CN113777770A - 一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，主要由照明系统和成像系统两部分组成。其中照明系统的特点在于使高斯光束经过加载有正多边棱锥阵列结构相位图的空间光调制器后产生阵列密集排布的光场，光利用率大大提高；成像系统的特点在于由显微物镜、成像透镜和相机搭建而成的显微系统实现放大成像，同时能够在计算机中实时成像，系统装置结构简易，自组搭建设计，光学放大倍率可调。本发明相比传统器件调制照明的方法简易、快捷，拥有更多的调制选择性，成像方面图像信噪比提升，拥有更大的成像范围，更小的光漂白性和光毒性。

Description

一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统
技术领域
本发明涉及微光学器件和生物活体显微成像，特别涉及一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其中最大特点是使用密接排布的正多边形光片晶格阵列的结构光照明，以及对生物活体的实时成像。
背景技术
光片荧光显微镜是本世纪兴起的一种新型显微成像技术。与传统的荧光显微镜不同，它使用片层光横向照明透明生物组织，从而实现生物组织不同深度的显微成像。它的基本工作原理是利用一束从侧面照明样品的片状光源，且光片厚度一般在微米数量级，再从垂直照明光路的方向采集生物荧光信号，利用宽场采集的荧光图像，快速获取样本三维空间信息提供了帮助。目前，大部分所使用的技术主要是通过移动样品使入射光面激发不同的生物组织平面，由于样品受激发的平面就是成像平面，通过对整个样本进行扫描，就可以获取二维图像序列来重构三维，可以达到细胞水平的分辨率。相对于传统的显微技术，光片显微镜具有较低的光毒性和光漂白性，较高的轴向分辨率，较快的成像速度。但是由于采用光片扫描生物样本得到的三维图像，每一张二维图像都不是在同一时刻拍摄的，因此不具有较好的实时性。此外，对样品进行反复扫描会对活体生物造成损伤，因此这一技术仍不能很好满足那些需要进行长时间观测的研究。因此，本系统利用密排的正多边棱锥阵列相位图来调制光束，提高光片显微成像的照明深度，实现对生物体的整体照明，同时使用改进的光场成像系统，具有更小的光漂白和光毒性的同时，提高图像信噪比，增大照明深度可以得到某时刻的整体三维图像，适合活体生物样本长时间观测的体成像。
发明内容
针对现有的技术缺陷，本发明的目的在于提供了一种利用密排的正多边棱锥阵相位图调制照明光场，提高图像分辨率，解决光片照明显微镜成像质量的问题。同时本发明具有系统结构紧凑，易于搭建，实现成本低，图像质量高等特点。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是提供一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，该系统由照明系统和成像系统组成，照明与成像光路二者互相垂直。其中照明系统通过空间光调制器将激光器出射的高斯光束转换为密排的正四边形、正六边形阵列结构光，经过透镜组的调整和显微物镜的聚焦，在样品池中形成光片晶格阵列照明。成像光路利用显微物镜采集垂直于照明方向的样品信号，通过透镜调整后由高速相机采集样品成像。最终成像分辨率在微米量级，可实现对活体样品细胞级别的高速成像。
本发明中，所述的阵列结构光，该结构分别为正四边形棱锥和正六边形棱锥阵列密接排布组成，单个的正多边棱锥底面最大尺寸设定范围为10微米到30微米。每个锥体的高度
Figure BSA0000251611360000021
其中λ为激光器工作波长，n为器件的材料折射率。
本发明中，所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，可以通过仿真器件结构得到相位图，加载到空间光调制器上实现对照明光的调制，入射光从空间光调制器透射后经过，每一个单元的正多边棱锥相位图都能调制产生工作距离在毫米量级、工作距离内的半高全宽在微米量级的类贝塞尔光片，每个光片的工作距离wd和厚度q可以表示为
Figure BSA0000251611360000022
Figure BSA0000251611360000023
其中h0为正多边棱锥高度，n为器件的材料折射率，D为正多边棱锥底面的半宽。这种照明方式相对于传统的器件调控的方法极大地减小了照明光对于活体生物样品的光漂白和光毒性，同时提升了成像质量。
