CN111024659A - 一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法和装置，属于光学超分辨显微技术领域，包括：将其中一束激光在二维扫描振镜系统的调制下投射到待测样品上进行二维扫描；使用探测器阵列收集所述待测样品在二维扫描过程中发出的荧光信号，并对外围探测器收集的信号移回中心，将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强I1(x，y)，其中x、y为样品上扫描点的二维坐标；对另外一束激光进行相位调制；获得并行探测荧光信号光强I2(x，y)；将两侧扫描获得的并行探测荧光信号光强进行迭代计算得到有效信号光强I(x，y)。利用荧光激发的非线性效应来扩展成像系统的有效空间频率带宽，从而实现了更高的分辨率。

Description

一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法和装置
技术领域
本发明涉及光学超分辨显微技术领域，具体地说，涉及一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法和装置。
背景技术
共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术，目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中，成为现代生物学微观研究的重要工具。
共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种。共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势，可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。
自1990年激光共聚焦显微系统问世，共聚焦成像已成为荧光显微镜成像领域的通用技术。其在基础生物医学和材料学等领域研究中的广泛应用主要归因于它们能够产生高对比度，光学切片图像，同时提供足够的采集多功能性以满足许多样品和应用需求。
随着生物研究的不断深入，对样品细微结构的研究需求，对光学显微镜的分辨率提出了更高的要求，促使了一系列超分辨显微成像技术的发展，如受激发射损耗荧光显微技术(STED)、基态耗尽显微技术(GSD)、可逆饱和光转移荧光显微技术(RESOLFT)、随机光学重建显微技术(STORM)等。
人们在过去30年中以共聚焦系统为基础提出了各种各样新的装置和方法，以提高图像分辨率和对比度以及仪器的多功能性。而其中图像扫描显微技术使用一个光纤探测器阵列来代替共聚焦显微成像技术的针孔和单一探测器，利用并行探测的方法来克服普通共聚焦显微技术分辨率和信噪比不能两全的缺陷，同时具备普通共聚焦显微技术中小针孔的分辨率优势与大针孔的收集效率，可以在保持高分辨率的前提下提高图像的信噪比。但是图像扫描显微技术的分辨率极限为衍射极限的两倍，因此在显微成像时，对于更细微(低于一百纳米)的结构和生理活动便无法分辨出来。
发明内容
本发明的目的为提供一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法，该方法可以显著提高图像扫描显微技术的分辨率。
本发明的另一目的为提供一种基于并行探测的多图像重建显微成像装置，该装置可以用于实现上述方法。
为了实现上述目的，本发明提供的基于并行探测的多图像重建显微成像方法包括以下步骤：
步骤(1)，将激光光束进行分束，其中一束激光在二维扫描振镜系统的调制下投射到待测样品上进行二维扫描；
步骤(2)，使用探测器阵列收集所述待测样品在二维扫描过程中发出的荧光信号，并对外围探测器收集的信号移回中心，将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强I1(x，y)，其中x、y为样品上扫描点的二维坐标；
步骤(3)，对另外一束激光进行相位调制；并重复步骤(2)，获得并行探测荧光信号光强I2(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标；
步骤(4)，将两侧扫描获得的并行探测荧光信号光强进行迭代计算得到有效信号光强I(x，y)。
