CN114965470A - 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 - Google Patents
一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114965470A CN114965470A CN202210545129.5A CN202210545129A CN114965470A CN 114965470 A CN114965470 A CN 114965470A CN 202210545129 A CN202210545129 A CN 202210545129A CN 114965470 A CN114965470 A CN 114965470A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dimensional
- spectrum
- imaging
- synthetic aperture
- intensity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 72
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims abstract description 62
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 60
- 238000003325 tomography Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 46
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 24
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 claims description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 3
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 3
- 238000010870 STED microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001093 holography Methods 0.000 description 2
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 2
- 238000010857 super resolution fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，通过采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈，在光强频谱上执行半空间傅里叶滤波或等效的三维希尔伯特变换，结合非干涉合成孔径，从而实现了基于非干涉测量下无需满足匹配照明条件的衍射层析成像。由于固有的合成孔径优势，使得成像分辨率达到非相干成像衍射极限，获得了高分辨率成像结果。采用非干涉测量，成像光路简单，光学路径稳定，成像结果不受散斑和寄生干涉影响，并且可高度兼容传统明场显微镜结构。
Description
技术领域
本发明属于光学显微测量、三维折射率成像技术，特别是一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法。
背景技术
在生物医学显微成像领域，大部分活细胞和未染色的生物标本都是无色透明的，这是因为细胞内各部分细微结构的折射率和厚度不同，当光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化，但这种相位差人眼无法观察。这就需要通过一些化学或者生物手段来对细胞进行染色或标记，从而使其在显微镜下可见。在过去的几十年里，开发了多种荧光显微成像方式，如宽场、共聚焦、全内反射荧光、双/多光子和光片荧光显微镜技术，它们被作为探测非常微弱的信号和揭示固定或活细胞的三维结构和功能特性的强大工具，具有很高的特异性。在这些技术中，附着在特定分子结构上的荧光标记物被短波长激光激发后辐射出长波长荧光，从而可对原本透明的生物样本进行成像。进入21世纪以来，超分辨荧光显微技术突破了衍射极限,将成像分辨率提升至几十纳米，为亚细胞尺度的研究提供了技术手段。目前的超分辨荧光显微成像方法有受激发射损耗显微成像(STED)、结构光照明显微术(SIM)、随机光学重建显微术(STORM)以及光激活定位显微术(PLAM)等。然而，这些技术不适合成像非荧光样品，或可视化不能被荧光分子标记的细胞成分，从而限制了荧光显微技术的应用范围。此外，外源性荧光剂带来的光毒性可能会对细胞活性等细胞功能产生不可逆的负面影响，而相关的光漂白性会在一段较长的时间内阻止活细胞长时间成像。
近年来，为了简化样本制备过程、消除荧光分子对待测样品的干扰并满足临床的成像需求，无标记光学成像成为了生物医学显微成像研究的热点，相衬显微镜利用折射率作为本征光学成像对比度，在不使用外源性标记剂的情况下对生物样品进行无标记成像。其中二维无标记成像，测得的数据只是待测物体沿轴向的光吸收或光程差积累，反映样品信息的折射率与厚度信息相互耦合，无法得到三维信息。为了获得更准确的形态学信息，如体积、形状、干质量等，生物样本的无标记三维成像成为目前研究的一大热门方向。
