CN102520507B

CN102520507B - 一种共聚焦显微成像的获取方法和装置

Info

Publication number: CN102520507B
Application number: CN201110443937.2A
Authority: CN
Inventors: 陈木旺
Original assignee: Maike Aodi Industry Group Co Ltd
Current assignee: Maike Aodi Industry Group Co Ltd
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: CN102520507A

Abstract

一种共聚焦显微成像的获取方法和装置，步骤：a）采用空间光调制器件，同时作为可编程的照明针孔和探测针孔；b）将上述空间光调制器件分成若干类微镜；c）设定摄像头的曝光时间；在曝光时间内，依次开启同一类的微镜；d）直到所有各类微镜开启一遍后，摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。装置包括光源、照明透镜、分光分色片、DMD、物镜、成像透镜、摄像头、控制器和计算机；计算机与控制器、摄像头分别相互电联接，控制器分别电联接摄像头、DMD。其优点是：1）可以设定分辨率优先或速度优先两种共聚焦模式；2）可以快速切换共聚焦图像与普通图像；3）具有ROI功能；4）没有运动部件，控制简单，更稳定；5）核心部件采用商业器件，成本更低。

Description

一种共聚焦显微成像的获取方法和装置

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，具体涉及一种共聚焦显微成像的获取方法及装置。

背景技术

普通的显微镜在获得聚焦处信息的同时也获得离焦处的信息，该离焦信息会影响观察到的图像，其效果犹如在聚焦处铺上了一层“薄纱”，大大降低了图像的对比度。所谓的共聚焦显微镜，可以尽量多的抑制聚焦处之外的杂散光，以保证获得的图像主要是来自样品聚焦处的信息，即像面和观察面是完全“共轭”的，去除了“薄纱”的影响，对比度更高，且可分层获得样品的信息，也就是光学共聚焦图像，再用这些二维共聚焦图像可以在不破坏样品的情况下重建出样品的三维图像，非常适合于活体观察，并已成为生物医学研究、材料科学和半导体等领域的重要工具。

传统的激光扫描共聚焦显微镜，是在普通荧光显微镜的基础上增加了“共聚焦技术”和“激光扫描技术”。共聚焦技术，就是在共聚焦显微镜的光路中设置了两个共聚焦针孔即照明针孔和探测器针孔，并与样品的聚焦点共轭。激光光源发出的激光束，通过照明针孔后成为点光源，经物镜成像在样品上为一个聚焦点，从聚焦点发出（或反射）的光反方向经物镜成像在探测器针孔处，也就是说，放置在探测器针孔后面的探测器只能接收来自聚焦点的光，减少了非聚焦处杂散光的干扰，从而提高获得图像的对比度。这就是一个点物体的共聚焦成像原理，需要配合对样品的逐点扫描才能实现样品的二维共聚焦成像。一般采用激光扫描技术实现对样品的二维扫描成像，即在光路中安装两个检流镜（Galvanometer mirror），其转动角度可控制，分别用于控制光束对样品进行X和Y方向的逐点扫描成像，以获得样品某个深度的共聚焦图像，改变载物台的轴向（Z方向）位置，并获得一系列样品不同深度的共聚焦图像，即可在不破坏样品的情况下对样品进行三维重建，实现活体的三维观察。激光扫描共聚焦显微镜LSCM的横向分辨率接近于普通显微镜的2倍，轴向分辨率可达到几百纳米，虽然如此，但由于存在共聚焦针孔，抑制了绝大部分的杂散光，照明效率很低，使得探测器接收到信号很微弱，需要高灵敏度的光电倍增管PMT作为探测器，但其量子效率低，获得的图像信噪比低；另外，由于采用逐点扫描成像，成像速度过慢，不利于活体的观察；还需要激光作为光源，成本高。

