经过物镜后在探测物镜焦平面处进行干涉；

6)经过干涉的空间结构光对样品进行激发，产生荧光，荧光经过探测物镜，滤光片和场镜之后，进入SCMOS，得到图像；

7)在模式一中，利用衍射光进行照明，即只用一个激发物镜中出射的四个光片形成的空间结构光进行照明，每幅SCMOS中得到的图像即为二维平面的图像。转动探测物镜轴向方向的振镜，与探测物镜的压电相配合，对样品的不同二维平面进行拍摄，得到物体的三维图像；

8)在模式二中，利用两路衍射光同时照明，即用两个物镜出射的八个光片干涉形成的空间结构光进行照明，通过另一个振镜的转动改变条纹方向，通过空间光调制器上图案的改变变化两个物镜出射光片的相位差，在同一个二维平面上得到九张结构光照明的图像，用九张结构光照明下的图像重构出二维平面上的超分辨图像。之后转动探测物镜轴向方向的振镜，与探测物镜的压电相配合，对样品的不同二维平面进行拍摄，得到物体的三维图像。

作为优选的，采集所述的荧光信号时，每个曝光时间内，空间光调制器上调制的图案不同，对应得到一个方向的结构光；所述的空间光调制器具有N个方向的图案，每个方向进行M次相位移动，在每个二维平面得到对应的N*M张图像。

本技术方案中，步骤2)在每个曝光时间内，空间光调制器上调制的图案是不同的，在一个CCD的曝光时间内，会得到一个方向的结构光；空间光调制器上调制的图案分别沿三个方向，在每个方向上进行三次相位移动，得到不同的图案，在三个方向上各得到三张图片，在每个平面上均得到九张图片；步骤7)中，会得到一个样品的三维图像，三维图像的轴向由于激发光的干涉以及高数值孔径探测物镜的作用，得到图像的轴向分辨率会比普通光片照明显微镜的轴向分辨率更高；步骤4)中，会得到一个在横向具有超分辨效果，在轴向分辨率高于普通光片照明显微镜结构的样品三维图像。

具体的方案为步骤1)中，在每个x方向需要在空间光调制器上调制三个方向条纹的图案，每个方向条纹有三张图片，相邻图像之间条纹的周期相差三分之二个条纹周期。

所述衍射光通过光阑分为若干长条形光斑。另一个具体的方案是，在步骤3)中的光阑是固定形状的，光阑的作用一方面是将椭圆横截面的平行光分割为四束小(或者更多束)的平行光，另一方面也可以拦截空间光调制器可能产生的除正负一级之外的杂散光。

另一个具体的方案是，在步骤8)和步骤9)中用于改变激发光轴向位置，进而实现三维扫描的振镜是与激发物镜的后焦面共轭的，在步骤9)中用于改变干涉条纹方向的振镜是与激发物镜的前焦面共轭的，在整个系统中，也是与空间光调制器所共轭的。

为了实现上述另一目的，本发明提供的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，包括形成光切片的照明系统、承载荧光样品的样品台、检测荧光样品发出荧光的检测系统和一处理器，照明系统包括沿光路依次布置的：激光器，准直透镜，用于改变平行光束横截面的两组柱面镜，空间光调制器，透镜，用于三维扫描的振镜，透镜，用于改变条纹方向的振镜，一组透镜，激发物镜；处理器用于改变空间光调制器上的图案，并对检测系统收集的多幅二维光强信号图像进行重构，得到荧光样品的三维超分辨成像信息。

另一个具体的方案为，检测系统包括依次布置的检测物镜、滤光片、管透镜和CCD相机。其中，检测物镜用于收集荧光样品被激发出的荧光，滤光片用于滤除杂散光，管透镜用于将荧光聚焦到SCMOS上，SCMOS用于记录感光面上的荧光信号，并将荧光信号传递给处理器。