光学全息术的引入使得测量由样品引起的微小相位差成为可能，促进了相位成像技术从定性观察到定量测量的发展。将光学全息术与计算机断层扫描相结合，通过物体旋转或照明扫描，目前已经开发出了各种光学衍射层析成像方法用以推断生物样品的三维折射率分布。特别是光学衍射层析使三维无标记显微镜成为可能，并已成功应用于研究血细胞、神经元细胞、癌细胞、细菌等各种类型的生物样品。然而，基于干涉的光学衍射层析通常使用时间相干照明光源，使得成像结果中存在散斑噪声，阻碍了高质量图像的形成。此外，它们大多数都需要采用具有复杂光束扫描装置的干涉装置，这妨碍了它们在生物和医学领域的广泛应用。
为了弥补基于干涉测量的光学衍射层析成像方式的缺点和不足，推动三维折射率成像在生物医药领域中的应用，各种基于非干涉测量的层析成像技术在近几年逐渐发展起来。由于采用基于非干涉的测量方式，相机上只有散射场的光强数据被记录，而相位信息完全丢失，因此无论对于二维定量相位成像还是三维衍射层析成像，所有基于聚焦探测的非干涉测量成像方式都需要满足匹配照明条件(照明数值孔径等于物镜数值孔径)，才能实现相位或折射率信息的正确恢复。然而，在实际应用中很难严格实现匹配照明条件，特别是对于高数值孔径显微系统，若采用油浸物镜，则必须借助聚光镜才有可能实现照明条件的匹配。在不满足匹配照明条件的情况下，由于捕获的强度频谱中低频频谱存在重叠，导致无法完整恢复相位分量，也就是说，不能正确恢复样品的三维折射率。所以，如何规避匹配照明条件，即在任意照明下都能实现基于非干涉测量的衍射层析成像，精确重建待测样品的三维折射率分布，并且能达到非相干衍射极限成像分辨率是一大技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，步骤如下：
步骤1，采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈；
步骤2：计算不同入射光照下的三维对数强度谱，并对每个对数强度谱进行三维半空间傅里叶滤波，获得不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场，在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到样品三维散射势频谱的初步估计；
步骤3：对初步估计的频谱进行基于LED离散采样、照明部分相干和修正因子的三维反卷积；
步骤4：采用非负约束和全变分正则化相结合的混合迭代约束算法对合成的散射势频谱中缺失锥信息进行计算填充；
步骤5：对填充后的的三维散射势频谱进行三维傅里叶逆变换，恢复样品的三维折射率分布，实现无标记生物样品实现非侵入式三维成像。
优选地，利用基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像平台采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈，所述光强传输衍射层析显微成像平台包括包括可编程LED阵列、电动位移台扫描装置，待测样品、显微物镜、成像筒镜和相机，可编程LED阵列的圆心和显微物镜光轴重合，被放置在距离样品设置距离的位置，显微物镜的后焦面与筒镜的前焦面重合，相机的成像平面放置在成像筒镜的后焦面位置，成像时样品被放置在电动位移台上，逐个点亮LED单元，准单色平面波照射待测样品，通过物镜，经过成像筒镜汇聚后落在相机的成像平面上，通过控制电动位移台的轴向扫描，利用相机来记录三维光强堆栈。
优选地，步骤2中对不同入射光照下的三维强度堆栈取对数，并进行三维傅里叶变换，得到三维对数强度谱。
优选地，采用散射势函数O(r)来表征样品的三维结构，将散射势函数O(r)展开成实部和虚部的形式，即O(r)＝a(r)+jφ(r)，其中φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位成分和吸收成分；
对不同入射光照下的三维强度堆栈I(r)取对数，表示为：
式中，φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位和吸收，g(r)和g′(r)分别为层析成像系统的点扩散函数和对应的受入射光Uin(r)调制后的点扩散函数，g′*(r)是g′(r)的共轭形式；
通过计算上式的傅里叶变换，得到对数强度谱函数：
式中的
和
分别对应于三维强度堆栈I(r)、散射势O(r)的吸收成分a(r)和相位成分φ(r)的三维傅里叶变换，Ha(u)和Hφ(u)为衍射层析成像系统的吸收和相位传递函数。
优选地，衍射层析成像系统的吸收和相位传递函数分别表示为：
式中，
为系统的广义相干传递函数，u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，um＝nm/λ，nm为样品周围介质折射率，λ为自由空间中的照明波长，P*(u)是P(u)的共轭形式，P(u+uin)和P*(u-uin)分别为P(u)和P*(u)受入射光空间频率uin平移调制后的相干传递函数表达式。
优选地，对每个对数强度谱进行三维半空间傅里叶滤波或三维希尔伯特变换，获得不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场，在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到样品三维散射势频谱的初步估计的具体过程为：
根据频谱中两个反对称广义孔径的位置，对每个双边带三维光谱进行三维半空间傅里叶滤波或三维希尔伯特变换，得到不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场Us1(r)，根据傅里叶衍射定理
在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到物体三维散射势频谱的初步估计，式中u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，j是虚数单位，
和
分别对应于O和Us1的傅里叶变换，
是
受入射光空间频率uin平移调制后的散射势频谱，
为系统的广义相干传递函数，其有限支持域被称为Ewald球壳。