激光扫描共聚焦显微镜是基于单光束扫描成像，效率低，成像速度过慢，不利于活体的观察。碟片共聚焦显微镜是基于多光束扫描的方法，速度大大提高，可以实时成像。其具体原理是在样品聚焦平面的共轭面上放置一个可以旋转的碟片，该碟片上开有很多针孔，光源发出的光经过这些针孔后形成许多点光源，经过物镜成像在样品的聚焦平面上，从样品聚焦点发出（或反射）的光反方向经过物镜成像后又聚焦到原来的针孔上（即碟片上的针孔同时充当照明针孔和探测器针孔），通过分色镜后成像在面阵探测器上，这样可以同时多个点成像，再配合碟片的高速旋转，可以实现快速的二维成像。旋转盘上的微透镜阵列是用于提高照明效率，可以进一步提高成像速度。相对于激光扫描共聚焦显微镜，由于多点成像，采用面阵CCD探测器，速度较高，也不需要激光作为光源；多点成像也带来些不足，一是杂散光会通过邻近的针孔进入探测器，降低图像的对比度，影响分辨率；二是碟片的针孔大小是固定的，不像激光扫描共聚焦显微镜的探测器针孔是可以调节的，也就不能改变分辨率；三是不支持ROI（Region of interest）功能；四是系统更复杂、昂贵。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种扩展性好、系统简单的共聚焦显微成像的获取方法及装置。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种共聚焦显微成像的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

a）采用一空间光调制器件，同时作为可编程的照明针孔和探测针孔；

b）将上述空间光调制器件分成若干类微镜；

c）设定摄像头的曝光时间；在摄像头曝光时间内，依次开启同一类的微镜；

d）直到所有各类微镜开启一遍后，摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。

优选的，步骤a）中，所述的空间光调制器件为数字微镜器件DMD。

优选的，步骤b）中，将所述数字微镜器件DMD分成若干类，即将数字微镜器件DMD分割成若干个连续的子块，每个子块包含个微镜；，其中N为自然数，L为大等于2的自然数；在x和y方向分别以N为基本单位，将每个子块的M²个微镜分成L²个连续次子块，并对L²个次子块依次按1，2，3，…，L²编号，即所有的微镜被分成L²类：微镜1、微镜2、微镜3、……、微镜L²；所有的微镜是在摄像头曝光期间分时开启的。

优选的，步骤c）中，启动数码摄像头曝光的同时，所有微镜1同步动作，处于“开”状态，其余微镜均处“关”状态，保持曝光时间的L²分之一后，再同步开启所有微镜2，同步关闭其余微镜，……依此类推，微镜按编号1、2、3、…、L²逐一处于“开”状态，直至微镜L²处于“开”状态，并保持曝光时间的L²分之一后，同步关闭所有微镜，同时数码摄像头停止曝光。

优选的，所述数字微镜器件DMD的每个微镜，均有两种工作角度±12^o；定义其中一个角度如+12^o为“开”状态，则-12^o为“关”状态；所述的M可根据需要选定，改变M的大小，等效于调整针孔的密度，M越大，分辨率越高，速度会较慢，M越小，速度会较快，但分辨率越低；所述的N可根据需要选定，改变N的大小，等效于调整针孔尺寸，N越大，针孔越大，速度会较快，但分辨率越低，N越小，针孔越小，分辨率越高，但速度会较慢。

一种共聚焦显微成像的获取装置，其特征在于：包括光源、照明透镜、分光分色片、数字微镜器件DMD、物镜、成像透镜、摄像头、DMD控制器和计算机；

在所述分光分色片的透射光轴上依次设置所述光源、照明透镜、分光分色片及数字微镜器件DMD，所述物镜置于所述数字微镜器件DMD与样品之间，在所述分光分色片的反射光轴上依次设置所述分光分色片、成像透镜和摄像头；

所述光源经照明透镜会聚后穿过分光分色片，经数字微镜器件DMD反射后进入物镜，最后照射在样品上，样品受激发后发出荧光，沿反方向经物镜放大后成像在数字微镜器件DMD上，再经分光分色片反射后进入成像透镜，最后成像在摄像头上；

所述计算机与所述DMD控制器、摄像头分别相互电联接，所述DMD控制器分别电联接摄像头、数字微镜器件DMD，所述摄像头、数字微镜器件DMD在所述计算机的控制下同步工作，在摄像头的曝光期间，数字微镜器件DMD被分成不同类微镜，该不同类微镜依次处于“开-关”状态。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：因为本发明利用可编程的空间光调制器件-数字微镜器件DMD作为照明/探测器针孔，针孔尺寸和密度可调，即相当于分辨率和速度可调，所以本发明1）可以设定分辨率优先或速度优先两种共聚焦模式；2）可以快速切换共聚焦图像与普通图像，当所有微镜全部开启，就不存在针孔，即为一台普通的显微镜；3）具有ROI（Region of interest）功能，设定其中感兴趣区域ROI对应的微镜充当可编程的照明/探测器针孔，其它微镜始终关闭，这样，只有感兴趣区域ROI才能获得共聚焦图像；4）没有运动部件，控制简单，更稳定；5）核心部件采用商业器件，成本更低。

