CN113514443A - 基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。其特征是：该装置光操控部分由三台激光器组成。一台激光光束完成对细胞的稳定捕获，另一台激光器经过声光调制器产生不同的偏转角度，由显微物镜聚焦交替照射到被捕获细胞两端，实现细胞旋转角度的精准主动光操控。细胞每旋转至不同角度并达到稳定状态后，第三台激光器产生动态散斑，激发照明层面内的荧光团，获取细胞的层析图像，最终重构细胞的三维结构图像。本发明构建的系统可实现活体单细胞高时间和高空间分辨率的三维结构成像，具有结构简单、成本低、易操作、非侵入等特点，在生物学、医学和生命科学等许多研究领域中都具有广阔的应用前景。

Description

基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统
(一)技术领域
本发明涉及的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统，可用于活体单细胞的捕获与控制和三维结构的高时间分辨率、高空间分辨率成像，属于生物光镊、生物成像领域。
(二)背景技术
细胞，是生物体的结构和功能的基本单位，也是生命活动的基本单位。细胞能够通过分裂而增殖，是生物体个体发育和系统发育的基础。细胞或是独立的作为生命单位，或是多个细胞组成细胞群体或组织、或器官，系统和整体；细胞是遗传的基本单位，并具有遗传的全能性。除病毒的所有生物，都由细胞构成。
随着对生命活动本质逐渐深入的探索，人们希望通过对细胞内部结构进行更加细致的观察，从而逐步获得对细胞结构和功能更清晰的认识。通过研究细胞可以研制生物药剂和其他生物产品。如应用细胞工程和基因工程技术已可以大量生产纯度很高的蛋白质制剂，有各种抗体、受体、生长因子、细胞因子、血液因子、神经递质，这些产品已商品化，广泛应用于医学诊断和治疗实践。基因组学和蛋白质组学的研究的快速进展，必将促进生物制剂产业更快地发展，取得更大的经济效益。
目前，许多关于细胞的实验都需要在保持细胞活性的条件下进行。保持细胞的生物活性不仅可以观察到只有在活性条件下的特有生物现象，还有助于人们更好的了解细胞的内部结构和运行方式。因此，保持细胞活性具有深远的意义。
在探究人类健康和疾病相关的细胞学基础是观察细胞，因此从时空和分子层面研究感兴趣的细胞十分关键。显微成像是细胞生物学中的一个非常重要的工具，它能够在样本的结构环境中详细研究样本，也可以分析细胞器和大分子。如果想要充分扩展自己的研究成果并获得高质量的数据，选择合适的显微成像方法将十分重要。目前的医学研究对显微镜的分辨率、精度的要求都很高，越是复杂的研究就越需要高性能的实验仪器，近几年，生物成像领域始终使研究的热门，日新月异的新技术使得实验方法也多种多样。
传统的宽场荧光显微镜通过物镜将激发光聚集，同时收集样品的荧光信号成像。通过照明方式可以得出，虽然焦平面上的光最强，但其上下的样品也会被照亮，导致了引入额外的光毒性，影响样品生物活性，甚至造成细胞死亡和成像焦平面以外的干扰信号进入图像，导致图像分辨率和反差降低。激光扫描共聚焦显微镜使用点扫描的方法，通过在探测端引入针孔，滤除了焦平面以外的杂散光，使分辨率，特别是纵向的分辨率得到了提升，能够实现三维成像。但是，当激发光聚焦时，仍然会照亮上下区域。由于使用点扫描方式成像，为达到较快的速度，光束照射每个点的时间很短，成像元件的量子效率又很低，需要更强的激发功率。与传统的宽场荧光显微镜相比，光漂白和光毒性更加严重。双光子激光扫描显微镜可以大大减少光毒性的损害。由于使用近红外激光照明，对活体样品的光毒性大大降低，并且能够穿透更深的样品。但是，双光子的信号很弱，采集速度非常慢，不适合大样品动态成像，而且成本也十分昂贵，限制了其应用范围。
随着成像技术的不断发展，具有深层层析分辨能力，采用宽场的动态散斑显微成像方法得到了广泛的应用。该技术具有成像速度快、具有高时间和高空间分辨率、无需外源标记、结构简单、成本低廉等优点。
动态散斑显微成像技术具有层析分辨的能力，为了获得待测物体的三维立体结构需要获得多层的层析图像，这就需要不断调整显微镜的聚焦位置，操作不方便。本发明则是利用不断改变待测细胞的光场强度来调整待测细胞的位置并进行成像，操作简单。动态散斑照明宽场荧光显微镜经过多年的发展，成像速度和分辨率已经满足大多数的实验要求，不容忽视的还有对样品的操控和固定的方式。对样品的固定也对成像有很大的影响，在动态散斑照明宽场荧光显微成像系统中，为了获取细胞完整的三维结构图像，需要对细胞进行旋转或移动，才能采集到细胞不同层面的完整的信息。现在的技术最多使用的是加入微位移台来控制待测细胞的轴向移动；或者是通过移动光片，通过对样本细胞扫来实现对细胞的层析成像。
