CN206627440U - 一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统 - Google Patents
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Abstract
一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，属于荧光数字全息与超分辨率成像技术领域。经加载适当掩模结构的空间光调制器进行振幅调制后的激光进入显微物镜，在待成像样品上产生三维结构激发光。激发出的样品的荧光被显微物镜收集，经过二向色镜和成像系统后，再由空间光调制器进行衍射分光和相移，两束光在图像探测器所处位置处干涉形成全息图并被记录。将所记录的全息图在计算机中通过数值算法进行重构，对于样品内某一深度的结构，可分别获得超分辨率和光学断层的重构图像；利用数值算法将超分辨率和光学断层的重构像融合，可实现超分辨率光学断层成像；改变全息图的再现距离，可以实现样品不同内深度处结构的超分辨率光学断层三维成像。
Description
技术领域
本实用新型公开了一种基于结构照明和荧光数字全息术的超分辨率荧光数字全息断层显微三维成像系统，属于荧光数字全息与超分辨率成像技术领域。
背景技术
数字全息术作为一种干涉成像技术，能够实现相干照明样品图像的三维数值重建或定量相衬成像。数字全息显微技术已被广泛地应用于生物医学领域的具体研究中。在实际成像应用时，与传统的显微成像技术相比，数字全息显微术具有快速、实时、三维和高精度等优点。荧光数字全息术的出现，解决了传统数字全息术对照明光源相干性的依赖，将数字全息显微技术拓展至空间非相干成像领域。通过利用光的空间自相干特性，荧光数字全息技术中使用空间光调制器等器件对样品发出的光波进行分光和相移等操作，再利用图像采集器件记录全息图，通过计算机中的数值算法对全息图进行处理,最终可实现荧光样品不同深度处图像的三维重建。荧光数字全息术虽然具有三维成像能力，但样品内某一深度处的成像结果更容易受到来自样品其它深度发出荧光的影响，即光学断层成像能力较差。将荧光数字全息技术与共聚焦显微等技术结合，可以实现样品的高分辨率光学断层成像。然而，为了实现样品信息的三维重建，现有大多数类似研究中，依然需要对样品进行二维或三维扫描，系统的采集速度较慢。且共焦技术中照射到样品上的聚焦光斑具有较高的能量密度，容易导致荧光蛋白或染料的光漂白。
结构照明显微术是一种主要应用与宽场荧光显微领域的超分辨率成像技术。传统的结构照明显微术中，一般利用激光照明光栅或空间光调制器等器件，进而在样品上产生条纹状的强度周期分布激发光。激发出的荧光具有类似的周期性强度分布，而后通过成像系统和图像探测器探测该荧光信号，并结合数值算法在计算机中重构超分辨率的荧光样品图像。通过该方法获取的往往只是二维的超分辨率图像，缺乏样品的三维信息。通过结构光断层重建算法，可以从结构光显微获取的原始数据中重构样品的光学断层成像结果。但是，重建出的光学断层结果的分辨率至多等于衍射极限分辨率，即不能实现超分辨率成像。结合多光束干涉技术，可以产生三维结构的激发光照明样品。利用精密压电平移台对样品进行深度方向扫描并记录一系列样品不同深度处的荧光图像，对图像进行三维数值运算后能够实现荧光样品图像的三维超分辨率重构。但是，该方法的扫描过程耗时较长，记录的数据量较大，涉及的数值运算量大且耗时较长。因而不适合动态样品成像或样品内动态过程的观察。
为了解决上述局限，本发明将三维结构照明显微和荧光数字全息术相结合，公开了一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统。与现有的结构照明显微技术或荧光数字全息术相比，本发明提出的系统和方法能够实现荧光样品的宽场超分辨率光学断层三维成像。
实用新型内容
为了在现有结构照明显微中结合荧光数字全息技术，实现超分辨率的光学断层成像并提高成像速度，本实用新型提供了一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统。
为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：
本实用新型专利公开了一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，包括光路连接放置的激光器(1)、光纤(2)、准直透镜(3)、I空间光调制器(4)，第一透镜(5)、二向色镜(6)、第二透镜(7)、第三透镜(8)、反射镜(9)、显微物镜(10)、第四透镜(12)、样品(11)、分束棱镜(13)、II空间光调制器(14)、图像采集器(15)；其特征在于：激光器(1)发出的光经光纤(2)传导和准直透镜(3)准直后照明I空间光调制器(4)，I空间光调制器(4)反射光波经过第一透镜(5)汇聚后被二向色镜(6)反射，二向色镜(6)反射的光进而依次经过第二透镜(7)、第三透镜(8)后，再被反射镜(9)反射后进入显微物镜(10)，经过显微物镜(10)后的光波照射在样品(11)上，激发出的荧光被显微物镜(10)收集后被反射镜(9)反射，然后再依次通过第三透镜 (8)、第二透镜(7)、二向色镜(6)、第四透镜(12)和分束棱镜(13)后照射到II空间光调制器(14)上，II空间光调制器(14)反射的光再次被分束棱镜(13) 反射后照射到图像采集器(15)上，由图像采集器(15)记录光强分布；其中I 空间光调制器(4)、II空间光调制器(14)和图像采集器(15)均与计算机(16) 相连接。