优选地，步骤3中反卷积过程表示为：
其中
和
分别样品散射势的最终反卷积频谱和初步合成频谱，Hsyn为合成孔径处理后系统的三维非相干传递函数，
是Hsyn的共轭形式，ε为正则化参数。
优选地，合成孔径处理后系统的三维非相干传递函数具体为：
其中j是虚数单位，λ为自由空间中的照明波长，P(uT)代表物镜光瞳函数，即二维相干传递函数，理想情况下是一个半径为NAobj/λ的圆函数，由物镜数值孔径NAobj决定，u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，uT＝(ux,uy)是二维空间频率坐标，S是照明光源的空间频率强度分布函数。
本发明与现有技术相比，其显著优点：
(1)基于非干涉测量的衍射层析成像技术无需引入复杂且不稳定的干涉光路和装置，使得实验装置简单，易于和传统明场显微镜相结合。
(2)采用准单色LED照明光源，避免了高时间相干性激光光源带来的散斑噪声和寄生干涉，提高了成像质量。
(3)将光强传输从二维平面传输拓展到三维体传输，通过在对数强度谱上执行三维半空间滤波或等效的希尔伯特变换，可以在仅强度测量下实现散射场复相位(振幅和相位)的完整信息恢复。最终实现无需匹配照明条件的仅光强数据测量的衍射层析成像，正确恢复待测样品的三维折射率。
(4)通过合成孔径，将不同照明角度下的一阶散射场在三维频谱空间中合成，拓展了样品可访问的频谱信息，极大程度地提高的成像分辨率和光学切片能力。例如在40倍0.95数值孔径的干镜下，系统全宽横向分辨率为330nm，轴向分辨率为1.58μm；在100倍1.4数值孔径的油浸物镜下，系统全宽横向分辨率达到206nm，轴向分辨率达到0.52μm。
(5)通过照明角度和轴向离焦切片数的降采样，可以缩短数据采集时间，实现对动态样品的快速长时间成像。
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
附图说明
图1是基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法的流程图。
图2是基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像照明系统示意图以及硬件平台和机电系统同步框图。
图3是基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法的数据采集周期同步时间序列。
图4是不同照明数值孔径下二维频谱和三维频谱的解析性分析。
图5为以未染色MCF-7细胞为例，应用基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法进行三维折射率重建的数据处理流程图。
具体实施方式
本发明的构思为：一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，通过采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈，在对数光强频谱上执行半空间傅里叶滤波或等效的三维希尔伯特变换，结合非干涉合成孔径，从而实现了基于非干涉测量下无需满足匹配照明条件的衍射层析成像。由于固有的合成孔径优势，使得成像分辨率达到非相干成像衍射极限，获得了高分辨率成像结果。采用非干涉测量，成像光路简单，光学路径稳定，成像结果不受散斑和寄生干涉影响，并且可高度兼容传统明场显微镜结构。
如图1所示，一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，具体步骤为：
步骤1，采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈；
本步骤设计了合理的同步模式，有效协调了LED照明模式切换、电动位移台轴向扫描和相机读取之间的时序控制，实现了不同照明角度下轴向离焦强度图像堆栈的精细稳定采集。
具体实施过程为：本发明是基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像系统，该系统的实际硬件平台包括可编程LED阵列(例如可编程多环LED阵列)、电动位移台扫描装置，待测样品、显微物镜、成像筒镜和相机。如图2所示，给出了成像平台照明系统示意图以及硬件平台和机电系统同步框图的示例。在示例中可编程多环LED阵列共包括128个LED单元，分别分布在五个半径不同的同心圆环上，在每个圆环上等间距排列。其中每个LED单元均为红、绿、蓝三色LED单元，其典型波长为红光629、绿光520和蓝光483nm。该多环LED阵列并不需要进行单独加工，一般在市场上可直接购置，表1给出了一个市面上可购置的LED阵列的产品参数。
表1可编程多环LED的物理参数
其中多环LED阵列的圆心和显微物镜光轴重合，被放置在距离样品25mm的位置，提供最大照明角度约为72°的可变照明角度的准单色平面波照明，对应最大的照明数值孔径为0.95。显微物镜的后焦面与筒镜的前焦面重合，相机的成像平面放置在成像筒镜的后焦面位置。成像时样品被放置在电动位移台上，逐个点亮LED单元，准单色平面波照射待测样品，通过物镜，经过成像筒镜汇聚后落在相机的成像平面上，通过控制电动位移台的轴向扫描，利用相机来记录三维光强堆栈。
LED阵列中每个LED单元均可被单独点亮，由硬件控制电路(例如ARM控制板)控制顺序打开。数据采集计算机软件通过编程接口和程序与相机、电动位移台器进行通信，相机与LED阵列通过同一控制器，利用两根同轴电缆进行同步，提供触发和监测曝光状态，硬件控制电路提供一系列触发信号用于控制相机触发。在一定的光照角度下，利用软件(例如μ-Manager)控制高精度电动位移台对不同焦平面进行扫描，该软件通过USB从机模式与硬件控制电路同步传输驱动信号和步进完成标记。为了最小化采集时间，该方法使用了一个精细的时间序列来同步电动位移台的运动和相机的曝光，利用相机的外置触发方式，结合硬件控制电路，对行曝光时LED灯的切换进行同步控制。LED照明模式切换、电动位移台轴向扫描和相机读取之间的周期同步时间序列如图4所示。由于每个强度堆栈曝光序列与LED角度照明之间的同步，该模式相当于使用全局快门模式。此外，通过减少等效曝光时间(例如控制曝光时间在50ms左右)，最小化了振动噪声和随时间变化的运动伪影吗。为了避免实际曝光时间的变化和聚焦扫描阶段初始状态的不稳定，该方法在获取新一组强度堆栈前需延迟一段时间。