本发明中，所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，与传统圆形微轴锥镜阵列相比，正多边棱锥阵列能够提高入射光的利用率，其中正四棱锥阵列排布可以提高透镜占比21.5％，正六棱锥阵列排布可以提高透镜占比27.3％，进一步提升了光场成像中的采集频率。
本发明中，所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，使用方形毛细管搭载样品，同时保证结构光正入射毛细管管壁，以减少入射光对管壁造成的散射和折射。如若采用圆形毛细管，则管壁散射和折射噪声过大，严重影响成像质量。
本发明中，所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，可以通过改变正多边棱锥阵列相位图排布周期，实现结构光光片层数的改变，从而达到结构光对不同样本深度照明的目的，通过对二维图像重建得到样本的三维结构信息。
本发明中，所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，成像系统为显微物镜、成像透镜和高速相机搭建成的共轴光学系统，其中成像显微物镜可自由调焦，相机放置于成像透镜的后焦面收集样品信号并在计算机中实时显示。目前高速相机可以达到100fps，意味着每秒可以对目标样本100次观测记录，因此也可以实现实时成像。与现有技术相比，本发明的技术效果包括：
本发明提出一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，系统装置结构简单，自组式设计，适用于空间分辨率在微米量级的活体生物样本实验。密排的正多边棱锥阵列相位图加载到空间光调制器上用来产生工作距离长、强度分布均匀、光片形状扁平的光片晶格阵列照明，其中密接排布的正多边棱锥阵列能够提高入射光的利用率，提高21.5％-26％的采集频率，实现大范围深度照明的同时提高信噪比，极大降低了光漂白和光毒性。
附图说明
图1是本发明提供的正多边阵列光片晶格照明显微成像系统光路，其中1为激光器；2为衰减片；3为光束准直物镜；4为透镜1；5为偏振片；6为空间光调制器；7为偏振片；8为照明显微物镜；9为方形毛细管；10为探测显微物镜；11为透镜2；12为高速相机。
图2是探测成像系统光路示意图，其中1为装有斑马鱼样品的方形毛细管；2为探测显微物镜；3为透镜；4为高速相机；5为毛细管夹持装置及固定台；6为筒柱。
图3是光束通过正多边棱锥光路原理示意图。
图4是正多边棱锥结构及其相位图，其中(a)是正四棱锥；(b)是正四棱锥阵列；(c)是正四棱锥相位掩膜图；(d)是正四棱锥阵列相位掩膜图；(e)是正六棱锥；(f)是正六棱锥阵列；(g)是正六棱锥相位掩膜图；(h)是正四六棱锥阵列相位掩膜图。
图5是经过密排的正多边形阵列相位图调制的结构光场，其中(a)是正四棱锥；(b)是正四棱锥阵列；(c)是正六棱锥；(d)是正六棱锥阵列。
图6是斑马鱼样品分别在结构光和高斯光的照明条件下的到的成像结果，其中(a)为正六边形阵列结构光照明的斑马鱼头部成像；(b)为高斯光照明的斑马鱼头部成像；(c)为对(a)和(b)中斑马鱼眼部轮廓放大(黄色虚线所包围的部分)的灰度分析结果。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统观测，其中1为激光器；2为衰减片；3为光束准直物镜；4为透镜1；5为偏振片；6为空间光调制器；7为偏振片；8为照明显微物镜；9为方形毛细管；10为探测显微物镜；11为透镜2；12为高速相机。
如图2所示，是探测成像系统光路示意图，其中1为装有斑马鱼样品的方形毛细管；2为探测显微物镜；3为透镜；4为高速相机；5为毛细管夹持装置及固定台；6为筒柱。
先对本发明中提出的阵列结构光的相位掩膜图案进行实验。实验步骤如下：
1、先搭建如图1所示的照明系统部分。
2、在照明显微物镜焦平面附近放置高速相机。
3、打开电源，在空间光调制器上加载阵列结构的掩膜图案，同时调节两个偏振片，尽可能使出射光全为结构光。
4、调节高速相机位置，拍摄光场图片，得到的结果如图5所示。
利用阵列结构光照明的显微成像进系统行活体生物样品实测验。实验步骤如下：