其中，为了产生三维结构照明光，进一步优选，在计算机(16)中生成并于 I空间光调制器(4)上显示二值光栅；为了实现分光和相移进而实现全息图的记录，还在计算机(16)中生成并于II空间光调制器(14)上显示衍射分光相位掩膜图样。
显微物镜(10)为无限远焦物镜；I空间光调制器(4)处在显微物镜(10) 的后焦平面的共轭平面上，即I空间光调制器(4)至第一透镜(5)的轴向距离为第一透镜(5)的焦距，第一透镜(5)与第二透镜(7)的轴向距离为第一透镜(5)和第二透镜(7)焦距之和，第二透镜(7)至第三透镜(8)的轴向距离为第二透镜(7)至第三透镜(8)焦距之和，第三透镜(8)至显微物镜(10) 后焦平面的轴向距离为第三透镜(8)的焦距。
进一步II空间光调制器(14)为纯相位型空间光调制器，入射其表面的荧光应该先通过偏振片(附图1中未标出)形成线偏振光；且偏振片的偏振取向与II 空间光调制器(14)的偏振敏感轴之间夹角为45度。
在II空间光调制器(14)上加载的衍射分光相位掩膜经过计算机(16)中的数值运算生成，对应为某一确定焦距确定尺寸的正透镜的位相分布；衍射分光相位掩膜一般由三张彼此之间具有确定相移的位相分布图片构成。
所述图像采集器(15)的放置位置应该经过特殊选取，以最优化所记录全息图的质量；使用本实用新型系统(如附图1所示)进行实验时，先固定采集器(15) 的一个位置，在图像采集器(15)位置附近沿轴向前后移动图像采集器(15)，可以发现前后分别有两个轴向位置处可以获得荧光样品清晰的图像；将这两个轴向位置到II空间光调制器(14)的轴向距离分别记为d1和d2；则图像采集器(15) 的具体放置位置应该选取为：其距离II空间光调制器14的轴向距离为：2d1d2/(d1+ d2)。
超分辨率荧光数字全息断层显微成像方法，通过数值计算过程，对使用超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统所获取的图像进行处理，以重建荧光样品的超分辨率光学断层图像；具体步骤如下：
(1)在I空间光调制器上显示预先生成好的二值光栅，II空间光调制器上依次显示相移值不同的位相掩膜，图像采集器分别记录对应的图片；
(2)改变光栅相位值并生成新的二值光栅，重复(1)步骤；
(3)改变光栅取向，重复(1)步骤和(2)步骤；
(4)针对(1)步骤中获得的全息图，在计算机中通过相移算法和标量衍射数值算法计算得到结构照明的样品再现图像；改变标量衍射算法中的再现距离，可以获得不同深度处结构照明的样品再现图像；
(5)针对(2)步骤和(3)步骤中记录的图像，重复(4)步骤，获得不同光栅相位和不同光栅取向时结构照明的样品再现图像；改变标量衍射算法中的再现距离，可以获得不同深度处结构照明的样品再现图像；
(6)针对某一相同的深度，即再现距离相同的结构照明再现图像，将(5)步骤获得的所有图像通过结构照明超分辨率重建算法进行合成，最终获得该深度处样品的超分辨率重构图像；
(7)针对某一相同的深度，即再现距离相同的结构照明再现图像，将(5)步骤获得的所有图像通过结构照明断层重建算法进行合成，最终获得该深度处样品的光学断层重构图像；
(8)将(6)和(7)步骤中获得的样品某一深度处的超分辨率重构图像和光学断层重构图像，进行频域滤波并融合，获得该深度处的超分辨率光学断层重建图像；
(7)对所有可能的再现距离，重复(6)-(8)步骤，获得样品内不同深度处的超分辨率光学断层再现图像。
本实用新型所述的深度为样品(11)与显微物镜(10)之间的距离。
本系统和方法的主要优点在于：在现有的结构照明显微成像技术中结合荧光数字全息技术的优点，可实现样品内不同深度处结构的三维再现；同时，还可实现超分辨率光学断层成像，且采集速度较快；采用I空间光调制器4作为产生结构照明的元件，因而在结构的周期、形式、调制度等具体参数上有较大的选择自由度。本实用新型提出的系统和方法使用于三维动态荧光样品或荧光样品内三维动态过程的超分辨率观察应用领域。
附图说明
图1为本实用新型专利公开了一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统组成结构示意图；
其中1激光器、2光纤、3准直透镜、4I空间光调制器，5第一透镜、6二向色镜、7第二透镜、8第三透镜、9反射镜、10显微物镜、11样品、12第四透镜、13 分束棱镜、14II空间光调制器、15图像采集器、16计算机。