对于动态样品的长时间成像，该方法可减小电流输出限制电阻的阻值，以相同的曝光时间下提供足够的总光子通量。通过降采样照明角度和z轴离焦切片数，缩短数据采集时间，以达到系统的成像速度极限来满足对动态样品的成像需求。例如可在20秒内捕获包含至少15个不同轴向位移数据帧的共12个不同照明角度下的强度堆栈。
步骤2，对不同入射光照下的三维强度堆栈取对数，并进行三维傅里叶变换，即可得到三维对数强度谱；然后对每个对数三维强度谱进行三维半空间傅里叶滤波或等价于执行三维希尔伯特变换，得到不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场，接着在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到物体三维散射势频谱的初步估计。
具体实施过程为：对于三维厚物体的体成像，常用散射势函数O(r)来表征样品的三维结构，O(r)可展开成实部和虚部的形式，即O(r)＝a(r)+jφ(r)，其中φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位成分和吸收成分。
对不同入射光照下的三维强度堆栈I(r)取对数，表示为：
式中，φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位和吸收，g(r)和g′(r)分别为层析成像系统的点扩散函数和对应的受入射光Uin(r)调制后的点扩散函数，g′*(r)是g′(r)的共轭形式。
通过计算上式的傅里叶变换，得到对数强度谱函数：
式中的
和
分别对应于三维强度堆栈I(r)，散射势O(r)的吸收成分a(r)和相位成分φ(r)的三维傅里叶变换，Ha(u)和Hφ(u)为衍射层析成像系统的吸收和相位传递函数，分别表示为：
式中
为系统的广义相干传递函数，u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，um＝nm/λ，nm为样品周围介质折射率，λ为自由空间中的照明波长，P*(u)是P(u)的共轭形式。P(u+uin)和P*(u-uin)分别为P(u)和P*(u)受入射光空间频率uin平移调制后的相干传递函数表达式。
因此，在三维对数强度谱的ux-uz截面上可以清晰地观察到两个反对称广义孔径，这两个孔径根据入射光的角度发生位移，并且在三维空间中镜像对称地移动，它们永远不会相互抵消，如图四所示。根据频谱中两个反对称广义孔径的位置，对每个双边带三维光谱进行三维半空间傅里叶滤波或等效地执行三维希尔伯特变换，就可以得到不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场Us1(r)的单边带频谱。
根据傅里叶衍射定理
在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，就可以得到物体三维散射势频谱的初步估计，式中u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，j是虚数单位，
和
分别对应于O和Us1的傅里叶变换，
是
受入射光空间频率uin平移调制后的散射势频谱，
为系统的广义相干传递函数，其有限支持域被称为Ewald球壳。如图5所示，给出了以未染色MCF-7细胞为例的重建数据处理流程图。
步骤3，为了补偿LED元件离散化和照明部分相干性(时间和空间)的影响，在方法中进一步对初步合成的频谱执行基于LED离散采样、照明部分相干和修正因子的三维反卷积。
具体实施过程为：为了补偿LED元件离散化和照明部分相干(时间和空间)的影响，进一步对初步合成的光谱进行了三维反卷积，该反卷积是基于将LED离散采样、照明部分相干性、修正因子考虑在内的传递函数，其反卷积过程表示为：
其中
和
分别待重构样品散射势的最终反卷积频谱和初步合成频谱。Hsyn为合成孔径处理后系统的三维非相干传递函数，
是Hsyn的共轭形式，ε为正则化参数。
系统的三维非相干传递函数Hsyn可表示为：
其中j是虚数单位，λ为自由空间中的照明波长，P(uT)代表物镜光瞳函数，即二维相干传递函数，理想情况下是一个半径为NAobj/λ的圆函数，由物镜数值孔径NAobj决定。u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，uT＝(ux,uy)是二维空间频率坐标。S是照明光源的空间频率强度分布函数。
选择加入正则化参数，目的是反卷积过程中防止噪声的过度放大。经验表明，反卷积性能在很大程度上取决于正则化参数的选择，而强度堆栈的信噪比也会影响最终层析成像结果的质量。为了防止噪声的过度放大，保证折射率信号不变，可将干镜和油镜的正则化参数分别设置为0.1和0.25附近。
步骤4，采用非负约束和全变分正则化相结合的混合迭代约束算法对合成的散射势频谱中缺失锥信息进行计算填充。
具体实施过程为：基于样品的先验知识，在空域中，认为样品的折射率始终高于介质的折射率，并以梯度值作为优化目标函数，而在频域中，认定实验测得的频谱数据是真实有效的。通过在空域和频域同时施加约束，反复迭代，可以在一定程度上填充散射势频谱中的失锥信息，获得更真实的结果。
步骤5，对最终合成的三维散射势频谱进行三维傅里叶逆变换，恢复待测样品的三维折射率分布。
具体实施过程为：对步骤5中得到的三维散射势频谱进行傅里叶逆变换，得到三维散射势O(r)。样品散射势函数又可以表示为