附图说明

图1是本发明实施例的结构示意图；

图2是本发明实施例中数字微镜器件DMD子块分割的一种实例（M=8，N=2，L=4）；

图3 是本发明实施例中数字微镜器件DMD子块分割的另一种实例（M=3，N=1，L=3）。

具体实施方式

下面结合附图实施例，对本发明做进一步描述：

一种共聚焦显微成像的获取方法，包括如下步骤：a）采用一数字微镜器件DMD，同时作为可编程的照明针孔和探测针孔；b）将上述数字微镜器件DMD分成若干类微镜，即将数字微镜器件DMD分割成若干个连续的子块，每个子块包含个微镜；，其中N为自然数，L为大等于2的自然数；在x和y方向分别以N为基本单位，将每个子块的M²个微镜分成L²个连续次子块，并对L²个次子块依次按1，2，3…L²编号，即所有的微镜被分成L²类：微镜1、微镜2、微镜3、……微镜L²；所有的微镜是在摄像头曝光期间分时开启的；c）设定摄像头的曝光时间；启动数码摄像头曝光的同时，所有微镜1同步动作，处于“开”状态，其余微镜均处“关”状态，保持曝光时间的L²分之一后，再同步开启所有微镜2，同步关闭其余微镜，……依此类推，微镜按编号1、2、3、……L²逐一处于“开”状态，直至微镜L²处于“开”状态，并保持曝光时间的L²分之一；d）直到所有各类微镜开启一遍后，同步关闭所有微镜，摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。

所述数字微镜器件DMD的每个微镜，均有两种工作角度±12^o；定义其中一个角度如+12^o为“开”状态，则-12^o为“关”状态；所述的M可根据需要选定，改变M的大小，等效于调整针孔的密度，M越大，分辨率越高，速度会较慢，M越小，速度会较快，但分辨率越低；所述的N可根据需要选定，改变N的大小，等效于调整针孔尺寸，N越大，针孔越大，速度会较快，但分辨率越低，N越小，针孔越小，分辨率越高，但速度会较慢。

如图1、2、3所示，一种共聚焦显微图像的获取装置，包括光源1、照明透镜2、分光分色片3、数字微镜器件DMD4、物镜5、成像透镜7、摄像头8、DMD控制器9和计算机10，光源1经照明透镜2会聚后穿过分光分色片3，经数字微镜器件DMD 4反射后进入物镜5，最后照射在样品6上，样品受激发后发出荧光，沿反方向经物镜5放大后成像在数字微镜器件DMD 4上，由于荧光的波长大于激发光，再经分光分色片3反射后进入成像透镜7，最后成像在摄像头8上。DMD控制器9与数字微镜器件DMD 4、摄像头8电连接，计算机10与DMD控制器9、摄像头8相互电连接，由计算机10控制数字微镜器件DMD 4和摄像头8同步工作。

所述的光源1，可以选用LED，高压汞灯，高压金卤灯等，不必选用昂贵的激光；

所述的摄像头8，优选的为黑白的高灵敏度且具有外触发功能，如Andor的DC-152Q-FI；

所述的DMD控制器9，优选的带有同步输出功能，如上海辛同信息科技有限公司的XD-D01开发板，其输出同步信号电连接至DC-152Q-FI的外触发信号；

如图2所示，将数字微镜器件DMD 4分割成若干个连续的子块，每个子块包含8×8（即M=8）个微镜，在x和y方向分别以2（即N=2）为基本单位将每个子块的64个微镜分成16（即L=4）个连续次子块，并对16个子块依次按1，2，3… 16编号，即所有的微镜被分成16类：微镜1、微镜2、微镜3…….微镜16；在摄像头曝光期间，依次使这16类微镜分时处于“开”状态。