上述技术方案中，激光分束后，将其中一束投射在待测样品上进行二维扫描；使用探测器阵列收集待测样品发出的荧光信号，并将外围探测器收集到的信号移回中心，再将所有图像加起来后进行归一化处理获得非饱和实心光斑的并行探测荧光信号光强；对另外一束激光束进行相位调制后转换为圆偏振光，重复上述步骤获得饱和空心光斑的并行探测荧光信号光强；最后，将两次扫描获得的并行探测荧光信号光强迭代计算重建得到有效信号光强，从而实现更高的分辨率。
为了使投射到样品上的光斑光强分布的均匀性更好，作为优选，步骤(1)中，采用激光器发射激光，对激光光束进行准直后再进行分束；分束后的两束激光均采用四分之一波片转换为圆偏振光。
作为优选，步骤(2)中激光光束为非饱和高斯光束，步骤(3)中经调制后的激光光束为饱和空心光束。
作为优选，步骤(1)中采用分束器对激光光束进行分束，所述分束器的分光比为3：10，即非饱和高斯光束与饱和空心光束的光强比为3：10。
作为优选，步骤(4)中，迭代模型为
Figure BDA0002293817060000031
其中，Ik(x，y)为在第k-1次迭代后估计的有效信号光强，F-1和F分别表示逆傅里叶变换和傅立叶变换，*是共轭算子，OTF1和OTF2分别是并行探测荧光信号光强I1(x，y)和I2(x，y)对应的光学传递函数。
作为优选，迭代次数k为200次。
为了实现上述另一目的，本发明的基于并行探测的多图像重建显微成像装置包括发出激光光束的激光器，激光光束的光路上设有将激光光束分为实心光束光路和空心光束光路的第一分束器，还设有用于产生荧光的显微系统和用于收集荧光信号的探测系统。
作为优选，实心光束光路上设有用于控制激光光束是否通过的第一光快门，以及用于将通过第一光快门的激光光束调制为实心圆偏振光的第一1/4波片；
空心光束光路上设有用于控制激光光束是否通过的第二光快门，用于将通过第二光快门的激光光束调制为空心光束的涡旋位相板，以及用于将经过相位调制的空心光束调制为圆偏振光的第二1/4波片。
作为优选，显微系统包括：
将实心光束和空心光束进行合束的第二分束器；
用于反射合束后的激光光束并透射荧光信号的二色镜；
用于改变圆偏光的方位角并偏转光路，从而对样品进行二维扫描，并改变荧光的方位角并偏转光路，从而解扫描的扫描振镜；
用于消除经过扫描振镜后的圆偏光的畸变，并将经过场镜的荧光准直和缩束，使振镜和物镜入瞳面共轭的扫描透镜；
用于将经过扫描透镜的圆偏光准直和扩束，使振镜和物镜入瞳面共轭，并将经过物镜的荧光聚焦的场镜；
用于将经过场镜准直后的圆偏光聚焦从而扫描样品，并收集样品发出荧光信号的物镜；
以及用于放置待测样品的样品台。
作为优选，探测系统包括：
用于滤除二色镜透射的杂散光的滤光片；
用于将经过滤光片的荧光光束聚焦到多模光纤阵列上的聚焦透镜；
用于空间滤波的针孔；
用于采集荧光信号的探测器阵列。
所述多模光纤阵列中的多模光纤与探测器阵列一一对应。
优选的，所述的多模光纤阵列包括呈中心多模光纤，以及环列在中心多模光纤外的至少两层排列呈环形的多模光纤。探测器阵列由雪崩光电二极管(APD)组成。物镜的数值孔径(NA)为1.4。多模光纤阵列的有效直径约为一个爱里斑大小。多模光纤阵列中单根光纤的内径约为0.2个爱里斑大小。第一分束器的分光比为3：10，即第一激光光束和第二激光光束的光强比为3：10。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以图像扫描显微技术为基础，利用非线性效应扩展成像系统的有效空间频率带宽，将不同光斑照明下的并行探测结果重建成一张分辨率更高的超分辨图像，从而实现了更高的分辨率。
附图说明
图1为本发明实施例中基于并行探测的多图像重建显微成像装置的结构示意图；
图2为本发明实施例中多模光纤阵列的结构示意图；
图3为普通共聚焦显微系统对23nm荧光颗粒的成像结果，左下角插图为图3内白色方框区域的放大图；
图4为图像扫描显微系统对23nm荧光颗粒的成像结果，左下角插图为图4内白色方框区域的放大图；
图5为本发明实施例中基于并行探测的多图像重建显微成像装置对23nm荧光颗粒的成像结果，左下角插图为图5内白色方框区域的放大图；
图6为图3、图4和图5上沿白色虚线处的信号强度分布曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。
实施例