其中n(r)为样品的三维复折射率分布，k0＝2π/λ是自由空间中照明波长为λ时的波矢量，nm为样品周围介质折射率。根据式
就可以得到表示样品的复折射率信息，其实部代表样品的折射率，虚部代表样品的吸收。
本发明同时采用了可编程LED阵列和电动位移台。其中LED阵列作为照明光源保证了照明模式的编程可控，用来提供所需的可变照明角度的准单色平面波照明。电动位移台通过软件控制，配合LED阵列和相机曝光之间的时序信号，用来提供样品纳米级的轴向位移，实现了样品在不同照明角度下的三维光强图像堆栈的四维数据采集。利用三维空间域Kramers-Kronig关系在对数强度谱上执行三维半空间滤波，可以在仅强度测量下实现散射场复相位(振幅和相位)的完整信息恢复。结合非干涉合成孔径技术，将不同照明角度下的一阶散射场在三维频谱中进行拼接合成，其成像分辨率达到非相干衍射极限，并且成像结果不受散斑和寄生干涉的影响。
Claims (8)
1.一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈；
步骤2：计算不同入射光照下的三维对数强度谱，并对每个对数强度谱进行三维半空间傅里叶滤波，获得不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场，在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到样品三维散射势频谱的初步估计；
步骤3：对初步估计的频谱进行基于LED离散采样、照明部分相干和修正因子的三维反卷积；
步骤4：采用非负约束和全变分正则化相结合的混合迭代约束算法对合成的散射势频谱中缺失锥信息进行计算填充；
步骤5：对填充后的的三维散射势频谱进行三维傅里叶逆变换，恢复样品的三维折射率分布，实现无标记生物样品实现非侵入式三维成像。
2.根据权利要求1所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，利用基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像平台采集不同照角度下的轴向离焦强度堆栈，所述光强传输衍射层析显微成像平台包括包括可编程LED阵列、电动位移台扫描装置，待测样品、显微物镜、成像筒镜和相机，可编程LED阵列的圆心和显微物镜光轴重合，被放置在距离样品设置距离的位置，显微物镜的后焦面与筒镜的前焦面重合，相机的成像平面放置在成像筒镜的后焦面位置，成像时样品被放置在电动位移台上，逐个点亮LED单元，准单色平面波照射待测样品，通过物镜，经过成像筒镜汇聚后落在相机的成像平面上，通过控制电动位移台的轴向扫描，利用相机来记录三维光强堆栈。
3.根据权利要求1所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，步骤2中对不同入射光照下的三维强度堆栈取对数，并进行三维傅里叶变换，得到三维对数强度谱。
4.根据权利要求1或3所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，采用散射势函数O(r)来表征样品的三维结构，将散射势函数O(r)展开成实部和虚部的形式，即O(r)＝a(r)+jφ(r)，其中φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位成分和吸收成分；
对不同入射光照下的三维强度堆栈I(r)取对数，表示为：
式中，φ(r)和a(r)对应于散射势O(r)的相位和吸收，g(r)和g′(r)分别为层析成像系统的点扩散函数和对应的受入射光Uin(r)调制后的点扩散函数，g′*(r)是g′(r)的共轭形式；
通过计算上式的傅里叶变换，得到对数强度谱函数：
式中的
和
分别对应于三维强度堆栈I(r)、散射势O(r)的吸收成分a(r)和相位成分φ(r)的三维傅里叶变换，Ha(u)和Hφ(u)为衍射层析成像系统的吸收和相位传递函数。
5.根据权利要求4所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，衍射层析成像系统的吸收和相位传递函数分别表示为：
式中，
为系统的广义相干传递函数，u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，um＝nm/λ，nm为样品周围介质折射率，λ为自由空间中的照明波长，P*(u)是P(u)的共轭形式，P(u+uin)和P*(u-uin)分别为P(u)和P*(u)受入射光空间频率uin平移调制后的相干传递函数表达式。
6.根据权利要求4所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，对每个对数强度谱进行三维半空间傅里叶滤波或三维希尔伯特变换，获得不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场，在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到样品三维散射势频谱的初步估计的具体过程为：
根据频谱中两个反对称广义孔径的位置，对每个双边带三维光谱进行三维半空间傅里叶滤波或三维希尔伯特变换，得到不同入射光照下包含复相位函数实部和虚部的三维散射场Us1(r)，根据傅里叶衍射定理
在傅里叶空间合成所有单边带三维散射场，实现非干涉合成孔径，得到物体三维散射势频谱的初步估计，式中u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，j是虚数单位，
和
分别对应于O和Us1的傅里叶变换，
是
受入射光空间频率uin平移调制后的散射势频谱，
为系统的广义相干传递函数，其有限支持域被称为Ewald球壳。