1、在检测结构光场实验系统的基础上，按照图2所示搭建探测成像系统。
2、将活体斑马鱼幼体装入方形毛细管，并用夹持装置固定毛细管。
3、打开电源，将方形毛细管微调到照明显微物镜的焦平面处。同时用4×观测物镜调至成像清晰。
4、选定高斯光照明为对照组，正六边形阵列结构光为实验组，依次进行试验并重复多组，用高速相机拍摄成像结果。
5、分别对高斯光和正六边形阵列结构光照明的成像结果进行分析比对，结果如图6所示。其中(a)为正六边形阵列结构光照明的斑马鱼头部成像；(b)为高斯光照明的斑马鱼头部成像；(c)为对(a)和(b)中斑马鱼眼部轮廓放大(黄色虚线所包围的部分)的灰度分析结果。
图6表明，在高斯光照明的条件下，照明亮度不均匀，局部范围内存在过曝现象，过曝噪声像素点数与实际图像信号像素点数相当，图片信噪比较低；在正六边形阵列结构光照明的条件下，我们可以看到斑马鱼样品总体成像亮度均匀，只有较少部分存在过曝现象，对比度高，信噪比和清晰度也得到了很大的提升，相应的会使对生物体的光毒性和光漂白大幅度降低。

Claims (8)

1.一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于该系统由照明系统和成像系统组成，照明与成像光路二者互相垂直。其中照明系统通过空间光调制器将激光器出射的高斯光束转换为密排的正四边形、正六边形阵列结构光，经过透镜组的调整和显微物镜的聚焦，在样品池中形成光片晶格阵列照明。成像光路利用显微物镜采集垂直于照明方向的样品信号，通过透镜调整后由高速相机采集样品成像。最终成像分辨率在微米量级，可实现对活体样品细胞级别的高速成像。
2.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，该结构器件分别为正四边形棱锥和正六边形棱锥阵列密接排布组成，单个的正多边棱锥底面最大尺寸设定范围为10微米到30微米。每个锥体的高度
Figure FSA0000251611350000011
其中λ为激光器工作波长，n为器件的材料折射率。
3.根据权利要求2所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，通过仿真器件结构得到相位图，加载到空间光调制器上实现对照明光的调制，入射光从空间光调制器透射后经过，每一个单元的正多边棱锥相位图都能调制产生工作距离在毫米量级、工作距离内的半高全宽在微米量级的类贝塞尔光片，每个光片的工作距离wd和厚度q可以表示为
Figure FSA0000251611350000012
Figure FSA0000251611350000013
其中h0为正多边棱锥高度，n为器件的材料折射率，D为正多边棱锥底面的半宽。这种照明方式相对于传统的器件调控的方法极大地减小了照明光对于活体生物样品的光漂白和光毒性，同时提升了成像质量。
4.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，与传统圆形微轴锥镜阵列相比，正多边棱锥阵列能够提高入射光的利用率，其中正四棱锥阵列排布可以提高透镜占比21.5％，正六棱锥阵列排布可以提高透镜占比27.3％，进一步提升了光场成像中的采集频率。
5.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，使用方形毛细管搭载样品，同时保证结构光正入射毛细管管壁，以减少入射光对管壁造成的散射和折射。如若采用圆形毛细管，则管壁散射和折射噪声过大，严重影响成像质量。
6.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，照明系统中的空间光调制器为透射式。
7.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，可以通过改变正多边棱锥阵列相位图排布周期，实现结构光光片层数的改变，从而达到结构光对不同样本深度照明的目的，通过对二维图像重建得到样本的三维结构信息。
8.根据权利要求1所述的一种阵列结构光照明的高信噪比显微成像系统，其特征在于，成像系统为显微物镜、成像透镜和高速相机搭建成的共轴光学系统，其中成像显微物镜可自由调焦，相机放置于成像透镜的后焦面收集样品信号并在计算机中实时显示。
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