CN115711866B - 基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法，装置包括沿光路方向依次设置的平行光产生模块、光旋转模块、显微物镜、镜筒透镜、第二薄透镜、空间光调制器、第三薄透镜和图像采集模块，其中，平行光产生模块用于产生部分相干的平行光；光旋转模块用于将平行光转换为对称的多角度倾斜照明光；在特定角度的倾斜照明下，样品在显微物镜的前焦面处能够产生不受样品影响的背景光和包含样品信息的散射光；空间光调制器用于仅对背景光进行相位调制，图像采集模块用于采集在特定角度的倾斜照明下由样品散射光和经调制的背景光产生的四张干涉相移图。本发明可对透明样品进行无标记、高质量的三维层析成像。

Description

基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法

技术领域

本发明属于显微成像技术领域，具体涉及一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法。

背景技术

光学显微镜自诞生以来在诸多领域扮演着重要的角色。利用光波的自有属性，研究人员发明了一系列有针对性的显微成像技术。例如，利用光波的振幅属性，研究人员发明了明场显微镜，物质对光波的吸收越多，其在成像视野中呈现得越暗。因此，基于振幅的显微技术不适用于透明的样品。自然界中存在大量的透明样品，当光波穿过这些样品时，它的振幅不会发生变化；但受样品的结构和尺寸等的影响，光波穿过这些透明样品时，其相位会发生相对性的变化。基于此，1935年荷兰科学家泽尼克提出了相衬显微镜，他通过将光波的相位信息转化为探测器可识别的强度信息，首次对传统明场显微镜无法观测到的透明样品进行了高对比度成像。样品对光波相位的影响程度取决于样品的折射率分布及厚度变化，也就是说，样品的折射率与周围介质的折射率差异越大或者样品越厚，则样品对光波相位的影响程度就越大，利用相衬显微镜观察到的图像对比度就越好。然而传统的泽尼克相衬显微镜只能定性地展示透明样品的结构分布，无法定量提供待测样品的相位信息(即，样品对照明光波的相位的调制函数)。

随着各类数字器件的飞速发展，研究人员们先后提出了多种定量相位显微技术，用以定量恢复出待测样品的相位信息。例如，数字全息显微镜(Digital HolographyMicroscopy,DHM)作为一种将光学干涉和数字全息相结合的定量相位显微技术，仅通过单次曝光就可以准确恢复样品对光场的调制信息。单光束衍射定量相位显微技术在近几年也得到了飞速的发展，该技术通过对一系列衍射图案进行迭代计算就可获得样品的复振幅信息。其中，傅立叶叠层显微成像技术(Fourier Ptychographic Microscope,FPM)整合了相位恢复和合成孔径的概念，是对叠层衍射成像(Ptychographic Iterative Engine,PIE)的一次重大提升。基于相衬的定量相位显微技术在恢复透明样品的相位信息方面发挥着重要的作用。其中，梯度光干涉显微镜(Gradient Light Interference Microscope,GLIM)是一种基于微分干涉相衬的定量相位显微技术。结合传统微分干涉相衬显微镜高轴向分辨率的特性，GLIM在透射和反射模式下都可以对较厚的样品进行成像。此外，研究人员利用相位型空间光调制器将泽尼克相衬显微镜与相移恢复算法结合在一起，开发了超斜照明定量相位显微技术(Quantitative Phase Microscopy with Enhanced Contrast and ImprovedResolution through Ultra-Oblique Illumination,UO-QPM)。该显微装置拥有227nm的横向分辨率和250Hz的成像速度，可以对活细胞的细胞器进行无标记高分辨成像。

然而，传统的定量相位显微镜在对透明样品成像时本质上是把待测样品看作一个二维的相位调制掩膜。所以，利用传统的定量相位显微镜计算得到的样品折射率分布本质上是轴向的平均值；也就说是，利用传统的定量相位显微镜无法得到待测样品的三维折射率分布，也就无法对待测样品进行三维层析成像。研究人员们先后开发了多种基于迭代运算或去卷积的计算方法，通过近似建模在一定程度上恢复了待测样品的三维结构，但模型选择及参数估计等问题依旧是准确恢复待测样品三维折射率分布的巨大障碍。近年来，研究人员在离轴数字全息显微镜的基础上开发了光学衍射层析技术(Optical diffractiontomography,ODT)。ODT不同于上述的计算方法，它不存在参数估计等问题，严格遵从实际的物理成像过程。ODT可以准确恢复待测样品的三维折射率分布。但是传统的马赫-曾德尔干涉结构是ODT的核心光路，这就要求照明光源是相干性非常好的激光器。因此，ODT成像的后期需要进行繁杂的图像处理才能减少环境扰动及激光散斑等对图像质量的不利影响。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置，包括沿光路方向依次设置的平行光产生模块、光旋转模块、显微物镜、镜筒透镜、第二薄透镜、空间光调制器、第三薄透镜和图像采集模块，其中，