7.根据权利要求1所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，步骤3中反卷积过程表示为：
其中
和
分别样品散射势的最终反卷积频谱和初步合成频谱，Hsyn为合成孔径处理后系统的三维非相干传递函数，
是Hsyn的共轭形式，ε为正则化参数。
8.根据权利要求7所述的基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法，其特征在于，合成孔径处理后系统的三维非相干传递函数具体为：
其中j是虚数单位，λ为自由空间中的照明波长，P(uT)代表物镜光瞳函数，即二维相干传递函数，理想情况下是一个半径为NAobj/λ的圆函数，由物镜数值孔径NAobj决定，u＝(uT,uz)是对应于r的空间频率坐标，uT＝(ux,uy)是二维空间频率坐标，S是照明光源的空间频率强度分布函数。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210545129.5A CN114965470B (zh) | 2022-05-19 | 2022-05-19 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
| PCT/CN2023/090075 WO2023221741A1 (zh) | 2022-05-19 | 2023-04-23 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210545129.5A CN114965470B (zh) | 2022-05-19 | 2022-05-19 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114965470A true CN114965470A (zh) | 2022-08-30 |
| CN114965470B CN114965470B (zh) | 2024-05-17 |
Family
ID=82984409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210545129.5A Active CN114965470B (zh) | 2022-05-19 | 2022-05-19 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114965470B (zh) |
| WO (1) | WO2023221741A1 (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115711866A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-02-24 | 西安电子科技大学 | 基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法 |
| CN116659414A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-29 | 南京信息工程大学 | 一种基于改进HiIbert变换的结构光解调方法 |
| WO2023221741A1 (zh) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | 南京理工大学 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
| CN117268288A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-12-22 | 北京大学长三角光电科学研究院 | 光学衍射层析成像激光扫描方法、装置和电子设备 |
| CN117314915A (zh) * | 2023-11-29 | 2023-12-29 | 湖南大学 | 微结构加工的原位检测方法、设备及存储介质 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140347672A1 (en) * | 2011-07-29 | 2014-11-27 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Apparatus and method for quantitive phase tomography through linear scanning with coherent and non-coherent detection |
| CN108169173A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-15 | 南京理工大学 | 一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法 |
| CN108362643A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-08-03 | 北京工业大学 | 一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法 |
| CN109580457A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-04-05 | 南京理工大学 | 基于led阵列编码照明的三维衍射层析显微成像方法 |