本发明涉及的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。利用特殊设计的空间光精准操控细胞，使其绕特定轴线旋转。当细胞旋转至每一个角度并达到稳定状态后，使用动态散斑照明的宽场荧光显微成像技术获取细胞的层析图像。通过获得不同角度上的细胞层析图像，最终重构细胞整体的三维结构图像。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种成像速度快、时间和空间分辨率高、结构简单、无需外源标记、非侵入等成像优点的一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。
在动态变化的散斑图案照明的宽场荧光显微系统中，当激光束通过一个不断改变的散射体5时，会在复消色差显微物镜12的后焦面形成一系列随机变化的散斑图案，这些散斑图案用来照明待测细胞23。待测细胞23受激发后产生的荧光信号分为两个来源，一个是来自复消色差显微物镜12视场焦平面上的荧光信号，另一个则是来自于复消色差显微物镜12视场焦平面以外的背景荧光信号。随着照明散斑图案的改变，散斑照明产生的散粒状分布的荧光强度在复消色差显微物镜12焦平面内发生剧烈变化，而在视场焦平面外的地方却变化缓慢，这种信号特征是实现层析成像的基础。通过CMOS相机8记录待测细胞23特定层上一系列变化的散斑图案，利用特殊的算法能够提取该层面的荧光信号，从而具有层析成像功能。
Figure BDA0003157615770000031
式中，N为图像序列中图像数，Ii为第i幅图像的强度，IRms为采集得到N幅图像的均方根图像，也就是层析成像，N一般取50-60就可以得到比较清晰的荧光层析图像。
当待测样品被动态散斑照射时，细胞内的荧光标记染料被激发并发出荧光，荧光通过检测物镜收集并传送到CMOS相机，实现对细胞的一个薄层成像的效果。为了实现对细胞的固定和操控，本发明加入了光操控系统，可以实现对细胞的精准操控，该光操控装置主要通过声光调制器19来完成。推动时的光功率略大于制动时的光功率，所以随着AOD将激光的角度转换，光功率也应该随之改变，目的是为了给细胞一定的时间旋转。如图2所示的一束光路的作用是推动细胞，使细胞旋转，细胞旋转一定角度后AOD改变光偏转的角度，如图中另一束光路，再细胞另一侧推动细胞，使细胞制动。细胞停止后的一段时间内没有脉冲光的输入，细胞处于静止状态，这段时间用于细胞成像，一段时间后再继续重复上述过程。每控制细胞旋转一次并且待细胞稳定后，CMOS相机就会获取一次细胞其中一层的图像，当细胞经过多次旋转后，可获得细胞多个层面的结构，如图4所示。
动态散斑照明宽场荧光显微成像系统主要由激光光源1；透镜2、3、6、 7；散射体5；微位移台4；复消色差显微物镜12；双色镜11；滤光片10；待测细胞23；成像镜头9；CMOS相机8组成。所述系统中激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体5上形成散斑图案，再经过透镜6和7扩束，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在待测细胞23上形成全场照明。当待测细胞23在光场控制下旋转至特定角度并达到稳定状态时，通过移动微位移台4来改变散射体5的位置，使投射在待测细胞23上的散斑图案发生变化。不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除背景噪声，由成像镜头9和CMOS相机8同步记录多幅荧光图像。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的荧光层析图像。通过改变光场强度分布控制细胞23绕轴线连续旋转，从而获取整个待测细胞23的三维结构荧光图像。
