CN101893755B - 使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种使用四棱锥镜进行结构照明荧光显微的方法和装置。装置包括平行光束、结构照明系统、样品池和图像采集系统。结构照明系统由四棱锥镜，望远镜系统和相移玻璃片组成；样品池放置在相移玻璃片后方。平行光束经过四棱锥镜后发生折射，并产生具有二维空间结构分布的四光束干涉场。样品被该光场激发。平移作用在样品上的干涉光场并通过图像处理算法，可以实现三维层析成像。与现有结构照明显微技术相比，本发明具有更高的轴向分辨率和更低的光漂白效应，适用于活体生物的成像研究。

Description

使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法和装置

技术领域

本发明涉及一种荧光显微方法及装置。

背景技术

自从17世纪荷兰科学家Leeuwenhoek发明了首台光学显微镜并用它观察微生物以来，光学显微技术以其速度快、非接触、可探测样品内部等优点，一直是研究活细胞生命现象的主流方法。光学显微技术根据探测模式可分为两大类：点扫描成像技术和宽场成像技术。以激光共聚焦荧光显微为代表的点扫描成像技术用高度聚焦的激光束对样品逐点扫描成像，荧光信号经过探测针孔滤波后被光电倍增管探测收集，通过软件可以重新组合生成一个三维图像。在扫描过程中，探测针孔会挡住离焦部分的荧光信号而只让焦点处的荧光信号通过并被探测器接收，大部分的荧光信号不会被探测但是依然会对样品产生漂白作用(这种情况在3D成像时尤为明显)。这样一来，逐点扫描完整个样品有可能会产生严重的光漂白效应，而且有可能对活体生物组织带来损伤。宽场成像技术就是“面成像”，采用面阵图像传感器(如CCD相机)，可以在一个时间点获得一幅完整的二维图像，与点扫描成像比，宽场成像技术具有速度快、光漂白效应弱，图像灰度级高等优点。但是由于受样品离焦部分的干扰，普通的宽场成像技术不具有三维层析成像能力。1997年，牛沣大学Neil等人提出一种结构照明显微(Structured Illumination Microscopy，SIM)技术，极大地增强了宽场显微镜的轴向分辨率，具有三维层析成像能力。其原理是：在非相干成像过程中，只有图像的零频信号随着离焦而保持不变，其它频率信号会随着离焦而迅速衰减。因此在实验中可以使用具有固定空间频率的结构光场激发样品，这样一来，只有焦平面处样品才可以清晰成像，离焦时结构照明光场会迅速衰减。缺点是采集到的图像将不可避免地带有结构光场的条纹图案，但该条纹图案可以通过图像处理算法而被消除。通过每次平移结构照明光场三分之一个条纹周期，使CCD曝光得到三幅子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀，将三幅子图像通过公式

$I_x(y,z)=\sqrt{[{(I_0-I_{120})}^2+{(I_{120}-I_{240})}^2+{(I_{240}-I_0)}^2]/2}---\left(1\right)$

计算，最后可以得到焦平面处没有条纹背景的层析图像I_x(y，z)。

普通结构照明显微技术通常使用非相干光源照明一个一维正弦光栅，用同一个显微物镜将光栅微缩成像在样品上并且同时采集图像，通过电控平移台平移光栅可以移动作用在样品上的光栅相位，同时控制CCD曝光得到三幅子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀，再通过公式(1)的运算，得到样品的层析图。但是当待观测样品比较厚时，普通的结构照明显微光场将会产生比较大的畸变，为后期的图像处理带来困难。另外普通结构照明显微技术使用光栅微缩成像产生结构照明光，振幅型光栅的透过率理论上最大只有50％，因此光能利用率不高。

发明内容

本发明提出一种使用四棱锥镜产生四光束干涉场进行结构照明显微的方法和装置，其解决了现有结构照明显微技术光场畸变大、光能利用率低的技术问题。

本发明的技术解决方案为：

一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]激光器1发出的一束平行光经扩束准直器2后，沿四棱锥镜3的底面垂直入射，在四棱锥镜3后方放置透镜L₁4和透镜L₂5，透镜L₁4和透镜L₂5组成望远镜系统，在透镜L₂5后方放置一玻璃片6，在玻璃片6后方形成四光束干涉光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于四光束干涉光场中；