所述平行光产生模块用于产生部分相干的平行光；

所述光旋转模块用于将所述平行光转换为对称的多角度倾斜照明光；

在特定角度的倾斜照明下，样品在所述显微物镜的前焦面处能够产生不受样品影响的背景光和包含样品信息的散射光，并且所述背景光和散射光经过所述显微物镜的空间傅里叶变换作用后在所述显微物镜的后焦面处产生频谱分布；

所述空间光调制器位于所述第二薄透镜和所述第三薄透镜的共焦面处，所述空间光调制器用于仅对所述背景光进行相位调制，所述图像采集模块用于采集在特定角度的倾斜照明下由样品散射光和经调制的背景光产生的四张干涉相移图。

在本发明的一个实施例中，所述平行光产生模块包括沿光轴方向依次设置的发光光源、工业镜头、多模光纤和第一薄透镜，其中，

所述发光光源用于产生部分相干的光束，所述工业镜头用于对光束进行缩放并耦合至所述多模光纤的输入端口，所述多模光纤的输出端口位于所述第一薄透镜的焦点处，使得从所述多模光纤的输出端口出射的发散光经过所述第一薄透镜的准直作用后变成平行光。

在本发明的一个实施例中，所述发光光源为发光二极管。

在本发明的一个实施例中，所述发光光源是包括沿光路方向依次设置的激光器、物镜和旋转毛玻璃的模块，其中，

所述激光器用于发出准直相干光束，所述物镜用于对所述准直相干光束进行会聚作用；

所述旋转毛玻璃位于所述物镜的后焦面处，用于对来自所述物镜的光束进行散射。

在本发明的一个实施例中，所述光旋转模块包括可调光阑、第一反射镜和第二反射镜，其中，

所述可调光阑用于调节入射的平行光的口径大小；

所述第一反射镜和所述第二反射镜固定在同一个旋转器上，所述旋转器的旋转轴线与所述可调光阑射出的平行光同轴，并且所述第一反射镜和所述第二反射镜能够同时沿所述旋转轴线转动，使得来自所述可调光阑的平行光经过旋转的所述第一反射镜和所述第二反射镜的反射作用后始终对同一视野进行均匀倾斜照明。

在本发明的一个实施例中，所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置还包括第三反射镜和线偏振片，其中，

所述第三反射镜设置在所述显微物镜与所述镜筒透镜之间，用于将光线从所述显微物镜反射至所述镜筒透镜；

所述线偏振片位于所述镜筒透镜与所述第二薄透镜之间且靠近所述第二薄透镜，使散射光和背景光的偏振方向与所述空间光调制器的作用方向相同。

在本发明的一个实施例中，所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置还包括图像处理模块，用于：

根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

旋转照明光束至另一倾斜角度，获得样品在所述另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的三维散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布。

本发明的另一方面提供了一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，包括：

S1：利用上述实施例中任一项所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置获得样品在不同角度倾斜光照射下的四张干涉相移图；

S2：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

S3：旋转照明光束至另一倾斜角度，并重复步骤S1和S2，获得样品在所述另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

S4：旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的三维散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布。

在本发明的一个实施例中，所述S2包括：

S21：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图获得显微物镜聚焦面处样品二维散射场与照明光场的相位差和振幅比；

S22：根据所述相位差和振幅比获得聚焦面处待测样品的二维散射场；

S23：根据所述二维散射场获得聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布；

S24：根据所述二维散射场的频谱分布进行三维频谱投影，获得该角度倾斜光照明下样品的散射势的三维频谱分布。

在本发明的一个实施例中，所述S23包括：

当待测样品对光场引起的相移量小于π时，在一阶Born近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，β(x,y)表示二维散射场与照明光场的振幅比，表示二维散射场与照明光场的相位差，表示待测样品的散射势的频谱向量，表示待测样品的散射向量；