光操控系统主要由激光光源13、18；反射镜22；透镜14、15、20、21；双色镜16；声光偏转器19；复消色差显微物镜17组成。光操控部分由激光器1 分出的捕获光和激光器18发出的经声光偏转器19控制的可偏转的光组成，捕获光的作用是捕获待测细胞，使细胞固定在一个位置，以便于成像和绕固定轴心旋转。激光器18发出的激光进入声光偏转器19，声光偏转器19可以改变激光的角度，通过透镜最后到达细胞的一侧来推动细胞，当细胞转过一定的角度，通过声光调制器19的作用，光线向另一个方向偏转，到达细胞的另一侧来制动细胞，当细胞静止时，CMOS相机8再次收集不同角度的细胞的结构，经过多次重复，最终获取细胞的三维结构。
(四)附图说明
图1是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统的结构示意图。
图2是光操控部分的示意图，展示了捕获光和操控光的结构，该部分由一束固定的光和一束交替产生的激光构成，用来固定细胞和操控细胞。
图3为对操控细胞固定和旋转的光的功率示意图。
图4是对细胞进行成像的方法的示意图，通过图2光操控部分的固定和多次旋转一定的角度，来对细胞的不同层面进行成像。
图5为动态散斑照明宽场荧光显微技术示意图。
附图标记说明：1-激光光源；2-透镜；3-透镜；4-微位移台；5-散射体； 6-透镜；7-透镜；8-CMOS相机；9-成像镜头；10-滤光片；11-双色镜；12-复消色差显微物镜；13-激光光源；14-透镜；15-透镜；16-双色镜；17-复消色差显微物镜；18激光光源；19-声光偏转器；20-透镜；21-透镜；22-反射镜；23-待测细胞。
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。其特征是：所述系统由动态散斑照明显微成像系统和光操控系统两部分组成。它由激光光源1、13、18；透镜2、3、6、7、14、15、20、21；微位移台4；散射体5； CMOS相机8；成像镜头9；滤光片10；双色镜11、16；复消色差显微物镜12、 17；待测细胞23；反射镜22；声光偏转器19组成。所述系统中，激光光源1 输出的激光光束经透镜2、3扩束后，经散射体5形成散斑图案。经透镜6、7 扩束后，经双色镜11反射，在复消色差显微物镜12的后焦面形成散斑图案的像，在待测细胞23上形成全场照明。再通过移动微位移台4来调整散射体5的位置，使投射在待测细胞23上的散斑图案发生变化。通过提取这种不同的图案变化来得到待测细胞23的高时间率和高空间率的层析图像。激光器13输出的激光经透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作为捕获光聚焦在待测细胞23上，实现其稳定捕获待测。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器19的调制频率，使聚焦光束交替聚焦在待测细胞23的两端，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。当细胞旋转至一个角度并达到稳定后，由动态散斑照明显微技术获取照明区域的荧光层析图像。在推动光和制动光的交替作用下，待测细胞23连续转动，实现动态散斑照明在细胞内的快速扫描，从而获取细胞内三维结构的高空间分辨荧光层析图像。
系统中，激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体 5上形成散斑图案，再经过透镜6和7扩束，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在待测细胞 23上形成全场照明。当待测细胞23在光场控制下旋转至特定角度并达到稳定状态时，通过移动微位移台4来改变散射体5的位置，使投射在待测细胞23上的散斑图案发生变化。不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12 收集，经双色镜11和滤光片10消除背景噪声，由成像镜头9和CMOS相机8 同步记录多幅荧光图像。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的荧光层析图像。通过改变光场强度分布控制细胞23绕轴线连续旋转，从而获取整个待测细胞23的三维结构荧光图像。
