CN112835190A - 基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统 - Google Patents

基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统。其特征是：该装置光操控部分由两条输出端面加工成特定角度的两芯光纤相向安装组成。激光光束分别经单模光纤耦合进一条两芯光纤，在输出端面附近形成聚焦光场，稳定捕获待测细胞。通过调节另一条两芯光纤各纤芯的输出功率，使细胞绕特定轴线旋转。细胞每旋转至一定角度并达到稳定状态后，利用动态散斑照明宽场荧光显微技术获取细胞的层析图像，最终重构细胞的三维结构图像。本发明构建的系统可实现获取活体单细胞高时间和空间分辨率的三维结构图像，具有结构简单、造价低廉、操作简便等特点，在生物学、医学和生命科学等众多研究领域中具有广泛的应用前景。

Description

基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统，可用于活体单细胞三维结构的高时间分辨率、高空间分辨率成像，属于生物光子学领域。
(二)背景技术
细胞是生命结构和功能的基本单位，对细胞的深入研究是揭示生命现象奥秘、改造生命和克服疾病的关键。通过对单细胞进行分析研究，可以研究大量细胞群体时观察不到的现象和机制。一方面，生命系统存在着不同的层次，生物科学要研究各个不同层次的生命系统及其相互关系，首先要研究的就是细胞。另一方面，生物体中绝大部分反应都是在细胞内进行的，如果不弄清楚细胞的基本结构、功能和种类，那么其他的研究就很难进行。
如何在保持细胞活性的条件下来研究细胞的各种生理特性是当下的一个热门课题。通过对活细胞的研究观察，可以观察到在保持活性状态下某些特有的现象，也有助于从细胞层面来解决问题，这就对细胞活性提出了条件。为了更好的对细胞进行更深入的了解，构建一个维持细胞活性的装置具有深远的意义。
激光扫描共焦显微镜是一种性能良好的光学显微成像工具，在生命科学研究中获得了广泛的应用。它与普通的宽场荧光显微成像方法相比，共焦荧光显微镜的优点在于能够获得一定厚度样品的三维层析图像，可提供较高的时间和空间分辨率。但是这种显微成像方法需要对一个或多个照明点进行扫描，需要三维扫描系统，从而使系统复杂且成像速度较慢。为了提高成像速度，提出了多种非扫描的宽场显微成像技术，比如结构光照明显微成像技术。但是在结构光照明显微成像技术中，由于样品对结构光的散射会降低图像的对比度，所以结构光显微成像技术不太适合用于对厚组织成像。近年来，一种利用散斑照明来提供深层层析分辨能力的荧光显微成像新技术得到了快速发展。这种成像技术能获得高的时间和空间分辨率三维结构图像，具有成像速度快、设备简单、成本低廉等优点。
在宽场显微成像技术中，为了获得不同层面的层析图像，仍需要调整照明系统以便获得层析图像。光镊技术是一种可以稳定捕获待测活体单细胞，并对其实现操控的有力工具。传统的光镊系统需要使用大数值孔径物镜在焦点处形成强的光势阱从而实现细胞的捕获和操控，系统体积庞大、灵活性差、造价昂贵，并且在使用过程中受到许多因素，如工作距离和基片兼容性的限制。基于光纤实现的光纤光操控技术对基片材料或厚度没有任何要求，可以灵活地在介质中任意移动，且体积小、可操作性强，具有很高的可集成度。近年来,基于光纤的光操控技术已经实现了对细胞的捕获、移动、旋转和运输,这些技术被广泛应用在细胞分析、疾病诊断等过程中。
本发明涉及的是一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明的宽场荧光显微成像方法和系统。利用相向安装的两条特殊设计的双芯光纤精准操控细胞，使其绕特定轴线旋转。当细胞旋转至每一个角度并达到稳定状态后，使用动态散斑照明的宽场荧光显微成像技术获取细胞的层析图像。通过获得不同角度上的细胞层析图像，最终重构细胞整体的三维结构图像。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单紧凑，具有高时间分辨率、高空间分辨率等成像优点的一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统。
动态散斑照明显微成像系统它由激光光源1、13、26；透镜2、3、6、7、 16、17、21、22；散射体4；微位移台5；5/5分束镜14、24；反射镜15、25；单模光纤30、31、32、33；光纤耦合器27、28；双芯光纤18、20；渐变衰减片 23、29；复消色差显微物镜12；双色镜11；滤光片10；待测细胞19；CMOS相机8；成像镜头9组成。所述系统中，激光光源1输出的激光光束经透镜2和3扩束后，经散射体4形成散斑图案。经透镜6和7扩束后，经双色镜11反射，在复消色差显微物镜12的后焦平面上形成散斑图案的像，在待测细胞上形成全场照明。通过移动微位移台5来改变散射体4的位置，使投射在待测细胞19上的散斑图案发生变化。激光光源13输出的激光经5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、 31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25和渐变衰减片 23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、33。单模光纤32、33经光纤耦合器28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。调节渐变衰减片 23、29控制待测细胞19绕特定轴线旋转。