参见图1，本实施例中基于并行探测的多图像重建显微成像装置包括：激光器1，单模光纤2，准直透镜3，1/2波片4，第一分束器5，第一光快门6，第一1/4波片7，第一反射镜8，第二光快门9，涡旋位相板10，第二1/4波片11，第二反射镜12，第二分束器13，二色镜14，二维扫描振镜系统15，扫描透镜16，场镜17，第三反射镜18，物镜19，样品台20，滤光片21，聚焦透镜22，针孔23，光纤阵列24，探测器阵列25，计算机26。
以上装置主要分为五部分：产生激光束的照明系统、实心光束光路，空心光束光路，产生荧光的显微系统，收集荧光信号的探测系统以及处理器，本实施例的处理器为计算机26。
其中，激光器1，单模光纤2，准直透镜3，1/2波片4，第一分束器5依次设置在照明系统的光轴上；
第一光快门6，第一1/4波片7，第一反射镜8依次设置在实心光束光路的光轴上；
第二光快门9，涡旋位相板10，第二1/4波片11，第二反射镜12依次设置在空心光束光路的光轴上；
第二分束器13，二色镜14，二维扫描振镜系统15，扫描透镜16，场镜17，第三反射镜18，物镜19，样品台20依次设置在显微系统的光轴上；
滤光片21，聚焦透镜22，针孔23，光纤阵列24，探测器阵列25依次设置在探测系统的光轴上；
计算机26用于控制激光器的开关和光强调节，第一光快门6和第二光快门9的开关，二维扫描振镜系统13的扫描以及探测器阵列22的信号采集；
采用图1所示的装置，使用并行探测荧光发射差分显微的方法如下：
1)激光器1发出激光光束(本实施例采用波长为635nm的红光作为激发光)被耦合进单模光纤2，再从单模光纤2出射后被准直透镜3准直，使用1/2波片4调节偏振，再通过第一分束器5分为光强比为3：10的两束光。
2)打开第一光快门6并关闭第二光快门9，第一激光束通过第一1/4波片7调制为圆偏振光，再被第一反射镜8反射至第二分束器13，最后透过二色镜14到达二维扫描振镜系统15。
3)二维扫描振镜系统15改变入射的圆偏光的方位角并偏转光路，二维扫描振镜系统出射的圆偏光经过扫描透镜16后消除畸变，再经过场镜17的准直和扩束，被第三反射镜18反射到物镜19上，最后通过物镜19被聚焦到样品台20上的待测样品上激发出荧光信号。
4)样品台20上的待测样品发射的荧光信号被物镜19收集，之后被第三反射镜18反射到场镜上，再经过场镜17的聚焦和扫描透镜16的准直到达扫描振镜系统15，解扫描后被二色镜14透射至滤光片21，滤除杂散光后被聚焦透镜20聚焦，再经过针孔的空间滤波，最后到达多模光纤阵列21。多模光纤阵列排列方式如图2所示，其中每个小圆代表一根多模光纤，并与一个探测器相连，其直径约为0.2个爱里斑，整个多模光纤阵列的直径约为1个爱里斑。使用探测器阵列22收集荧光，并用计算机23将外围探测器收集的信号移回中心，再将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强I1(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标。
5)关闭第一光快门6并打开第二光快门9，第二激光束被涡旋位相板10调制为空心光束，再通过第二1/4波片11调制为圆偏振光，然后被第二反射镜12反射至第二分束器13，最后透过二色镜14到达二维扫描振镜系统15。
7)重复步骤3)和步骤4)，再次获得并行探测荧光信号光强I2(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标。
8)将两侧扫描获得的并行探测荧光信号光强进行迭代计算得到有效信号光强I(x，y)，迭代模型为
Figure BDA0002293817060000071
其中，Ik(x，y)为在第k-1次迭代后估计的有效信号光强，F-1和F分别表示逆傅里叶变换和傅立叶变换，*是共轭算子，OTF1和OTF2分别是并行探测荧光信号光强I1(x，y)和I2(x，y)对应的光学传递函数。第一个估计值I1(x，y)为并行探测荧光信号光强I1(x，y)或I2(x，y)，一般为I1(x，y)。
图3、图4和图5分别显示了采用普通激光共聚焦显微系统，图像扫描显微系统和本实施例的基于并行探测的多图像重建显微成像装置对23nm荧光颗粒的显微成像结果。从左下角的局部放大图可以清晰地看出本实施例能够将普通激光共聚焦显微系统和图像扫描显微系统不能分辨出来的两份荧光颗粒完全分辨出来。图6显示的图3、图4和图5中沿白色虚线处的图光强分布曲线(其中，“共焦”表示图3的普通激光共聚焦显微系统结果，“图像扫描”表示图像扫描显微系统结果，“本发明”表示本实施例的基于并行探测的多图像重建显微成像装置结果)也表明本发明具有远小于图像扫描显微系统的半高全宽，也就是说具有更高的分辨率。
以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)，将激光光束进行分束，其中一束激光在二维扫描振镜系统的调制下投射到待测样品上进行二维扫描；
步骤(2)，使用探测器阵列收集所述待测样品在二维扫描过程中发出的荧光信号，并对外围探测器收集的信号移回中心，将所有图像加起来后进行归一化处理获得并行探测荧光信号光强I1(x，y)，其中x、y为样品上扫描点的二维坐标；
步骤(3)，对另外一束激光进行相位调制；并重复步骤(2)，获得并行探测荧光信号光强I2(x，y)，其中x，y为样品上扫描点的二维坐标；
步骤(4)，将两侧扫描获得的并行探测荧光信号光强进行迭代计算得到有效信号光强I(x，y)。
2.根据权利要求1所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，步骤(1)中，采用激光器发射激光，对激光光束进行准直后再进行分束；分束后的两束激光均采用四分之一波片转换为圆偏振光。
3.根据权利要求1所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，步骤(2)中激光光束为非饱和高斯光束，步骤(3)中经调制后的激光光束为饱和空心光束。
4.根据权利要求3所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，步骤(1)中采用分束器对激光光束进行分束，所述分束器的分光比为3：10，即非饱和高斯光束与饱和空心光束的光强比为3：10。
5.根据权利要求1所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，步骤(4)中，迭代模型为
Figure FDA0002293817050000021
其中，Ik(x，y)为在第k-1次迭代后估计的有效信号光强，F-1和F分别表示逆傅里叶变换和傅立叶变换，*是共轭算子，OTF1和OTF2分别是并行探测荧光信号光强I1(x，y)和I2(x，y)对应的光学传递函数。
6.根据权利要求5所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法，其特征在于，迭代次数k为200次。
7.一种用于实现权利要求1～6中任一权利要求所述的基于并行探测的多图像重建显微成像方法的装置，包括发出激光光束的激光器，其特征在于，所述激光光束的光路上设有将激光光束分为实心光束光路和空心光束光路的第一分束器，还设有用于产生荧光的显微系统和用于收集荧光信号的探测系统。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的实心光束光路上设有用于控制激光光束是否通过的第一光快门，以及用于将通过第一光快门的激光光束调制为实心圆偏振光的第一1/4波片；
所述的空心光束光路上设有用于控制激光光束是否通过的第二光快门，用于将通过第二光快门的激光光束调制为空心光束的涡旋位相板，以及用于将经过相位调制的空心光束调制为圆偏振光的第二1/4波片。
9.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的显微系统包括：
将所述实心光束和空心光束进行合束的第二分束器；
用于反射合束后的激光光束并透射所述荧光信号的二色镜；
用于改变圆偏光的方位角并偏转光路，从而对样品进行二维扫描，并改变荧光的方位角并偏转光路，从而解扫描的扫描振镜；
用于消除经过扫描振镜后的圆偏光的畸变，并将经过场镜的荧光准直和缩束，使振镜和物镜入瞳面共轭的扫描透镜；
用于将经过扫描透镜的圆偏光准直和扩束，使振镜和物镜入瞳面共轭，并将经过物镜的荧光聚焦的场镜；
用于将经过场镜准直后的圆偏光聚焦从而扫描样品，并收集样品发出荧光信号的物镜；
以及用于放置待测样品的样品台。
10.根据权利要求7所述的装置，其特征在于，所述的探测系统包括：
用于滤除二色镜透射的杂散光的滤光片；
用于将经过滤光片的荧光光束聚焦到多模光纤阵列上的聚焦透镜；
用于空间滤波的针孔；
用于采集荧光信号的探测器阵列。
所述多模光纤阵列中的多模光纤与探测器阵列一一对应。
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