本发明的原理如下：

传统的光切片荧光显微技术中，使用激发物镜形成光片，光片与激发物镜中轴平行，所以利用单个透镜很难对光片在激发物镜的轴向方向进行强度的调制，所以传统的光切片荧光显微技术中很难对横向进行三个方向的超分辨成像，从而得到探测物镜横向的超分辨率图像。

在本发明中，通过两个物镜出射的片状光之间的干涉，在探测物镜的横向平面上形成了正弦条纹的结构光，利用结构光照明的方法使得光片照明显微镜横向分辨率大幅提高，在探测物镜的轴向方向，利用多个小光束的干涉以及高数值孔径探测物镜的作用，使得成像的轴向分辨率也高于普通的光片照明显微镜

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明极大地提高了光切片荧光显微技术的三维成像分辨率，解决了普通光片照明显微镜只能在一个横向方向提高分辨率的问题，本发明装置可以实现最大速率的三维低光损伤成像，并且在本发明提出的光片照明显微镜中首次使用了三个物镜相互垂直的激发探测方式，使得样品可以放置在传统的载玻片上进行观察。

附图说明

图1为本发明一种基于振镜和空间光调制器的三物镜双模式三维超分辨光切片荧光显微成像装置的示意图；

图2为空间光调制器上所加相位图的示意图；

图3为光阑形状的示意图，其中白色为通光部分，黑色为拦光部分；

图4为模式二中XY平面不同方向激发光的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

装置实施例

参见图1，本实施例的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像装置包括，激光器1，准直透镜2，第一柱面透镜组(柱面透镜3、柱面透镜4)，第二柱面透镜组(柱面透镜5、柱面透镜6)，半玻片7，空间光调制器8，凸透镜9，凸透镜10，光阑11，光阑12，凸透镜13，凸透镜14，单轴振镜15，单轴振镜16，凸透镜17，凸透镜18，单轴振镜19，单轴振镜20，一组凸透镜(凸透镜21，凸透镜23)和(凸透镜22，凸透镜24)，照明物镜25，照明物镜26，样品台27，检测物镜28，滤光片29，管透镜30，SCMOS相机31和计算机32。

本发明的装置实施例可以分为四个部分：产生照明光切片的照明系统、承载样品的样品台27、检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器，本实施例的处理器为计算机32。

其中，照明系统包括沿光路依次布置的：激光器1，准直透镜2，第一柱面透镜组(柱面透镜3、柱面透镜4)，第二柱面透镜组(柱面透镜5、柱面透镜6)，半波片7，空间光调制器8，凸透镜9，凸透镜10，光阑11，光阑12，凸透镜13，凸透镜14，单轴振镜15，单轴振镜16，凸透镜17，凸透镜18，单轴振镜19，单轴振镜20，一组凸透镜(凸透镜21，凸透镜23)和(凸透镜22，凸透镜24)，照明物镜25，照明物镜26。

激光器1发出激光；准直透镜2对激光进行扩束准直；第一柱面镜组和第二柱面镜组的作用使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，具体的大小需要与空间光调制器的尺寸相匹配，通过半波片7将光束的偏振调整为空间光调制器8调制效率最高的方向。空间光调制器上施加0和pi相位交替排列的相位图案，图案如图2所示，将平行光束衍射，取衍射光的正负一级。衍射光经过凸透镜9，凸透镜10分别会聚到光阑11、光阑12上。光阑11和光阑12相同，具体形状如图3所示，光阑将衍射光分割为4个小的长条形光束，并拦去空间光调制器的杂散光。经过光阑的光经过透镜13、透镜14会聚到振镜15、振镜16上，经过振镜15、振镜16的反射，光束经过透镜17、透镜18的会聚，入射到振镜19、振镜20上，之后经过一组凸透镜(凸透镜21，凸透镜23)和(凸透镜22，凸透镜24)后入射进入照明物镜25和照明物镜26。照明物镜25和照明物镜26将激发光束投射到荧光样品上。