当待测样品对光场引起的相移量大于π时，在一阶Rytov近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，ln表示对数函数。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提出一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法，无需对待测样品进行轴向扫描就可获得待测样品的三维折射率分布信息，从而对待测样品进行无标记、高衬度且高分辨率的三维层析成像。

2、本发明所提基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置具有共路径干涉的光学结构，对外界扰动具有非常好的抗干扰能力。因此，本发明装置可以探测到待测样品的结构在时间和空间尺度上非常小的动态变化。

3、本发明所提定量相衬层析显微装置首次使用部分相干光作为照明光源用于三维层析成像，具有非常好的图像质量。

4、该定量相衬层析显微装置可对透明样品进行无标记、高质量的三维层析成像，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。

5、该定量相衬层析显微装置可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统，具有非常好的拓展性。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的另一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置的结构示意图；

图3是在波矢为的平面波照明下样品散射势对应的频谱范围(球冠的形成)示意图。

图4是在波矢为的平面波照明下显微物镜的光瞳边缘及光瞳中心示意图。

图5是某个角度的倾斜照明下显微物镜的光瞳面上聚焦的背景光示意图。

图6是在图5所示的倾斜照明下照明波矢的垂轴分量示意图；

图7是活体COS7细胞在图5所示的倾斜照明下，图像采集模块采集到的四张干涉强度图(聚焦的背景光被空间光调制器分别调制0、0.5π、π和1.5π)；

图8是利用方程(11)至方程(19)对图7所示的四张干涉强度图进行计算而得到的二维散射场的频谱分布图(一阶Rytov近似，且已去除倾斜照明引起的频谱偏移)；

图9是利用方程(10)将图8所示的二维散射场的频谱分布进行三维投影后获得的活体COS7细胞的散射势的三维频谱分布图；

图10是将100个角度的倾斜照明下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加所得到的结果；

图11是图10中K_y-K_z截面的频谱分布；

图12是活体COS7细胞内不同层的折射率分布，标尺表示6微米。

附图标记说明：

1-发光二极管；2-小焦距工业镜头；3-多模光纤；4-第一薄透镜；5-可调光阑；6-第一反射镜；7-第二反射镜；8-样品；9-显微物镜；10-第三反射镜；11-镜筒透镜；12-线偏振片；13-第二薄透镜；14-空间光调制器；15-第三薄透镜；16-图像采集模块；1_1-激光器；1_2-低倍物镜；1_3旋转毛玻璃。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法进行详细说明。

有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。

应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例一

请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置的结构示意图。该定量相衬层析显微装置包括沿光路方向依次设置的平行光产生模块、光旋转模块、显微物镜9、镜筒透镜11、第二薄透镜13、空间光调制器14、第三薄透镜15和图像采集模块16。

所述平行光产生模块用于产生部分相干的平行光。具体地，本实施例的平行光产生模块包括沿光轴方向依次设置的发光光源1、工业镜头2、多模光纤3和第一薄透镜4。本实施例的发光光源1为发光二极管，该发光二极管用于发射部分相干的光束，该光束经过小焦距工业镜头2的缩放后耦合至多模光纤3的输入端口。多模光纤3的输出端口位于第一薄透镜4的焦点处，因此，从多模光纤3的输出端口出射的发散光经过第一薄透镜4的准直作用后变成平行光向前传播。

在本发明的一个实施例中，所述发光二极管的波长范围为470±20纳米，直径是5毫米，发散角是10度；小焦距工业镜头2的焦距是12毫米，与发光二极管1之间的距离是110毫米；多模光纤3是阶跃折射率多模光纤跳线，其纤芯直径为400微米；第一薄透镜4是焦距为100毫米的双胶合消色差透镜。

进一步地，所述光旋转模块用于将所述平行光转换为对称的多角度倾斜照明光。本实施例的光旋转模块包括可调光阑5、第一反射镜6和第二反射镜7，其中，可调光阑5用于调节入射的平行光束的口径大小。第一反射镜6和第二反射镜7固定在同一个旋转器上，旋转器的旋转轴线与可调光阑5射出的平行光同轴并且第一反射镜6和第二反射镜7能够同时沿旋转轴线转动，使得来自可调光阑5的平行光经过旋转的第一反射镜6和第二反射镜7的反射后始终对同一视野进行均匀倾斜照明。

具体地，来自可调光阑5的平行光经过第一反射镜6和第二反射镜7的反射作用后对位于显微物镜9的前焦面处的样品8进行倾斜照明。其中，第一薄透镜4和可调光阑5的轴线与显微物镜9的轴线同轴。为了对样品实现圆对称的多角度倾斜照明，第一反射镜6和第二反射镜7构成一个旋转模块，它们之间没有相对运动，但是第一反射镜6和第二反射镜7整体以显微物镜9的轴线为旋转轴进行旋转。

在本实施例中，第一反射镜6和第二反射镜7均为宽带介质膜的反射镜，均固定在一个中空旋转器上。该中空旋转器的旋转轴线与显微装置的轴线同轴，从而保证照明光束在旋转时始终对样品的同一视野进行均匀照明。本实施例的可调光阑5是圆环调节式可变光阑，其最大孔径为12毫米。

待测样品8设置在显微物镜9的前焦面处，样品8在某一特定角度的倾斜光照明下在显微物镜9的前焦面处产生不受样品影响的背景光和包含样品信息的散射光。本实施例的显微物镜9为浸油物镜，放大倍率是100X，其数值孔径为1.44。

进一步地，空间光调制器14位于第二薄透镜13和第三薄透镜15的共焦面处，空间光调制器14用于仅对背景光进行相位调制，图像采集模块16用于采集在特定角度的倾斜光照明下由样品散射光和经调制的背景光产生的四张干涉相移图。

具体地，在显微物镜9的前焦面处产生的不受样品影响的背景光和包含样品信息的散射光被显微物镜9和镜筒透镜11构成的共焦望远镜系统放大成像到镜筒透镜11与第二薄透镜13的共焦面处，随后再经过由第二薄透镜13和第三薄透镜15构成的共焦系统成像到图像采集模块16的工作面上。

背景光被显微物镜9收集后以聚焦点的形式被缩小成像到显微物镜9的后焦面处，再经过镜筒透镜11与第二薄透镜13构成的共焦系统成像到位于第二薄透镜13和第三薄透镜15的共焦面处的空间光调制器14上。散射光经过显微物镜9的空间傅里叶变换作用后在显微物镜9的后焦面处产生新的光场，该光场即为散射光的频谱分布。散射光的频谱分布充满显微物镜9的光瞳口径，并被镜筒透镜11与第二薄透镜13构成的共焦系统传播到空间光调制器14上。期间，散射光不被空间光调制器14调制，而背景光被空间光调制器14分别调制四次：调制相位分别为0、0.5π、π和1.5π。

随后，第三薄透镜15将散射光和已被调制的背景光传播到图像采集模块16上产生四张干涉相移图。再经过后续的计算就可得到在该角度的倾斜光照明下，样品8在显微物镜9的前焦面处产生的二维散射光光场；再经过频谱投影就可获得在该角度的倾斜光照明下样品8的散射势的三维频谱分布。

显然，仅对不受样品影响的背景光进行相位调制是准确计算二维散射光分布的关键，因此要让聚焦在显微物镜9的后焦面处的背景光的尺寸尽可能的小。为此，本发明实施例的定量相衬层析显微装置先使用小焦距工业镜头2对发光二极管1发出的光进行收集并缩小，然后再由多模光纤3限制其尺寸，最后经过由第一薄透镜4和显微物镜9组成的缩小系统成像到显微物镜9的后焦面处。随后由空间光调制器14仅对聚焦的背景光进行相位调制。由于发光二极管1发出的光是非偏振的，而空间光调制器14对光场进行相位调制时具有偏振方向选择性，因此，散射光和背景光在进入空间光调制器14之前需要经过线偏振片12的调制，使散射光和背景光的偏振方向与空间光调制器14的作用方向相同。另外，第三反射镜10用于减小发明装置的尺寸，使装置更为紧凑。将第三反射镜10切换为二向色镜后，可以将本发明实施例的装置与荧光显微成像技术相耦合。从本实施例的光路传播可以看到，样品产生的背景光和散射光自始至终都同时经过完全相同的光学器件，因此，所提发明装置对外界的干扰具有非常好的免疫性。

优选地，本实施例的第三反射镜10是宽带介质膜椭圆反射镜；镜筒透镜11的焦距为200毫米；光波经过线偏振片12后波前变形小于1/4波长；第二薄透镜13是焦距为250毫米的双胶合消色差透镜；第三薄透镜15是焦距为300毫米的双胶合消色差透镜；空间光调制器14的相位调制分辨率是8比特，其液晶切换时间为2毫秒。图像采集设备16选为sCOMS相机，单个像素的尺寸为6.5微米×6.5微米。

进一步地，本实施例基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置还包括图像处理模块(附图中未示出)，所述图像处理模块用于：

根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；旋转照明光束至另一倾斜角度，获得样品在所述另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的三维散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布。

具体地，待测样品的三维折射率分布表示为其中，表示样品的三维空间坐标；发光光源1发出的照明光波的中心波长表示为λ，其在真空中的波数为k₀＝2π/λ。待测样品在照明光波的倾斜照射下产生的总光场表示为其满足非均匀介质中的亥姆霍兹方程：

其中，表示拉普拉斯算子。

在一阶Born近似下，总光场可以看作是照明光场与散射场的线性叠加。一般地，照明光波是平面波，也就是其中，表示照明波矢，并且s_ix、s_iy和s_iz分别表示照明波矢在x、y、z轴方向的单位矢量，其中，z轴为物镜的轴线，x、y轴为垂直于z轴且相互正交的两个方向。为方便起见，这里令照明光波的振幅为1。该照明光波在整个空间上满足齐次的亥姆霍兹方程：

其中，n₀是周围介质的折射率。因此，方程(1)可变化为：

其中，表示待测样品的三维散射势分布。由于实际观察的样品大多是弱散射物体，其所产生的散射场的信号强度远远低于照明光场的信号强度，因此公式(3)可改写为：

进一步地，散射场可计算为：

其中，表示中间变量。上式中的积分范围是待测样品的整个有效体积Vs。表示格林函数，由于实际成像系统是轴对称的，因此格林函数可以被近似地认为是一个发散的球面波，该球面波的角谱表达式为：

其中，是单位散射向量，也就是上式(6)中|z-z'|的取值反映了散射场的方向，当散射场是前向散射时，绝对值取正；反之，当散射场是背向散射时，绝对值取负。

由于本发明实施例提出的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置是透射式结构，图像采集模块16采集到的是前向散射信号，因此上式中的绝对值取正。随后将公式(6)带入公式(5)可以得到：

其中，

需要说明的是，变量在空间域上的傅里叶变换用变量上方的波浪线～表示。进一步地，对公式(7)的两边同时取z＝0，也就是显微物镜的前焦面处，随后对两边的变量x和y进行傅里叶变换得到：

结合公式(8)和公式(9)得到：

其中，表示散射势的傅里叶变换，是待测样品的散射向量。由于实际的显微装置是衍射受限的，所使用的显微物镜只能收集孔径角范围内的散射光，因此s_x和s_y满足不等式这里，NA是显微物镜的数值孔径，n_d是显微物镜的折射率，例如，油镜的n_d＝1.512；表示待测样品的散射势的频谱向量。

公式(10)表明，在某一特定角度的倾斜光照明下(照明波矢为)，待测样品的散射势在特定球冠上的三维频谱分布与聚焦面处(z＝0)待测样品的二维散射场的频谱分布之间存在一一对应的投影关系。该球冠的形状及位置由限定，如图3所示。进一步地，将不同角度的倾斜光照明下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，然后再进行空间逆傅里叶变换，就可以得到待测样品的散射势分布，进而获得待测样品的三维折射率分布实现三维层析成像。

综上，准确计算聚焦面处(z＝0)待测样品的二维散射场是实现无标记三维层析成像的关键。由上述可知，在聚焦面处(z＝0)，总光场U(x,y)是照明光场U^(I)(x,y)与散射场U^(S)(x,y)的线性叠加，即：

其中，β(x,y)表示二维散射场与照明光场的振幅比，表示二维散射场与照明光场的相位差。当空间光调制器14仅对聚焦的背景光进行相位调制后，图像采集模块16采集到的干涉强度图表示为：

其中，m＝0,1,2,3表示空间光调制器对背景光进行相位调制的序号，对应的调制向量分别为0、0.5π、π和1.5π。通过相移法，可以很容易地获得：

其中，tan^-1表示反正切函数。以及，

其中，

因此，聚焦面处待测样品的二维散射场计算为：

进一步地，去除倾斜照明对散射场引起的频谱偏移后，在一阶Born近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

值得注意的是，一阶Born近似只有在样品对光场引起的相移量小于π时才有效，而单个细胞的厚度在10微米左右，单个细胞对光场引起的相移量大约为π。因此，一阶Born近似对于大部分样品来说是不合理的。相比而言，一阶Rytov近似对样品的厚度及引起的相移量是不敏感的，但对折射率的梯度非常敏感。因此，当待测样品对光场引起的相移量小于π时，在一阶Born近似下获取聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布；当待测样品对光场引起的相移量大于π时，在一阶Rytov近似下获取聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布。

具体地，在去除倾斜照明对散射场引起的频谱偏移后，在一阶Rytov近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，ln表示对数函数。利用方程(18)或方程(19)获得聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布后，再通过方程(10)将其进行三维频谱投影就可获得在该角度的倾斜光照明下样品的散射势的三维频谱分布。然后旋转照明光束至另一角度，重复方程(12)到方程(19)的数据采集和处理过程。当照明光束扫描完一个完整的环形后(2π角度)，将这些角度下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，然后进行空间逆傅里叶变换就可以得到样品的三维散射势分布。

很显然，在进行频谱投影时需要准确地知道照明光波的波矢。在实验中，通过在空间光调制器14与第三薄透镜15之间加临时的透镜来对显微物镜的光瞳面进行成像，从而确定聚焦的背景光在光瞳面上的相对位置，进而确定照明光波的波矢，如图4至图6所示。具体地，首先将倾斜照明扫描的整个环形分为等间距的多个角度，如100个不同的角度，并在每个角度的倾斜光照明下对显微物镜的光瞳面进行拍摄，期间，空间光调制器不做相位调制；然后将这些图像，如100张，进行求和并调节图像对比度就获得如图4所示的结果。从图4可以清晰地看到显微物镜的光瞳边缘是一个理想的圆形，而显微物镜的光瞳中心就是光瞳边缘的圆心。

另外，图5给出了在某个角度的倾斜光照明下显微物镜的光瞳面上聚焦的背景光的位置。进一步地，图6给出了在该角度的倾斜光照明下照明波矢的垂轴分量(xy面内)，也就是从光瞳中心指向背景光的聚焦位置的向量由于照明波矢的幅值为k₀，因此可以很容易地得到照明波矢的轴向分量。如此，照明波矢就可以被准确地计算得到。从本发明实施例的定量相衬层析显微装置的原理来看，该定量相衬层析显微装置在数据采集过程中只需要在物镜的光瞳面处对聚焦的背景光进行四次相位调制，并且散射场与照明光场是共路径干涉的，因此本发明实施例的装置所需的光源可以是部分相干的，这就使得该装置不仅具有非常好的图像质量，还对外界扰动具有非常好的免疫性。另外，本发明实施例的定量相衬层析显微装置没有使用特殊的光学器件，具有非常好的拓展性。

进一步地，为了直观地展示本发明实施例装置的数据采集和处理过程，本实施例利用本发明装置对活体COS7细胞进行了三维层析成像。图7所示的四张图是活体COS7细胞在图5所示的倾斜照明下，图像采集模块采集到的四张干涉强度图，其中，聚焦的背景光被空间光调制器分别调制0、0.5π、π和1.5π。利用方程11到方程19计算得到在该角度的倾斜光照明下显微物镜的聚焦面处活体COS7细胞产生的二维散射场的频谱分布(一阶Rytov近似)，如图8所示。图8只显示了二维散射场的频谱分布的幅值信息。然后利用图4至图6所述的方法确定该照明光波的波矢，并利用方程(10)将计算得到的二维散射场的频谱分布(图8)进行投影，从而获得在该角度的倾斜光照明下活体COS7细胞的散射势的三维频谱分布，如图9所示。最后，将100个角度的倾斜光照明下所获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加就得到如图10和图11所示的频谱分布结果，然后对其进行空间逆傅里叶变换并通过进一步计算就得到活体COS7细胞的三维折射率分布，如图12所示。从图12可以看出，尽管数据采集过程中没有对活体COS7细胞进行轴向扫描，但依据本发明实施例所提的方法，可以准确地得到了活体COS7细胞内不同层的折射率分布，从而实现了三维层析成像。例如，+2微米、0微米以及-0.5微米层内不同区域的脂滴被清晰聚焦。由于使用的光源是部分相干的发光二极管，因此所获图像不存在激光散斑等噪声；并且该装置拥有共路径干涉的光学结构，数据采集的过程非常稳定，数据的恢复过程没有受到外界扰动带来的不利影响。

总的来说，本发明实施例的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置有如下优势：(1)本发明提出一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法，无需对待测样品进行轴向扫描就可获得待测样品的三维折射率分布信息，从而对待测样品进行无标记、高衬度且高分辨率的三维层析成像。(2)本发明所提基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置具有共路径干涉的光学结构，对外界扰动具有非常好的抗干扰能力。因此，本发明装置可以探测到待测样品的结构在时间和空间尺度上非常小的动态变化。(3)本发明所提定量相衬层析显微装置首次使用部分相干光作为照明光源用于三维层析成像，具有非常好的图像质量。(4)该定量相衬层析显微装置可对透明样品进行无标记、高质量的三维层析成像，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。(5)该定量相衬层析显微装置可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统，具有非常好的拓展性。

实施例二

在实施例一的基础上，本实施例提供了另一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置。请参见图2，本实施例的发光光源包括激光器1_1、低倍物镜1_2和旋转毛玻璃1_3，其中，激光器1_1发出的准直相干光束经过低倍物镜1_2的会聚作用后被位于低倍物镜1_2后焦面处的旋转毛玻璃1_3散射。散射的光束被小焦距工业镜头2收集并缩放后耦合到多模光纤3的输入端口。旋转毛玻璃1_3以一定的速度绕其旋转轴进行连续旋转，其旋转轴与小焦距工业镜头2的轴线平行但不在同一条线上，如图2所示。

在图像采集模块16的一次曝光时间内，旋转毛玻璃1_3的不同位置对会聚的激光光斑进行散射从而产生时间上变化的散斑图案对样品进行照明。因此，图像采集模块16拍摄到的一张强度图实际上是无数干涉强度图的线性叠加；而这些干涉强度图是样品在无数散斑照明下产生的。因此，本实施例通过时间平均效应获得了基于高相干性激光器的部分相干照明，从而获得高质量的图像，避免了散斑噪声。本实施例其他部分的结构、光路传播与实施例一完全相同，不再赘述。

实施例三

在上述实施例的基础上，本实施例提供了一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，所述方法包括：

S1：利用上述实施例所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置获得样品在不同角度倾斜照明光照射下的四张干涉相移图；

S2：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布。

具体地，所述S2包括：

S21：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图获得显微物镜聚焦面处二维散射场与照明光场的相位差和振幅比；

S22：根据所述相位差和振幅比获得聚焦面处待测样品的二维散射场；

S23：根据所述二维散射场获得聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布；

当待测样品对光场引起的相移量小于π时，在一阶Born近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，β(x,y)表示二维散射场与照明光场的振幅比，表示二维散射场与照明光场的相位差，表示待测样品的散射势的频谱向量，表示待测样品的散射向量；

当待测样品对光场引起的相移量大于π时，在一阶Rytov近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，ln表示对数函数。

S24：根据所述二维散射场的频谱分布进行三维频谱投影，获得该角度倾斜光照明下样品的散射势的三维频谱分布。

S3：旋转照明光束至另一倾斜角度，并重复步骤S1和S2，获得样品在所述另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

S4：旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布。

需要说明的是，具体公式推导和计算过程，请参见实施例一，这里不再赘述。

在本发明所提供的几个实施例中，应该理解到，本发明所揭露的装置和方法，可以通过其它的方式实现。例如，以上所描述的装置实施例仅仅是示意性的，例如，所述模块的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个模块或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。

另外，在本发明各个实施例中的各功能模块可以集成在一个处理模块中，也可以是各个模块单独物理存在，也可以两个或两个以上模块集成在一个模块中。上述集成的模块既可以采用硬件的形式实现，也可以采用硬件加软件功能模块的形式实现。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，包括：

S1：利用基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置获得样品在不同角度倾斜照明光照射下的四张干涉相移图，所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置包括沿光路方向依次设置的平行光产生模块、光旋转模块、显微物镜(9)、镜筒透镜(11)、第二薄透镜(13)、空间光调制器(14)、第三薄透镜(15)和图像采集模块(16)，其中，所述平行光产生模块用于产生部分相干的平行光；所述光旋转模块用于将所述平行光转换为对称的多角度倾斜照明光；在特定角度的倾斜照明下，样品在所述显微物镜(9)的前焦面处能够产生不受样品影响的背景光和包含样品信息的散射光，并且所述背景光和散射光经过所述显微物镜(9)的空间傅里叶变换作用后在所述显微物镜(9)的后焦面处产生频谱分布；所述空间光调制器(14)位于所述第二薄透镜(13)和所述第三薄透镜(15)的共焦面处，所述空间光调制器(14)用于仅对所述背景光进行相位调制，所述图像采集模块(16)用于采集在特定角度的倾斜光照明下由样品散射光和经调制的背景光产生的四张干涉相移图；

S2：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

S3：旋转照明光束至另一倾斜角度，并重复步骤S1和S2，获得样品在另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

S4：旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布；

所述S2包括：

S21：根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图获得显微物镜聚焦面处二维散射场与照明光场的相位差和振幅比；

S22：根据所述相位差和振幅比获得聚焦面处待测样品的二维散射场；

S23：根据所述二维散射场获得聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布；

S24：根据所述二维散射场的频谱分布进行三维频谱投影，获得该角度倾斜照明下样品的散射势的三维频谱分布。

2.根据权利要求1所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述S23包括：

当待测样品对光场引起的相移量小于π时，在一阶Born近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，β(x,y)表示二维散射场与照明光场的振幅比，表示二维散射场与照明光场的相位差，表示待测样品的散射势的频谱向量，表示待测样品的散射向量，表示样品的三维空间坐标，z轴为物镜的轴线，x、y轴为垂直于z轴且相互正交的两个方向，是单位散射向量，是待测样品的散射向量，k₀＝2π/λ表示发光光源1发出的照明光波在真空中的波数；

当待测样品对光场引起的相移量大于π时，在一阶Rytov近似下，聚焦面处样品的二维散射场的频谱分布可计算为：

其中，ln表示对数函数。

3.根据权利要求1所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述平行光产生模块包括沿光轴方向依次设置的发光光源(1)、工业镜头(2)、多模光纤(3)和第一薄透镜(4)，其中，

所述发光光源(1)用于产生部分相干的光束，所述工业镜头(2)用于对光束进行缩放并耦合至所述多模光纤(3)的输入端口，所述多模光纤(3)的输出端口位于所述第一薄透镜(4)的焦点处，使得从所述多模光纤(3)的输出端口出射的发散光经过所述第一薄透镜(4)的准直作用后变成平行光。

4.根据权利要求3所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述发光光源(1)为发光二极管。

5.根据权利要求3所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述发光光源(1)是包括沿光路方向依次设置的激光器(1_1)、物镜(1_2)和旋转毛玻璃(1_3)的模块，其中，

所述激光器(1_1)用于发出准直相干光束，所述物镜(1_2)用于对所述准直相干光束进行会聚作用；

所述旋转毛玻璃(1_3)位于所述物镜(1_2)的后焦面处，用于对来自所述物镜(1_2)的光束进行散射。

6.根据权利要求1所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述光旋转模块包括可调光阑(5)、第一反射镜(6)和第二反射镜(7)，其中，

所述可调光阑(5)用于调节入射的平行光的口径大小；

所述第一反射镜(6)和所述第二反射镜(7)固定在同一个旋转器上，所述旋转器的旋转轴线与所述可调光阑(5)射出的平行光同轴，并且所述第一反射镜(6)和所述第二反射镜(7)能够同时沿所述旋转轴线转动，使得来自所述可调光阑(5)的平行光经过旋转的所述第一反射镜(6)和所述第二反射镜(7)的反射作用后始终对同一视野进行均匀倾斜照明。

7.根据权利要求1所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置还包括第三反射镜(10)和线偏振片(12)，其中，

所述第三反射镜(10)设置在所述显微物镜(9)与所述镜筒透镜(11)之间，用于将光线从所述显微物镜(9)反射至所述镜筒透镜(11)；

所述线偏振片(12)位于所述镜筒透镜(11)与所述第二薄透镜(13)之间且靠近所述第二薄透镜(13)，使散射光和背景光的偏振方向与所述空间光调制器(14)的作用方向相同。

8.根据权利要求1所述的基于环形扫描照明的定量相衬层析显微方法，其特征在于，所述基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置还包括图像处理模块，用于：

根据样品在当前角度倾斜光照射下的四张所述干涉相移图计算获得所述样品在当前角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

旋转照明光束至另一倾斜角度，获得样品在另一角度倾斜光照射下的散射势的三维频谱分布；

旋转照明光束扫描完一个完整的环形后，将不同角度倾斜光照射下获得的散射势的三维频谱分布进行线性叠加，随后进行空间逆傅里叶变换得到样品的三维散射势分布，进而获得样品的三维折射率分布。