步骤3]通过绕x轴转动玻璃片6与XY平面之间的夹角，依次改变YZ平面内子光束k₂与k₄之间的相位差，每次改变三分之一波长相位差，CCD相机11同时通过显微物镜9分别采集YZ平面内三幅不同相位的二维切面图像(I₀，I₁₂₀，I₂₄₀)并存储在计算机12中；再通过图像运算

可以得到样品的层析图像I_x(y，z)；

步骤4]沿x轴方向垂直移动显微物镜9并重复步骤3]，得到样品其它层的二维层析图，最终得到样品完整的三维荧光图像信息I(x，y，z)。

为了调整轴向分辨率，可以改变望远镜系统的扩束比来改变四光束干涉光场强度分布周期，从而改变系统的轴向分辨率。

一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微装置，包括激光器1、结构照明系统、样品池8和图像采集系统，其特征在于：所述结构照明系统包括扩束准直器2、四棱锥镜3和玻璃片6，所述扩束准直器2可将激光器1发出的平行光扩束后垂直入射至四棱锥镜3的底面；所述样品池8放置在四棱锥镜3后方的干涉区域，所述玻璃片6放置在四棱锥镜3和样品池8之间。

上述荧光显微装置还包括放置在四棱锥镜3和样品池8之间的透镜L₁(4)和透镜L₂5，所述透镜L₁4和透镜L₂5构成望远镜系统，所述玻璃片6放置在透镜L₂5和样品池8之间。

上述图像采集系统包括依次设置在样品池8上方的显微物镜9、滤光片10、CCD相机11以及计算机12。

本发明的特点为：

1、本发明平行光束经过四棱锥镜后会发生折射，在四棱锥镜后的光束重叠区内会产生四光束干涉场，形成具有二维空间强度分布的结构照明光场。

2、由于本发明光场是通过四束对称平行光束干涉形成，所以干涉场强度分布具有二维周期结构，并且干涉极大强度是干涉前单束光强度的16倍。

3、只要在四束光的干涉区域都会存在干涉极大，这样产生的光场就具有类似于贝塞尔光场的非衍射特性。当样品位于干涉光场内部时，不会由于样品的阻挡而使得样品后方的干涉极大消失，因此具有很大的穿透深度。并且由于光场是通过四光束干涉形成，干涉极大处的光强度是干涉前单束光强度的16倍。因此可以减少入射激光的总功率，与普通结构照明显微技术相比，可以降低成像过程中对整体样品的光损伤。

4、本发明采用固定空间频率的干涉场激发样品，因此图像畸变效应微弱。四光束干涉场具有光强空间二维周期分布图案，光场条纹周期Δ＝λ/2nsin(θ/2)，其中λ是激光波长，n是样品折射率，θ是干涉子光束的夹角。理论上，四光束干涉场结构照明显微系统的轴向(指X轴)点扩散函数(PSF)可以看作是干涉场的X轴强度分布与显微物镜轴向点扩散函数的乘积，干涉场的X轴向强度分布周期可以通过控制干涉子光束的夹角来控制，最小可以达到λ/2n。通过改变四光束干涉场的轴向周期可以得到比普通结构照明显微更高的轴向分辨率。

附图说明

图1(a)为四棱锥镜产生四光束干涉示意图，(b)是四光束干涉形成的光场强度空间分布计算结果图；

图2为使用四棱锥镜和望远镜系统产生四光束干涉的原理示意图；

图3为使用四棱锥镜产生结构照明荧光显微光路示意图；

附图标记如下：1-激光器，2-扩束准直器，3-四棱锥镜，4-透镜L₁，5-透镜L₂，6-玻璃片，7-载物台，8-样品池，9-显微物镜，10-滤光片，11-CCD相机，12-计算机。