工作时计算机10根据需要，将曝光时间设定为160ms传送至DMD控制器9，当DMD控制器9接收到计算机10发出的启动命令后，产生一个与曝光时间相等即160ms的同步信号，触发数码摄像头8（DC-152Q-FI）开始曝光的同时，所有微镜1同步动作，处于“开”状态，其余微镜均处“关”状态，保持10ms（160ms/16）；再同步开启所有微镜2，同步关闭其余微镜，保持10ms（160ms/16）；……依此类推，微镜按编号1、2、3、……16逐一处于“开”状态，直至微镜16处于“开”状态，并保持10ms之后，同步关闭所有微镜，同时关闭同步信号，摄像头8停止曝光，由计算机10采集摄像头8获得的图像数据，即可获得一幅全局的共聚焦图像。

数字微镜器件DMD 4的子块分割大小即M、N、L的选择可以根据需要确定，改变M的大小，等效于调整针孔的密度，M越大，分辨率越高，速度会较慢，M越小，速度会较快，但分辨率越低；改变N的大小，等效于调整针孔尺寸，N越大，针孔越大，速度会较快，但分辨率越低，N越小，针孔越小，分辨率越高，但速度会较慢。

图3是数字微镜器件DMD 4子块分割的另一种具体实例，即M=3，N=1，L=3。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种共聚焦显微成像的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：

a）采用一数字微镜器件DMD，置于照明光路和成像光路的共用光路中，同时作为可编程的照明针孔和探测针孔；

b) 将上述数字微镜器件DMD的所有微器件分成若干类，即将数字微镜器件DMD分割成若干个连续的子块，每个子块包含M²个微镜；其中M=N*L，N 为自然数，L为大于或等于2的自然数；在x和y方向分别以N为基本单位，将每个子块的M²个微镜分成L²个连续次子块，并对L²个次子块依次按1，2， 3，…，L²编号，即所有的微镜被分成L²类：微镜1 、微镜2 、微镜3 、……、微镜L²；

c) 设定摄像头的曝光时间，启动数码摄像头曝光的同时，所有微镜1同步动作，处于“开”状态，其余微镜均处“关”状态，保持曝光时间的1/L²后，再同步开启所有微镜2 ，同步关闭其余微镜……依此类推，微镜按编号1 、2 、3 、……、L²逐一处于“开”状态，直至微镜L² 处于“开”状态，并保持曝光时间的1/L²后，同步关闭所有微镜，同时数码摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。

2.根据权利要求1 所述的共聚焦显微成像的获取方法，其特征在于：所述数字微镜器件DMD的每个微镜，均有两种工作角度±12°；定义其中一个角度如+12°为“开”状态，则-12°为“关”状态；所述的M可根据需要选定，改变M的大小，等效于调整针孔的密度，M越大，分辨率越高，速度会较慢，M越小，速度会较快，但分辨率越低；所述的N可根据需要选定，改变N的大小，等效于调整针孔尺寸，N越大，针孔越大，速度会较快，但分辨率越低，N越小，针孔越小，分辨率越高，但速度会较慢。

3.一种共聚焦显微成像的获取装置，其特征在于：包括光源、照明透镜、分光分色片、数字微镜器件DMD、物镜、成像透镜、摄像头、DMD控制器和计算机：在所述分光分色片的透射光轴上依次设置所述光源、照明透镜、分光分色片及数字微镜器件DMD，所述物镜置于所述数字微镜器件DMD与样品之间；在所述分光分色片的反射光轴上依次设置所述分光分色片、成像透镜和摄像头；所述计算机与所述DMD控制器、摄像头分别相互电联接，所述DMD控制器分别电联接摄像头、数字微镜器件DMD，所述摄像头、数字微镜器件DMD在所述计算机的控制下同步工作：

a)将上述数字微镜器件DMD的所有微器件分成若干类，即将数字微镜器件DMD 分割成若干个连续的子块，每个子块包含M²个微镜；其中M=N*L，N 为自然数，L 为大于或等于2 的自然数；在x和y方向分别以N为基本单位，将每个子块的M²个微镜分成L²个连续次子块，并对L²个次子块依次按1，2， 3，…，L²编号，即所有的微镜被分成L²类：微镜1 、微镜2 、微镜3 、……、微镜L²；

b)设定曝光时间，启动数码摄像头曝光的同时，所有微镜1 同步动作，处于“开”状态，其余微镜均处“关”状态，保持曝光时间的1/ L²后，再同步开启所有微镜2，同步关闭其余微镜……依此类推，微镜按编号1 、2 、3 、……、L²逐一处于“开”状态，直至微镜L²处于“开”状态，并保持曝光时间的1/ L²后，数码摄像头停止曝光，即可获得一幅共聚焦图像。