散斑照明样品时，在样品上激发产生对应的一系列荧光信号，这些荧光经过复消色差显微物镜12、双色镜11、滤光片10、镜头9后成像于CMOS相机8上。这些荧光信号主要有两个来源：一是产生复消色差显微物镜12焦平面内的荧光信号，另一个是产生于复消色差显微物镜12焦平面外的背景荧光信号。假如散斑所照明的地方都能激发出荧光，且荧光强度正比于激发光强度。在宽场荧光显微镜中，当物后焦平面处与CMOS相机8平面满足物像共轭面时，若不考虑光学元件口径尺寸的限制，共轭面的物像关系的点扩散函数为函数，物后焦平面处的物体清晰地成像于CMOS相机8平面，非物后焦平面与CMOS相机8 平面不是物像共轭面，它们的物像关系的点扩散函数不是函数，因此，非物后焦平面的物体弥散而模糊地成像于CMOS相机8平面。因此，随着照明散斑的变化，CMOS相机8探测到的来自复消色差显微物镜12焦平面内的荧光信号强度发生剧烈变化，而在复消色差显微物镜12焦平面外的荧光信号强度变化缓慢，这种信号变化特征是实现层析的基础，根据这种信号变化特征，利用下面的算法能够提取该层面的荧光信号，实现样品的层析成像。
Figure BDA0002882887230000031
式中，N为图像序列中图像数，为第i幅图像的强度，为采集得到N幅图像的均方根图像，也就是层析成像，N一般取40-60。
若以高斯-洛伦兹近似表示探测和照明的点扩展函数，则散斑图案变化时，在CCD探测器探测面上的每一个像素的强度变化均方值RMS可以表示为
Figure BDA0002882887230000032
式中，
Figure BDA0002882887230000033
NA为物镜数值孔径，
Figure BDA0002882887230000034
Zc为轴向离焦距离， C为荧光团的浓度。RMS反映了该系统具有层析分辨能力，类似于共焦显微镜的层析能力。增大显微镜的数值孔径，将有利于改善层析显微镜的纵向分辨能力。
光操控系统由激光光源13、26；透镜16、17、21、22；5/5分束镜14、 24；反射镜15、25；单模光纤30、31、32、33；光纤耦合器27、28；双芯光纤 18、20；渐变衰减片23、29组成。激光光源13输出的激光经5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25 和渐变衰减片23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、33。单模光纤32、 33经光纤耦合器28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。通过调节渐变衰减片23、29改变双芯光纤20各纤芯的输出功率，从而改变输出端聚焦光场强度分布，控制待测细胞绕特定轴线旋转。
(四)附图说明
图1是一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统的结构示意图。
图2是光操控系统主视图(a)、侧视图(b)的结构示意图。
图3是细胞三维结构成像的原理示意图。细胞每旋转至特定角度并达到稳定状态后，利用动态散斑照明宽场荧光显微技术获取活体单细胞的高分率层析结构图像，通过不断地旋转细胞来恢复出细胞的三维结构图像。
附图标记说明：1-激光光源；2-透镜；3-透镜；4-散射体；5-微位移台； 6-透镜；7-透镜；8-CMOS相机；9-镜头；10-滤光片；11-双色镜；12-复消色差显微物镜；13-激光光源；14-分束镜；15-反射镜；16-透镜；17-透镜；1-双芯光纤； 19-细胞；20-双芯光纤；21-透镜；22-透镜；23-渐变衰减片；24-分束镜；25-反射镜；26-激光光源；27-光纤耦合器；28-光纤耦合器；29-渐变衰减片；30-单模光纤；31-单模光纤；32-单模光纤；33-单模光纤。
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统。激光光源1输出的激光光束经透镜2和3扩束后，经散射体4形成散斑图案。经透镜6 和7扩束后，经双色镜11反射，在复消色差显微物镜12的后焦平面上形成散斑图案的像，在待测细胞上形成全场照明。通过移动微位移台5来改变散射体4的位置，使投射在待测细胞19上的散斑图案发生变化。激光光源13输出的激光经 5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25和渐变衰减片23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、 33。单模光纤32、33经光纤耦合器28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。调节渐变衰减片23、29控制待测细胞19绕特定轴线旋转。
系统中，激光光源13输出的激光经5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25和渐变衰减片23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、33。单模光纤32、33经光纤耦合器 28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。通过调节渐变衰减片23、 29改变双芯光纤20各纤芯的输出功率，从而改变输出端聚焦光场强度分布，控制待测细胞绕特定轴线旋转。
系统中，激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体 4上形成散斑图案，再经过透镜6和7扩束，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在待测细胞 19上形成全场照明。当待测细胞19在光场控制下旋转至特定角度并达到稳定状态时，通过移动微位移台5来改变散射体4的位置，使投射在待测细胞19上的散斑图案发生变化。不同散斑图案激发产生的荧光信号由显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除背景噪声，由成像镜头9和CMOS相机8同步记录多幅荧光图像。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的荧光层析图像。通过改变光场强度分布控制细胞绕轴线连续旋转，从而获取整个待测细胞的三维结构荧光图像。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.一种基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统，其特征是：所述系统由光操控系统和动态散斑照明显微成像系统两部分组成。所述系统主要由激光光源1、13、26；透镜2、3、6、7、16、17、21、22；散射体4；微位移台5；5/5分束镜14、24；反射镜15、25；单模光纤30、31、32、33；光纤耦合器27、28；双芯光纤18、20；渐变衰减片23、29；复消色差显微物镜12；双色镜11；滤光片10；待测细胞19；CMOS相机8；成像镜头9组成。所述系统中，激光光源1输出的激光光束经透镜2和3扩束后，经散射体4形成散斑图案。经透镜6和7扩束后，经双色镜11反射，在复消色差显微物镜12的后焦平面上形成散斑图案的像，在待测细胞上形成全场照明。通过移动微位移台5来改变散射体4的位置，使投射在待测细胞19上的散斑图案发生变化。激光光源13输出的激光经5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25和渐变衰减片23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、33。单模光纤32、33经光纤耦合器28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。调节渐变衰减片23、29控制待测细胞19绕特定轴线旋转。
2.根据权利要求1所述的基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统。光操控系统主要由激光光源13、26；透镜16、17、21、22；5/5分束镜14、24；反射镜15、25；单模光纤30、31、32、33；光纤耦合器27、28；双芯光纤18、20；渐变衰减片23、29组成。激光光源13输出的激光经5/5分束镜14分成两束，一束经透镜16，一束经过反射镜15再经过透镜17，分别耦合进两条单模光纤30、31。单模光纤30、31经光纤耦合器27与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤18耦合，实现待测细胞19的稳定捕获。激光光源26通过分束镜24分成两束光，一束经渐变衰减片29，再经过透镜21，另一束经反射镜25和渐变衰减片23，再经透镜22，分别耦合进两条单模光纤32、33。单模光纤32、33经光纤耦合器28与一条输出端面加工成特定角度的双芯光纤20耦合。通过调节渐变衰减片23、29改变双芯光纤20各纤芯的输出功率，从而改变输出端聚焦光场强度分布，控制待测细胞绕特定轴线旋转。
3.根据权利要求1所述的基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统。动态散斑照明宽场荧光显微成像系统主要由激光光源1；透镜2、3、6、7；散射体4；微位移台5；复消色差显微物镜12；双色镜11；滤光片10；待测细胞19；CMOS相机8；成像镜头9组成。所述系统中激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体4上形成散斑图案，再经过透镜6和7扩束，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在待测细胞19上形成全场照明。当待测细胞19在光场控制下旋转至特定角度并达到稳定状态时，通过移动微位移台5来改变散射体4的位置，使投射在待测细胞19上的散斑图案发生变化。不同散斑图案激发产生的荧光信号由显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除背景噪声，由成像镜头9和CMOS相机8同步记录多幅荧光图像。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的荧光层析图像。通过改变光场强度分布控制细胞绕轴线连续旋转，从而获取整个待测细胞的三维结构荧光图像。
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