图4为中华大鼠卵巢(CHO)细胞荧光显微三维层析图，其中(a)-(d)为使用四光束干涉光场照明样品得到的不同深度层析图，(e)-(h)是与(a)-(d)对应的相同位置的普通宽场荧光图。标尺为10微米，层间距＝1.75微米。

图5为果蝇复眼的自发荧光显微三维层析图，其中(a)-(f)为使用四光束干涉光场照明样品得到的不同深度层析图，(g)-(l)是与(a)-(f)对应的相同位置的普通宽场荧光图。标尺为20微米，层间距＝20微米。

具体实施方式

一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]激光器1发出的一束平行光经扩束准直器2后，沿四棱锥镜3的底面垂直入射，在四棱锥镜3后方放置透镜L₁4和透镜L₂5，透镜L₁4和透镜L₂5组成望远镜系统，在透镜L₂5后方放置一玻璃片6，在玻璃片6后方形成四光束干涉光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于四光束干涉光场中；

步骤3]通过绕x轴转动玻璃片6与XY平面之间的夹角，依次改变YZ平面内子光束k₂与k₄之间的相位差，每次改变三分之一波长相位差，CCD相机11同时通过显微物镜9分别采集YZ平面内三幅不同相位的二维切面图像(I₀，I₁₂₀，I₂₄₀)并存储在计算机12中；再通过图像运算

可以得到样品的层析图像I_x(y，z)；

步骤4]沿x轴方向垂直移动显微物镜9并重复步骤3]，得到样品其它层的二维层析图，最终得到样品完整的三维荧光图像信息I(x，y，z)。

为了调整轴向分辨率，可以改变望远镜系统的扩束比来改变四光束干涉光场强度分布周期，从而改变系统的轴向分辨率。

一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微装置，包括激光器1、结构照明系统、样品池8和图像采集系统；

结构照明系统包括扩束准直器2、四棱锥镜3、望远镜系统和玻璃片6，扩束准直器2可将激光器1发出的平行光扩束后垂直入射至四棱锥镜3的底面；样品池8放置在四棱锥镜3后方的干涉区域，望远镜系统为放置在四棱锥镜3和样品池8之间的透镜L₁4和透镜L₂5，玻璃片6放置在透镜L₂5和样品池8之间。

图像采集系统包括依次设置在样品池8上方的显微物镜9、滤光片10、CCD相机11以及计算机12。

本发明原理：

本发明提出一种使用四棱锥镜产生四光束干涉场进行结构照明显微的方法和装置。如图1(a)所示，激光束经扩束准直后正入射四棱锥镜的底面，在四个侧面上入射光被折射，形成四束与光轴夹角相同的对称分布子光束，并且它们的振幅和初相位也都相同。在棱锥镜的后面，它们有一段相交的区域，在此形成具有二维(XY平面内)空间强度分布的四光束干涉场，如图1(b)所示。当荧光染料标记的样品位于该干涉光场时，将会被该光场激发。改变子光束的相位差可以平移干涉图案的空间位置，再利用与普通结构照明显微同样的方法得到三幅子图像(在YZ平面内)，同样再通过公式(1)的运算，可以得到样品的层析图像I_x(y，z)。

干涉区的长度为：

$Z_{\max }=\frac{w_0}{{\mathrm{\θ}}_1}=\frac{w_0}{(n_0-1)\mathrm{\γ}}---\left(2\right)$

结构照明光场条纹的周期为：

$\mathrm{\Δ}=\frac{\mathrm{\λ}}{2\sin \left[(n_0-1)\mathrm{\γ}\right]}---\left(3\right)$

其中w₀是入射平行光束的半径，n₀是四棱锥镜材料的折射率，是四棱锥镜的底角，是激光波长，₁是入射平行光束通过四棱锥镜后的发散角(如图2中所示)。

在结构照明显微中，通常会引入一个参数

来表征系统的轴向分辨率，Δ是结构照明光条纹的周期，NA是物镜的数值孔径。

代表普通的宽场显微，系统的轴向分辨率最差；

时系统的轴向分辨率最好，和相同NA时的共聚焦显微类似。改变结构照明光场周期Δ可以改变

。由公式(3)可以看出，一旦四棱锥镜的底角和激光波长固定，那么结构照明光场周期Δ也就固定了。为了在实验中改变结构照明光场周期Δ，我们在四棱锥镜后放置了一对透镜L₁和L₂，如图2所示(YZ平面内)。L₁和L₂组成一个望远镜系统，利用几何光学原理可以得到：