承载样品的样品台27能够被计算机32控制沿着Z轴方向以固定的步长移动。

检测系统包括沿Z轴方向依次布置的：检测物镜28，滤光片29，管透镜30和SCMOS31。

检测物镜28用于收集荧光样品被激光激发发出的荧光；滤光片29用于滤除收集得到的杂散光；管透镜30用于将收集到的荧光聚集到SCMOS31上；SCMOS31用于记录荧光信号，并将信号传递到计算机32上。

计算机32一方面对SCMOS31记录的多幅二维荧光信号进行重构，重构出三维的荧光样品的成像结果；另一方面控制压电改变检测物镜28的轴向位置，使其以固定的步长沿着Z轴移动，再一方面控制振镜19和振镜20，使得光片干涉的轴向位置改变，光片的位置与压电的伸缩量保持一致，使得探测物镜对光片位置始终聚焦；除此之外，计算机还对空间光调制器8和振镜15和振镜16进行控制，在模式二中，每一个二维平面上，改变振镜15和振镜16的位置三次，在每个振镜的位置，改变空间光调制器的图案三次，共拍摄九幅图，在计算机32中重构出一幅超分辨的二维图像。

采用上述装置对荧光样品进行三维成像的过程如下：

激光器1中发出的激光光束，经过扩束透镜2被扩束准直之后，第一柱面镜组和第二柱面镜组的作用使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，具体的大小需要与空间光调制器的尺寸相匹配，通过半波片7将光束的偏振调整为空间光调制器8调制效率最高的方向。空间光调制器上施加0和pi相位交替排列的相位图案，图案如图2所示，将平行光束衍射，取衍射光的正负一级。衍射光经过凸透镜9和凸透镜10会聚到光阑11和光阑12上。光阑11和光阑12相同，具体形状如图3所示，光阑将衍射光分割为4个小的长条形光束，并拦去空间光调制器的杂散光。经过光阑的光经过凸透镜13和凸透镜14会聚到振镜15和振镜16上，经过振镜15和振镜16的反射，光束经过透镜17、透镜18的会聚，入射到振镜19、振镜20上，之后经过一组凸透镜(凸透镜21，凸透镜23)和(凸透镜22，凸透镜24)后入射进入照明物镜25和照明物镜26。

模式一中光束干涉的结果(干涉光束只从一个激发物镜中产生)在二维平面上光强仍是均匀的，模式二中光束干涉的结果(干涉光束从两个激发物镜中产生，互相干涉)在二维平面上产生不同方向的正弦条纹，如图4所示。其中正弦条纹不同方向的改变通过振镜15和振镜16的摆动进行实现，在每一个振镜的位置下，可以通过改变空间光调制器8上的图案，使得条纹按照垂直条纹方向进行已知相位的移动。

荧光样品被上述光切片激发，发出荧光，被检测物镜28收集，再经过滤光片29滤光，然后被管透镜30聚焦到SCMOS31上，SCMOS31将记录的二维荧光信号传递到计算机32上。

计算机32一方面控制压电改变检测物镜28的轴向位置，使其以固定的步长沿着Z轴移动，再一方面控制振镜19和振镜20，使得光片干涉的轴向位置改变，光片的位置与压电的伸缩量保持一致，使得探测物镜对光片位置始终聚焦，在每个轴向位置都得到一幅具有荧光样品二维信号的图像。将多幅图像重建，得到样品的三维成像结果。

方法实施例

本实施例的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法基于上述装置实施例中的光切片荧光显微成像装置实现，其包括以下步骤：

1)激光经过光束变换和光阑的作用后，在物镜后焦面上形成几个长条形的小光斑，经过物镜之后，在探测物镜焦平面xy平面处进行干涉，在模式一中二维平面上得到均匀强度的激发光，在模式二中得到正弦条纹强度分布的激发光；

2)沿着Z轴方向，收集荧光样品发出的荧光，得到样品在该轴向位置的二维的光强信号图像。

包括两种工作模式：在模式一中，利用单路衍射光照明样品，从物镜出射的激发光直接对样品进行成像得到的图像即为样品二维平面上的图像；在模式二中，利用两路衍射光同时照明样品，通过振镜和空间光调制器的配合使用得到九张结构光照明下的二维图像，通过结构光照明的重构算法将九张图像重构为一张超分辨二维图像，作为样品最终的此二维平面上的图像；