系统中，激光器18发出的激光进入声光偏转器19，声光偏转器19可以改变激光的角度，通过透镜最后到达细胞的一侧来推动细胞，当细胞转过一定的角度，通过声光调制器19的作用，光线向另一个方向偏转，到达细胞的另一侧来制动细胞，当细胞静止时，CMOS相机8再次收集不同角度的细胞的结构，经过多次重复，最终获取细胞的三维结构。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.本发明提供的是一种基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。其特征是：所述系统由动态散斑照明显微成像系统和光操控系统两部分组成。它由激光光源1、13、18；透镜2、3、6、7、14、15、20、21；微位移台4；散射体5；CMOS相机8；成像镜头9；滤光片10；双色镜11、16；复消色差显微物镜12、17；待测细胞23；反射镜22；声光偏转器19组成。所述系统中，激光光源1输出的激光光束经透镜2、3扩束后，经散射体5形成散斑图案。经透镜6、7扩束后，经双色镜11反射，在复消色差显微物镜12的后焦面形成散斑图案的像，在待测细胞23上形成全场照明。再通过移动微位移台4来调整散射体5的位置，使投射在待测细胞23上的散斑图案发生变化。通过提取这种不同的图案变化来得到待测细胞23的高时间率和高空间率的层析图像。激光器13输出的激光经透镜14、15扩束后，经双色镜16反射耦合进复消色差显微物镜17，作为捕获光聚焦在待测细胞23上，实现其稳定捕获待测。激光器18输出的激光耦合进声光偏转器19，产生具有一定偏转角度的激光光束。经透镜20、21耦合进复消色差显微物镜17。通过交替改变声光偏转器19的调制频率，使聚焦光束交替聚焦在待测细胞23的两端，分别作为推动细胞旋转的转动光和停止细胞旋转的制动光，实现对细胞转动角度的精准主动光操控。当细胞旋转至一个角度并达到稳定后，由动态散斑照明显微技术获取照明区域的荧光层析图像。在推动光和制动光的交替作用下，待测细胞23连续转动，实现动态散斑照明在细胞内的快速扫描，从而获取细胞内三维结构的高空间分辨荧光层析图像。
2.根据权利要求1所述的基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。动态散斑照明宽场荧光显微成像系统主要由激光光源1；透镜2、3、6、7；散射体5；微位移台4；复消色差显微物镜12；双色镜11；滤光片10；待测细胞23；成像镜头9；CMOS相机8组成。所述系统中激光光源1发出的激光光束经透镜2和3扩束后投射到散射体5上形成散斑图案，再经过透镜6和7扩束，经双色镜11反射后在复消色差显微物镜12后焦平面上形成散斑图案的像，经复消色差显微物镜12在待测细胞23上形成全场照明。当待测细胞23在光场控制下旋转至特定角度并达到稳定状态时，通过移动微位移台4来改变散射体5的位置，使投射在待测细胞23上的散斑图案发生变化。不同散斑图案激发产生的荧光信号由复消色差显微物镜12收集，经双色镜11和滤光片10消除背景噪声，由成像镜头9和CMOS相机8同步记录多幅荧光图像。由于散斑照明条件下，焦平面附近激发产生的荧光信号变化最剧烈，利用均方根算法即可提取焦平面附近的荧光层析图像。通过改变光场强度分布控制细胞23绕轴线连续旋转，从而获取整个待测细胞23的三维结构荧光图像。
3.根据权利要求1所述的基于细胞旋转主动光操控技术的散斑荧光显微方法和系统。光操控系统主要由激光光源13、18；反射镜22；透镜14、15、20、21；双色镜16；声光偏转器19；复消色差显微物镜17组成。光操控部分由激光器1分出的捕获光和激光器18发出的经声光偏转器19控制的可偏转的光组成，捕获光的作用是捕获待测细胞，使细胞固定在一个位置，以便于成像和绕固定轴心旋转。激光器18发出的激光进入声光偏转器19，声光偏转器19可以改变激光的角度，通过透镜最后到达细胞的一侧来推动细胞，当细胞转过一定的角度，通过声光调制器19的作用，光线向另一个方向偏转，到达细胞的另一侧来制动细胞，当细胞静止时，CMOS相机8再次收集不同角度的细胞的结构，经过多次重复，最终获取细胞的三维结构。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111521545A (zh) * 2020-05-29 2020-08-11 中山大学 一种完全生物兼容的细胞微马达组装方法和应用
CN112835190A (zh) * 2021-01-04 2021-05-25 桂林电子科技大学 基于双芯光纤光操控和动态散斑照明显微成像方法和系统

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