$\frac{{\tan \mathrm{\θ}}_2}{{\tan \mathrm{\θ}}_1}=\frac{f_1}{f_2}---\left(4\right)$

从公式(4)可以看出，通过改变望远镜系统的扩束比f₂/f₁，可以改变光束的夹角2₂，从而改变结构照明光场周期。

另外，由于实验中待测样品必须位于干涉区内，而干涉区的长度有限并且紧靠着四棱锥镜，所以实验中往往没有足够的空间来放置样品台。L₁和L₂组成的望远镜系统还可以将干涉区域移动到远离光学元件的位置，方便样品的放置。利用图2中的几何关系还可以得到：

$Z_{\max }=\frac{h-(f_1+f_2)({\tan \mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}$

$Z_{\min }=\frac{h-(f_1+f_2)(\tan {\mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}-\frac{f_2{w}_0}{f_1\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}$

$\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)=\tan {\mathrm{\θ}}_1+\frac{h}{f_1}+\frac{h-(f_1+f_2)(\tan {\mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{f_2}$

h＝w₀-d₁tanθ₁

θ₁＝(n₀-1)γ                                  (5)

其中Z_max是光束干涉区最远端距离透镜L₂的距离；Z_min是光束干涉区最前端距离透镜L₂的距离；θ₁是入射平行光束通过四棱锥镜后的发散角；θ₂是从透镜L₂出射光线的发散角；f₁是透镜L₁的焦距；f₂是透镜L₂的焦距；d₁是四棱锥镜和透镜L₁之间的距离；h是光束入射到透镜L₁上的半径。

实施例：实验中选用底角＝7°的四棱锥镜，材料折射率n₀＝1.5，激光波长＝532nm，入射激光束的半径w₀＝1.5mm，透镜L₁的焦距f₁＝125mm，透镜L₂的焦距f₂＝50mm，d₁＝5mm。代入公式(3-5)可得到，结构照明光场周期Δ＝1.75m，Z_max＝77mm，Z_min＝73mm。这样极大地增加了系统的工作距离，方便了样品台及显微物镜等部件的放置。

如图2所示(YZ平面内)，在透镜L₂后放置一个厚度为t，折射率为n₁的玻璃片。玻璃片不会改变光束的角度，但是会给参与干涉的光束k₂与k₄之间产生一个相位差：

$\mathrm{\δ}=\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}(\frac{n_{1}t}{\cos (\mathrm{\β}+{\mathrm{\θ}}_2)}-\frac{n_{1}t}{\cos \left({\mathrm{\β}-\mathrm{\θ}}_2\right)})---\left(6\right)$

通过绕x轴转动玻璃片倾角(玻璃片与XY平面的夹角)，可以改变光束k₂与k₄之间的相位差，从而可以在YZ平面内平移结构照明光场条纹的空间位置。此时同步控制CCD，可以得到三幅不同相位干涉场照明的子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀，再通过公式(1)的运算，可以得到样品的层析图。

本发明的工作方式：

本发明的具体实验光路如图3所示，探测光路与激发光路独立并且相互垂直。经荧光染料标记的样品放置于图中的阴影区内，通过四光束干涉可以在样品内产生结构照明光场，该结构照明光场会在样品内激发出荧光。通过旋转玻璃片(6)的倾角，可以移动结构照明光场(YZ平面内)干涉条纹的相位，同步控制CCD得到三幅子图像I₀，I₁₂₀，I₂₄₀存入计算机(12)，再通过公式(1)的运算，可以得到样品的层析图。垂直移动(沿X轴方向)显微物镜并重复上述步骤，可以得到样品其它层的二维切面图。最后通过软件可以重新组合得到样品完整的三维荧光图像信息。