| CN111694016A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-09-22 | 南京理工大学 | 一种非干涉合成孔径超分辨成像重构方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2553513B1 (en) * | 2010-03-28 | 2020-10-28 | Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | Complex index refraction tomography with improved resolution |
| WO2012102887A2 (en) * | 2011-01-24 | 2012-08-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Computational adaptive optics for interferometric synthetic aperture microscopy and other interferometric imaging |
| CN111650738A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-09-11 | 清华大学深圳国际研究生院 | 一种基于深度学习的傅里叶叠层显微图像重构方法及装置 |
| CN114965470B (zh) * | 2022-05-19 | 2024-05-17 | 南京理工大学 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
-
2022
- 2022-05-19 CN CN202210545129.5A patent/CN114965470B/zh active Active
-
2023
- 2023-04-23 WO PCT/CN2023/090075 patent/WO2023221741A1/zh unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140347672A1 (en) * | 2011-07-29 | 2014-11-27 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Apparatus and method for quantitive phase tomography through linear scanning with coherent and non-coherent detection |
| CN108169173A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-15 | 南京理工大学 | 一种大视场高分辨三维衍射层析显微成像方法 |
| CN108362643A (zh) * | 2018-02-10 | 2018-08-03 | 北京工业大学 | 一种双高度照明傅里叶叠层显微成像方法 |
| CN109580457A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-04-05 | 南京理工大学 | 基于led阵列编码照明的三维衍射层析显微成像方法 |
| CN111694016A (zh) * | 2020-06-02 | 2020-09-22 | 南京理工大学 | 一种非干涉合成孔径超分辨成像重构方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XIAOSHUAI HUANG等: "Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy", NATURE BIOTECHNOLOGY, 11 April 2018 (2018-04-11) * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023221741A1 (zh) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | 南京理工大学 | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 |
| CN115711866A (zh) * | 2022-10-31 | 2023-02-24 | 西安电子科技大学 | 基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法 |
| CN115711866B (zh) * | 2022-10-31 | 2024-07-09 | 西安电子科技大学 | 基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法 |
| CN116659414A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-29 | 南京信息工程大学 | 一种基于改进HiIbert变换的结构光解调方法 |
| CN116659414B (zh) * | 2023-07-21 | 2023-10-13 | 南京信息工程大学 | 一种基于改进HiIbert变换的结构光解调方法 |
| CN117268288A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-12-22 | 北京大学长三角光电科学研究院 | 光学衍射层析成像激光扫描方法、装置和电子设备 |
| CN117268288B (zh) * | 2023-07-26 | 2024-03-08 | 北京大学长三角光电科学研究院 | 光学衍射层析成像激光扫描方法、装置和电子设备 |
| CN117314915A (zh) * | 2023-11-29 | 2023-12-29 | 湖南大学 | 微结构加工的原位检测方法、设备及存储介质 |