图2(a)、(b)为本实用新型具体实施方式中涉及的数值仿真模拟中用到的两个样品的结构；
图3为本实用新型具体实时方式说明中涉及的数值仿真模拟中，通过本实用新型所述系统和方法最终重建的图像(b)；以及相同光学参数下通过传统荧光显微成像系统获取的图像(a)。
具体实施方式
下面结合实施例对本实用新型作进一步说明，但本实用新型并不限于以下实施例。
实施例1
在计算机中利用数值仿真软件对本实用新型所述的超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统的成像过程以及后续数值处理方法进行模拟，采用的超分辨率光学断层荧光数字全息显微成像系统见图1，选取如附图2所示的两个具有不同结构的样品，并将他们一前一后同时放置于样品11空间内的不同深度处。模拟系统的成像过程，记录所需的所有全息图后，使用重建算法进行重建的结果附图3(b) 所示。对比附图3(a)中给出的利用传统荧光显微成像系统获得的结果，可以看出样品空间内的不同深度处两物体像之间的串扰在附图3(b)中更小；同时附图3(b) 中，由数字和横线等结构构成的样品的细节可以被更清晰的分辨。由此，证明了本实用新型所提出方法的超分辨率光学断层成像特性。
Claims (6)
1.一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，包括光路连接放置的激光器(1)、光纤(2)、准直透镜(3)、I空间光调制器(4)，第一透镜(5)、二向色镜(6)、第二透镜(7)、第三透镜(8)、反射镜(9)、显微物镜(10)、第四透镜(12)、样品(11)、分束棱镜(13)、II空间光调制器(14)、图像采集器(15)；激光器(1)发出的光经光纤(2)传导和准直透镜(3)准直后照明I空间光调制器(4)，I空间光调制器(4)反射光波经过第一透镜(5)汇聚后被二向色镜(6)反射，二向色镜(6)反射的光进而依次经过第二透镜(7)、第三透镜(8)后，再被反射镜(9)反射后进入显微物镜(10)，经过显微物镜(10)后的光波照射在样品(11)上，激发出的荧光被显微物镜(10)收集后被反射镜(9)反射，然后再依次通过第三透镜(8)、第二透镜(7)、二向色镜(6)、第四透镜(12)和分束棱镜(13)后照射到II空间光调制器(14)上，II空间光调制器(14)反射的光再次被分束棱镜(13)反射后照射到图像采集器(15)上，由图像采集器(15)记录光强分布；其中I空间光调制器(4)、II空间光调制器(14)和图像采集器(15)均与计算机(16)相连接。
2.按照权利要求1所述的一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，在计算机(16)中生成并于I空间光调制器(4)上显示二值光栅；还在计算机(16)中生成并于II空间光调制器(14)上显示衍射分光相位掩膜图样。
3.按照权利要求1所述的一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，显微物镜(10)为无限远焦物镜；I空间光调制器(4)处在显微物镜(10)的后焦平面的共轭平面上，即I空间光调制器(4)至第一透镜(5)的轴向距离为第一透镜(5)的焦距，第一透镜(5)与第二透镜(7)的轴向距离为第一透镜(5)和第二透镜(7)焦距之和，第二透镜(7)至第三透镜(8)的轴向距离为第二透镜(7)至第三透镜(8)焦距之和，第三透镜(8)至显微物镜(10)后焦平面的轴向距离为第三透镜(8)的焦距。
4.按照权利要求1所述的一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，II空间光调制器(14)为纯相位型空间光调制器，入射其表面的荧光应该先通过偏振片形成线偏振光；且偏振片的偏振取向与II空间光调制器(14)的偏振敏感轴之间夹角为45度。
5.按照权利要求1所述的一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，在II空间光调制器(14)上加载的衍射分光相位掩膜经过计算机(16)中的数值运算生成，对应为某一确定焦距确定尺寸的正透镜的位相分布；衍射分光相位掩膜由三张彼此之间具有确定相移的位相分布图片构成。
6.按照权利要求1所述的一种超分辨率荧光数字全息断层显微成像系统，其特征在于，图像采集器(15)的放置位置应该经过特殊选取，以最优化所记录全息图的质量；进行实验时，先固定采集器(15)的一个位置，在图像采集器(15)位置附近沿轴向前后移动图像采集器(15)，可以发现前后分别有两个轴向位置处可以获得荧光样品清晰的图像；将这两个轴向位置到II空间光调制器(14)的轴向距离分别记为d1和d2；则图像采集器(15)的具体放置位置应该选取为：其距离II空间光调制器(14)的轴向距离为：2d1d2/(d1+d2)。
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