3)使用振镜沿着Z轴方向扫描光束(在模式一中只需要一个振镜进行扫描，在模式二中需要两个振镜同步进行扫描)，得到多幅二维光强信号图像，对多福二维光强信号图像进行三维重构，得到荧光样品的三维成像信息；

本实施例中，X轴方向是第一个激发物镜的光轴方向，Y轴方向是另一个激发物镜的光轴方向，Z轴方向是探测物镜的光轴方向。这三个方向，两两相互垂直，构成三维直角坐标系。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，其特征在于，包括：

1)将准直的激光改变为横截面为椭圆形的平行光，所述平行光入射到空间光调制器上，将平行光束衍射得到至少一路衍射光；

2)所述衍射光通过光阑分为若干长条形光斑，长条形光斑在样品表面发生干涉，形成空间结构光激发样品产生荧光；

3)收集产生的荧光信号，得到二维平面的图像；

4)沿光轴方向移动探测物镜，并改变干涉条纹的轴向位置，对样品的不同二维平面进行拍摄，得到物体的三维图像。

2.如权利要求1所述的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，其特征在于，准直后的激光依次通过第一柱面镜组和第二柱面镜组，使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，形成椭圆形的平行光。

3.如权利要求1所述的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，其特征在于，所述空间光调制器上施加0和pi相位交替排列的相位图案，将平行光束衍射，取衍射光的正负一级得到两路衍射光，利用其中一路衍射光照明样品或两路衍射光同时照明样品。

4.如权利要求3所述的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，其特征在于，利用两路衍射光同时照明样品时，两路衍射光的长条形光斑干涉形成的空间结构光进行照明，改变长条形光斑的条纹方向以及两路衍射光长条形光斑的相位差，在同一二维平面得到多张照明的图像，并用所述的多张照明的图像重构出二维平面上的超分辨图像。

5.如权利要求4所述的基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像方法，其特征在于，采集所述的荧光信号时，每个曝光时间内，空间光调制器上调制的图案不同，对应得到一个方向的结构光；

所述的空间光调制器具有N个方向的图案，每个方向进行M次相位移动，在每个二维平面得到对应的N*M张图像。

6.一种基于移频的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，其特征在于：包括形成光切片的照明系统、承载荧光样品的样品台、检测荧光样品发出荧光的检测系统和一处理器；

所述的照明系统沿光路依次布置的：激光器，用于改变平行光束横截面的两组柱面镜，用于将平行光衍射的空间光调制器，用于三维扫描的第一振镜和用于改变条纹方向的第二振镜；

所述的处理器用于改变空间光调制器上的图案，并对检测系统收集的多幅二维光强信号图像进行重构，得到荧光样品的三维超分辨成像信息。

7.如权利要求6所述的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，其特征在于：所述空间光调制器上施加0和pi相位交替排列的相位图案，将平行光束衍射，取衍射光的正负一级得到两路衍射光，利用其中一路衍射光照明样品或两路衍射光同时照明样品。

8.如权利要求7所述的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，其特征在于：每路衍射光的光路上分别依次布置有：将椭圆横截面的平行光分割为若干长条形光斑的光阑，用于三维扫描的第一振镜，用于改变条纹方向的第二振镜和照明物镜。

9.如权利要求1所述的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，其特征在于：所述的检测系统包括依次布置的：用于收集荧光样品被激发出的荧光检测物镜，用于滤除杂散光的滤光片和用于采集荧光信号的CCD相机。

10.如权利要求1所述的三维超分辨光切片荧光显微成像装置，其特征在于：所述的两组柱面镜包括第一柱面镜组和第二柱面镜组，使得圆形横截面的平行光束一个方向拉长，一个方向缩小，形成椭圆形的平行光。