实施例-本发明应用于活体生物样品的荧光成像：

图4是本发明装置对经过荧光染料碘化丙啶(Propidium iodide)标记的活体中华大鼠卵巢(CHO)细胞的荧光成像，图中标尺为10微米。实验中使用40X显微物镜，NA＝0.85，激光器为倍频的YAG激光器，波长532nm，CCD曝光时间0.02秒。图4(a)-(d)为使用四光束干涉光场照明样品得到的样品内部不同深度的层析图，层间隔为＝1.75微米。图4(e)-(h)是与(a)-(d)对应的相同位置的宽场荧光图。通过比较可以看到，四光束干涉光场照明得到的荧光图像比普通的宽场荧光图像具有更高的信噪比和更小的层间串扰。

图5是使用本发明装置拍摄的果蝇复眼的自发荧光显微图像，图中标尺为20微米。果蝇复眼在532nm激光激发下可发出强烈的自发荧光。实验中使用20X显微物镜，NA＝0.6，CCD曝光时间0.02秒。图5(a)-(f)为使用四光束干涉光场照明样品得到的不同位置的层析图，层间隔为＝20微米。图5(g)-(l)是与(a)-(f)对应的相同位置的宽场荧光图。很明显，使用四光束干涉结构照明方式，几乎没有背景噪声的干扰，图像对比度比宽场荧光图高得多。

Claims (4)

1.一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法，其特征在于：其包括以下步骤：

步骤1]激光器(1)发出的一束平行光经扩束准直器(2)后，沿四棱锥镜(3)的底面垂直入射，在四棱锥镜(3)后方放置透镜L₁(4)和透镜L₂(5)，透镜L₁(4)和透镜L₂(5)组成望远镜系统，在透镜L₂(5)后方放置一玻璃片(6)，在玻璃片(6)后方形成四光束干涉光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于四光束干涉光场中；

步骤3]建立三维坐标系，定义激光传播方向为Z轴，与Z轴垂直的平面为XY平面，通过绕x轴转动玻璃片(6)与XY平面之间的夹角，依次改变YZ平面内子光束k₂与k₄之间的相位差，每次改变三分之一波长相位差，CCD相机(11)同时通过显微物镜(9)分别采集YZ平面内三幅不同相位的二维切面图像(I₀，I₁₂₀，I₂₄₀)并存储在计算机(12)中；再通过图像运算 $I_x(y,z)=\sqrt{{[(I_0-I_{120})}^2+{(I_{120}-I_{240})}^2+{(I_{240}-I_0)}^2]/2},$ 可以得到样品的层析图像I_x(y，z)；

步骤4]沿x轴方向垂直移动显微物镜(9)并重复步骤3]，得到样品其它层的二维层析图，最终得到样品完整的三维荧光图像信息I(x，y，z)。

2.根据权利要求1所述的使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微方法，其特征在于：其还包括调整轴向分辨率的步骤：

改变望远镜系统的扩束比可以改变四光束干涉光场强度分布周期，从而改变系统的轴向分辨率。

3.一种使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微装置，包括激光器(1)、结构照明系统、样品池(8)和图像采集系统，其特征在于：所述结构照明系统包括扩束准直器(2)、四棱锥镜(3)和玻璃片(6)，所述扩束准直器(2)可将激光器(1)发出的平行光扩束后垂直入射至四棱锥镜(3)的底面；所述样品池(8)放置在四棱锥镜(3)后方的干涉区域，所述玻璃片(6)放置在四棱锥镜(3)和样品池(8)之间，所述荧光显微装置包括放置在四棱锥镜(3)和样品池(8)之间的透镜L₁(4)和透镜L₂(5)，所述透镜L₁(4)和透镜L₂(5)构成望远镜系统，所述玻璃片(6)放置在透镜L₂(5)和样品池(8)之间。

4.根据权利要求3所述的使用四棱锥镜产生结构照明的荧光显微装置，其特征在于：所述图像采集系统包括依次设置在样品池(8)上方的显微物镜(9)、滤光片(10)、CCD相机(11)以及计算机(12)。

Images