| CN117314915B (zh) * | 2023-11-29 | 2024-02-23 | 湖南大学 | 微结构加工的原位检测方法、设备及存储介质 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114965470B (zh) | 2024-05-17 |
| WO2023221741A1 (zh) | 2023-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11781966B2 (en) | 3D diffraction tomography microscopy imaging method based on LED array coded illumination | |
| CN114965470B (zh) | 一种基于非干涉合成孔径的光强传输衍射层析显微成像方法 | |
| Li et al. | Transport of intensity diffraction tomography with non-interferometric synthetic aperture for three-dimensional label-free microscopy | |
| Kuś et al. | Holographic tomography: hardware and software solutions for 3D quantitative biomedical imaging | |
| Zuo et al. | High-resolution transport-of-intensity quantitative phase microscopy with annular illumination | |
| CN107490562B (zh) | 利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法 | |
| JP6416887B2 (ja) | 構造化照明を用いた組織試料の顕微鏡観察 | |
| Hugonnet et al. | Multiscale label-free volumetric holographic histopathology of thick-tissue slides with subcellular resolution | |
| US9546952B2 (en) | Distribution of refractive index measurement by synthetic aperture tomography | |
| EP2615967B1 (en) | Optical tissue sectioning using full field optical coherence tomography | |
| US8248614B2 (en) | Quantitative phase-imaging systems | |
| CN110082900A (zh) | 可变照明傅立叶重叠关联成像设备、系统以及方法 | |
| CN102540446A (zh) | 一种基于数字微镜器件的高速结构照明光学显微系统及方法 | |
| US9404857B2 (en) | White light diffraction tomography of unlabeled live cells | |
| Zhu et al. | Rapid and high-resolution imaging of human liver specimens by full-field optical coherence tomography | |
| CN107121065A (zh) | 一种便携式相位定量检测装置 | |
| Krauze et al. | Reconstruction method for extended depth-of-field optical diffraction tomography | |
| CN113317784A (zh) | 一种微米级线式聚焦扫描显微光谱光学相干层析成像系统 | |
| CN114324245B (zh) | 基于部分相干结构光照明的定量相位显微装置和方法 | |
| Goud et al. | Low cost digital holographic microscope for 3-D cell imaging by integrating smartphone and DVD optical head | |
| Kang et al. | Mapping nanoscale topographic features in thick tissues with speckle diffraction tomography | |
| Sung | Hyperspectral Three-Dimensional Refractive-Index Imaging Using Snapshot Optical Tomography | |
| CN116337811A (zh) | 基于对向照明的光学衍射层析显微成像方法 | |
| Kang et al. | Reflection-mode optical diffraction tomography for label-free imaging of thick biological specimens | |
| Jiang et al. | Optimization of single-beam multiple-intensity reconstruction technique: Select an appropriate diffraction distance |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |