CN114184553A - 一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法，所述装置包括第一环形光源、工业镜头、第一薄透镜、分束镜、第一镜筒透镜、显微物镜、线偏振片、第二薄透镜、空间光调制器、第三薄透镜和相位图像采集模块，其中，第一环形光源、工业镜头和第一薄透镜设置在分束镜的入射光路上，第一镜筒透镜和显微物镜设置在分束镜的反射光路上；线偏振片、第二薄透镜和空间光调制器依次设置在分束镜与第一镜筒透镜相反的一侧，且线偏振片和第二薄透镜位于空间光调制器的入射光轴；第三薄透镜和相位图像采集模块设置在空间光调制器的反射光轴。本发明可对强散射样品和不透明样品实现三维定量相位成像，且具有高的时间和空间分辨率。

Description

一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法

技术领域

本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法，用于对强散射样品或非透明样品进行无标记、高衬度且高分辨率的原位检测。

背景技术

定量相位显微技术作为一种恢复透明样品复振幅的无标记成像方法，在过去的十几年里得到了飞速的发展，在生命医学研究及工业检测等领域具有重要的应用价值。定量相位显微镜成为多个研究领域的重要臂膀归功于以下几个方面。首先，重建得到的光学相位信息可以直接或间接地转换为样品的物理或化学特性，便于进行更深入的基础研究；其次，作为非荧光标记且非侵入式的成像方法，不需要对样品进行额外的处理，避免给样品带来不利的影响；另外，定量相位显微镜很容易实现结构和功能上的拓展，以便与其他成像系统相结合。目前，绝大多数的定量相位显微技术只适用于弱散射样品，且都是透射式成像模式，无法对厚的强散射样品或非透明样品进行三维定量成像。

尽管有研究人员提出基于反射式非对称照明的无标记定量相位显微技术，用以实现厚组织的定量相位成像。但该技术本质上还是收集了样品的前向散射信号，与透射式定量相位显微等效，对于结构致密的强散射样品而言，能否达到细胞级的分辨率尚有待证实。梯度光微分干涉显微技术结合了相移和微分干涉技术，该技术目前有透射式和反射式两种模式，可以对斑马鱼卵等厚的组织样品进行三维定量成像。然而，偏振照明光经过厚组织样品时其偏振状态会发生明显的改变，需要进行复杂的图像处理才能提高相位图像的对比度。这些数据处理方法要求图像具有高的信噪比，还会在一定程度上造成不真实的伪影结构。另外，基于多次散射模型的三维衍射层析技术通过对厚样品进行散射建模来恢复样品的三维信息。然而，建模过程中所取的近似会降低重建图像的分辨率，同时，复杂的数据处理会产生严重的伪影结构，如何与样品自身的细节进行区分仍需要进一步的验证。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

本发明的一个方面提供了一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，包括第一环形光源、工业镜头、第一薄透镜、分束镜、第一镜筒透镜、显微物镜、线偏振片、第二薄透镜、空间光调制器、第三薄透镜和相位图像采集模块，其中，

所述第一环形光源、所述工业镜头和所述第一薄透镜沿光传播方向依次同轴设置在所述分束镜的入射光路上，所述第一镜筒透镜和所述显微物镜沿光传播方向依次同轴设置在所述分束镜的反射光路上，所述第一镜筒透镜和所述显微物镜共焦，样品放置在所述显微物镜的前焦面；

所述线偏振片、所述第二薄透镜和所述空间光调制器按照与所述分束镜从近到远的顺序依次设置在所述分束镜与所述第一镜筒透镜相反的一侧，且所述线偏振片和所述第二薄透镜位于所述空间光调制器的入射光轴；

所述第三薄透镜和所述相位图像采集模块依次设置在所述空间光调制器的反射光轴，所述第二薄透镜和所述第三薄透镜构成共焦系统；

所述空间光调制器能够对所述样品的非散射光进行相位调制以得到所述样品的多个干涉相移图，所述相位图像采集模块用于采集所述多个干涉相移图。

在本发明的一个实施例中，所述第一环形光源由环形均匀分布的多个同型号的LED组成，且每个LED的轴线均指向所述工业镜头的中心。

在本发明的一个实施例中，所述空间光调制器能够对所述样品的非散射光进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制。

在本发明的一个实施例中，所述第二薄透镜的主轴与所述空间光调制器的工作面法线之间的夹角小于5°，所述第三薄透镜的主轴与所述空间光调制器的工作面法线之间的夹角小于5°。

在本发明的一个实施例中，所述样品为不透明样品或透明样品。

在本发明的一个实施例中，所述基于环形光照明的落射式定量相位显微装置还包括第二环形光源，所述第二环形光源设置在所述样品远离所述显微物镜的一侧。

在本发明的一个实施例中，所述基于环形光照明的落射式定量相位显微装置还包括第一二向色镜、第二镜筒透镜、第二二向色镜、荧光图像采集模块和荧光激发光源，其中，

所述第一二向色镜倾斜设置在所述第一镜筒透镜与所述显微物镜之间，

所述第二镜筒透镜和所述荧光图像采集模块同轴设置在所述第一二向色镜的一侧，所述第二二向色镜倾斜设置在所述第二镜筒透镜与所述荧光图像采集模块之间，

所述荧光激发光源用于产生平行光，且所述平行光能够依次经过所述第二二向色镜、所述第二镜筒透镜和所述第一二向色镜入射到所述显微物镜中。

本发明的另一方面提供了一种基于环形光照明的落射式定量相位显微方法，包括：

S1：利用上述实施例中任一项所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置获得样品的多个干涉相移图；

S2：根据多个所述干涉相移图计算获得所述样品的相位信息。

在本发明的一个实施例中，所述S1包括：

S11：打开照明光源；

S12：通过空间光调制器对样品的非散射光进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制；

S13：利用相位图像采集模块记录样品在所述相位调制下对应的干涉相移图。

在本发明的一个实施例中，所述S2包括：

S21：获取相位图像采集模块探测到的各个所述干涉相移图的总光强分布：

其中，

表示空间光调制器对样品非散射光调制的相位，I₀(x,y)表示非散射光的总强度，I_s(x,y)表示散射光的总强度，Γ(x,y)表示散射光与非散射光之间的二维互相干函数，

表示样品对光场的相位调制函数；

S22：利用所述总光强分布计算得到样品的相位分布：

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的落射式定量相位显微装置可对强散射样品和不透明样品实现三维定量相位成像，无论样品是强散射样品还是不透明样品，产生的散射光和非散射光经过完全相同的光路，因此，本实施例的落射式定量相位显微装置对外界环境扰动具有非常好的免疫抵抗力，有利于活体样品的长时间稳定成像；其次，由于落射式照明采用很多环形均匀分布的LED进行多角度的倾斜照明，系统的空间分辨率和信噪比得到了显著的提升，极大地提高了图像质量和空间分辨率，该装置仅用一个由LED组成的简单环形照明光源就实现了多角度的倾斜照明，降低了系统的成本和复杂度；另外，该落射式定量相位显微装置的落射式照明使样品更多的轴向频谱信息进入成像系统，极大地提高了装置的轴向分辨率，有利于强散射样品的三维成像；由廉价的LED组成的环形光源在很大程度上简化了该显微装置的光路结构，降低了系统的复杂度和成本。

2、本发明的落射式定量相位显微装置可以使透射式和落射式定量相位显微装置无缝地耦合在一起，不仅可用于强散射样品或不透明反射型样品的落射式定量相位成像，还可用于全透明弱散射样品的透射式定量相位成像。两种定量相位显微模式还可以同时工作，针对同一样品中的弱散射全透明部分，可用透射式定量相位进行观测；而对于较厚的强散射部分就可用落射式定量相位进行观测，实现同一样品的多模式定量相位成像。

3、本发明的落射式定量相位显微装置具有高的测量精度，通过落射式照明结构可有效提高系统的轴向分辨率，可对厚的组织样品实现三维定量相位成像，同时可对不透明的样品进行纳米级分辨率的三维形貌检测；可对透射式显微技术无法观测的厚组织及不透明样品进行实时、无标记、高分辨的原位检测，并且可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统。

以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的一种环形光源的结构示意图；

图3是本发明实施例提供的另一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的结构示意图；

图4是本发明实施例提供的又一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的结构示意图；

图5是本发明实施例提供的又一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的结构示意图；

图6是空间光调制器对不被样品影响的非散射光进行一系列的相位调制的示意图；

图7是本发明实施例提供的一种透射式定量相位显微成像模式的传递函数示意图；

图8是本发明实施例提供的一种落射式定量相位显微成像装置的传递函数示意图；

图9A是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对半导体硅晶片进行反射式定量相位成像时非散射光在空间光调制器表面所成的像；

图9B是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对半导体硅晶片进行反射式定量相位成像时，利用空间光调制器对非散射光区域进行四步相位调制所获得的相移图；

图9C是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置获得的硅晶片表面微型器件高度分布图；

图10A是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对菠萝切片进行落射式定量相位成像时非散射光在空间光调制器表面所成的像；

图10B是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对厚的菠萝切片进行落射式定量相位成像时，利用空间光调制器对非散射光区域进行四步相位调制所获得的相移图；

图10C是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置获得的菠萝切片相位分布图。

附图标记说明：

1-第一环形光源；2-工业镜头；3-第一薄透镜；4-分束镜；5-第一镜筒透镜；6-显微物镜；7-样品；8-线偏振片；9-第二薄透镜；10-空间光调制器；11-第三薄透镜；12-相位图像采集模块；13-第二环形光源；14-第一二向色镜；15-第二镜筒透镜；16-第二二向色镜；17-荧光图像采集模块；18-荧光激发光源。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置和方法进行详细说明。

有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。

应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例一

请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的结构示意图。该落射式定量相位显微装置包括第一环形光源1、工业镜头2、第一薄透镜3、分束镜4、第一镜筒透镜5、显微物镜6、线偏振片8、第二薄透镜9、空间光调制器10、第三薄透镜11和相位图像采集模块12，其中，第一环形光源1、工业镜头2和第一薄透镜3沿光传播方向依次同轴设置在分束镜4的入射光路上，第一镜筒透镜5和显微物镜6沿光传播方向依次同轴设置在分束镜4的反射光路上，第一镜筒透镜5和显微物镜6共焦，样品7放置在显微物镜6的前焦面；线偏振片8、第二薄透镜9和空间光调制器10按照与分束镜4从近到远的顺序依次设置在分束镜4的与第一镜筒透镜5相反的一侧，且线偏振片8和第二薄透镜9位于空间光调制器10的入射光轴；第三薄透镜11和相位图像采集模块12依次设置在空间光调制器10的反射光轴，第二薄透镜9和第三薄透镜11构成共焦系统；空间光调制器10能够对样品7的非散射光进行相位调制以得到样品7的干涉相移图，相位图像采集模块12用于采集干涉相移图。

请参见图2，图2是本发明实施例提供的一种的第一环形光源的结构示意图。第一环形光源1由环形均匀分布的多个同型号的发光二极管(LED)组成，能够产生大角度的照明。所述LED的波长在可见光范围，且具有小的发散角，保证足够高的光强利用率，且要求其具有窄的光谱带宽。具体地，多个同型号的LED均匀分布在环形光源骨架上。优选地，本实施例的第一环形光源1由24个中心波长470nm，带宽20nm的LED环形均匀分布组成，所有的LED型号参数完全相同，直径为5mm，单个发光二极管的功率是360毫瓦。所有的LED均安装在3D打印的骨架上，使用时所有LED采用并行连接同时点亮。第一环形光源1发出非偏振且非相干的光束。

本实施例的工业镜头2为小焦距工业镜头，用于收集第一环形光源1发出的光束并对其进行缩小，使第一环形光源1产生的光束在显微物镜6的后焦面具有合适的尺寸。为了尽可能多地收集LED发出的光，每个LED的轴线均指向工业镜头2的中心。工业镜头2的焦距f₀＝12毫米。本实施例的第一薄透镜3、第二薄透镜9和第三薄透镜11均为消色差双胶合透镜。

分束镜4用于将照明支路与探测支路耦合起来，其分束比约为1：1，厚度小于0.5毫米。优选地，本实施例的分束镜4的分束比为45:55，厚度是0.3毫米。第一镜筒透镜5用于减小系统像差。显微物镜6的焦平面处安装有样品7，其中，显微物镜6用于收集样品7的散射信号并对其进行放大。本实施例的显微物镜6为空气物镜，放大倍率为20X，数值孔径NA＝0.3(平场消色差物镜)；第一薄透镜3和第一镜筒透镜5均为焦距f₁＝200毫米的镜筒透镜。

线偏振片8用于将第一环形光源1发出的非偏振光调制为线偏振光。散射光和非散射光经过线偏振片8后波前变形小于1/4波长。第二薄透镜9是焦距为f₂＝250毫米的双胶合消色差透镜；第三薄透镜11是焦距为f₃＝300毫米的双胶合消色差透镜；第二薄透镜9和第三薄透镜11的直径均为2英寸。

空间光调制器10用于对光场进行相位调制，即分别对样品的非散射光进行0π，0.5π，π及1.5π的相位延迟，同时不对样品散射光进行相位调制，从而产生四张相移图，进而恢复得到透明样品的相位图。本实施例的空间光调制器10的相位调制分辨率是8比特，其液晶切换时间为2毫秒。

相位图像采集模块12用于采集干涉相移图像，其像素的尺寸及数量应满足成像系统采样率和视野的要求。本实施例的相位图像采集模块12选为sCOMS相机，单个像素的尺寸为6.5微米×6.5微米。

具体地，第一环形光源1的LED发出的非偏振且非相干的发散光束由工业镜头2收集并被缩小到第一薄透镜3的前焦面处。缩小后的光束经过第一薄透镜3的会聚作用后以平面波的形式传播到分束镜4上，其中，50％的照明光直接穿透分束镜4并远离该装置，而剩余50％的照明光经过分束镜4的反射作用后射入至第一镜筒透镜5，并以环形光的形式成像到第一镜筒透镜5的前焦面处。第一镜筒透镜5与显微物镜6之间是共焦关系，因此第一镜筒透镜5前焦面处的环形光经过显微物镜6的会聚作用后以平面波的形式斜照射到置于显微物镜6前焦面处的样品7上，且照明光的能量集中在成像视野的正中心。

需要说明的是，本实施例的落射式定量相位显微装置用于对透明样品(包括强散射样品和弱散射样品)和不透明样品进行成像。

当样品7为强散射样品时，将其放置于很薄的盖玻片上，斜射的平面波打到样品上后会在玻片底面反射回不受样品影响的非散射光，同时透过去的照明光会在样品内产生远离系统的前向散射光及返回系统的背向散射光。

当样品7为不透明样品，斜射的照明光到达样品上时会产生返回系统的非散射光和散射光，这种情况与透射型显微成像一致。为方便起见，对强散射样品和不透明样品而言，本实施例将返回系统的信号统一分为非散射光和散射光。

具体地，样品7产生的散射光和非散射光被显微物镜6和第一镜筒透镜5构成的共焦望远镜系统放大成像到第一镜筒透镜5的后焦面处，随后再经过由第二薄透镜9和第三薄透镜11构成的共焦系统成像到相位图像采集模块12的工作面上。其中，非散射光不受样品的影响，以平面波的形式返回显微物镜6，且以环形光的形式成像到显微物镜6的后焦面处，并被第一镜筒透镜5和第二薄透镜9构成的共焦系统成像到位于第二薄透镜9和第三薄透镜11共焦面处的空间光调制器10上。散射光主要以球面波的形式被显微物镜6收集并被会聚到处于第三薄透镜11后焦面处的相位图像采集模块12上，期间，散射光在空间光调制器10的工作面上是均匀的平面波。

所述散射光和所述非散射光经过空间光调制器10的反射作用后共同入射到第三薄透镜11，并在相位图像采集模块12上产生干涉相移图，散射光和非散射光之间的相位差反映了样品的厚度及折射率等信息。另外，散射光以平面波的形式在空间光调制器10的工作面上不被调制，而非散射光以环形光的形式在空间光调制器10的工作面上进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制。需要说明的是，所述散射光和所述非散射光经过分束镜4时有一半的能量会经过分束镜4的反射作用浪费掉，因此要求组成第一环形光源1的LED有很大的功率，从而保证足够的成像速度。

进一步地，为了提高光的利用效率并保证空间光调制器对光场进行准确的相位调制，本实施例采用反射型的空间光调制器，并且保证第二薄透镜9的主轴与空间光调制器10的工作面法线之间的夹角小于5°，第三薄透镜11的主轴与空间光调制器10的工作面法线之间的夹角小于5°。另外，第一环形光源1发出的光是非偏振光，而空间光调制器10对光场进行相位调制时具有偏振方向选择性，因此，样品的散射光和非散射光在进入空间光调制器10之前需要经过一个线偏振片8的调制，保证它们的偏振方向与空间光调制器10的作用方向相同，进而保证空间光调制器10对射入其工作面的所有光场进行准确的相位调制。

相位图像采集模块12用于采集记录样品在所述相位调制下对应的干涉相移图，根据所述干涉相移图即可获得样品的相位信息。

综上，本实施例的落射式定量相位显微装置可对强散射样品和不透明样品实现三维定量相位成像，无论样品是强散射样品还是不透明样品，产生的散射光和非散射光经过完全相同的光路，因此，本实施例的落射式定量相位显微装置对外界环境扰动具有非常好的免疫抵抗力；其次，由于落射式照明采用很多环形均匀分布的LED进行多角度的倾斜照明，系统的空间分辨率和信噪比得到了显著的提升；另外，该落射式定量相位显微装置的落射式照明使样品更多的轴向频谱信息进入成像系统，极大地提高了装置的轴向分辨率，有利于强散射样品的三维成像；最后，由廉价的LED组成的环形光源在很大程度上简化了该显微装置的光路结构，降低了系统的复杂度和成本。

实施例二

在上述实施例一的基础上，本实施例提供了另一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置。如图3所示，本实施例的定量相位显微装置在实施例一的基础上增加了第二环形光源13，第二环形光源13设置在样品7远离显微物镜6的一侧，用于实现透射式定量相位成像。

在图3所示的装置中，强散射样品和不透明的反射型样品通过实施例一所描述的光路进行探测，而全透明的弱散射样品通过透射式定量相位成像进行成像，具体的光路为第二环形光源13→样品7→显微物镜6→第一镜筒透镜5→线偏振片8→第二薄透镜9→空间光调制器10→第三薄透镜11→相位图像采集模块12。

在本实施例中，第二环形光源13的结构与第一环形光源1类似，由型号完全相同的多个LED绕着环形均匀分布组成，产生大角度照明，LED的波长在可见光范围，要求其具有小的发散角，保证足够高的光强利用率，且要求其具有窄的光谱带宽。第二环形光源13的整体尺寸取决于对样品的照明角度，这里不做限制，但第二环形光源13上每一个LED都存在一定的倾角以使其主轴指向样品7。

对全透明的弱散射样品进行透射式定量相位成像时，第二环形光源13产生的近似平面波照射到样品7上后会产生进入显微物镜6的非散射光和散射光。非散射光以环形光的形式会聚到显微物镜6的后焦面处，并被第一镜筒透镜5和第二薄透镜9构成的共焦系统成像到位于第二薄透镜9和第三薄透镜11共焦面处的空间光调制器10上。期间，非散射光以环形光的形式被空间光调制器10进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制，然后以平面波的形式传播到相位图像采集模块12上。散射光以球面波的形式被显微物镜6和第一镜筒透镜5组成的望远镜系统成像到第一镜筒透镜5的后焦面处，再经过由第二薄透镜9和第三薄透镜11构成的共焦系统成像到相机12的工作面上。最后，所述散射光与所述非散射光在相机的工作面上干涉产生干涉相移图并被相机记录。

与实施例一所述的落射式定量相位成像一致，在透射式定量相位成像模式中，散射光和非散射光的偏振方向也要和空间光调制器起作用的方向一致，因此线偏振片8放置在空间光调制器10之前，对散射光和非散射光进行偏振调制。

在实施例二所示的结构中，透射式定量相位显微部分和实施例一所述的落射式定量相位显微装置共享了探测光路的所有器件，包括显微物镜6、第一镜筒透镜5、线偏振片8、第二薄透镜9、空间光调制器10、第三薄透镜11以及相机12。

综上，本实施例的落射式定量相位显微装置可以使透射式和落射式定量相位显微装置无缝地耦合在一起，不仅可用于强散射样品或不透明反射型样品的落射式定量相位成像，还可用于全透明弱散射样品的透射式定量相位成像。两种定量相位显微模式还可以同时工作，针对同一样品中的弱散射全透明部分，可用透射式定量相位进行观测；而对于较厚的强散射部分就可用落射式定量相位进行观测，实现同一样品的多模式定量相位成像。

实施例三

在上述实施例一的基础上，本实施例提供了另一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置。如图4所示，本实施例是在实施例一的基础上增加了荧光激发与探测部分，用于实现荧光和相位的双模式成像。这里不限制荧光显微成像的具体结构，仅以普通宽场荧光显微镜为例。

在本实施例中，在实施例一的装置的基础上，还包括第一二向色镜14、第二镜筒透镜15、第二二向色镜16、荧光图像采集模块17和荧光激发光源18，其中，第一二向色镜14倾斜设置在第一镜筒透镜5与显微物镜6之间，第二镜筒透镜15和荧光图像采集模块17同轴设置在第一二向色镜14的一侧，第二二向色镜16倾斜设置在第二镜筒透镜15与荧光图像采集模块17之间，荧光激发光源18用于产生平行光，且平行光能够依次经过第二二向色镜16、第二镜筒透镜15和第一二向色镜14入射到显微物镜6中。

具体地，第一二向色镜14用于将荧光显微模式与落射式定量相位显微模式耦合起来，要求其表面曲率半径在一千米左右，也就是对其表面反射光引起的波前变形小于五分之一波长，从而避免对反射的荧光通道引起像差。第二镜筒透镜15为用于减小系统像差。第二二向色镜16用于将荧光激发和探测耦合起来。荧光图像采集模块17用于采集荧光图像，其像素的尺寸及数量应满足成像系统采样率和视野的要求。荧光激发光源18根据实际需求选择波长。

本实施例使荧光显微模式与落射式定量相位显微模式耦合在一起，在本实施例中，落射式定量相位显微结构与实施例一完全相同，这里不再赘述。对于荧光显微成像模式而言，其由荧光激发和荧光采集两部分组成，两部分由第二二向色镜16耦合在一起。具体地，荧光激发光源18产生的平行光经过第二二向色镜16的反射作用后，先后经过第二镜筒透镜15的会聚作用、第一二向色镜14的反射作用、以及显微物镜6的准直作用后均匀地照射到荧光标记后的样品7上。激发后产生的荧光信号先后经过显微物镜6、第一二向色镜14、第二镜筒透镜15、第二二向色镜16后被荧光图像采集模块17接收。可以根据实际需求改变荧光激发光源18、第一二向色镜14及第二二向色镜16的光谱结构，从而实现不同荧光信号的探测。本实施例将荧光显微模式和落射式定量相位显微模式结合在一起，可以对同一样品实现荧光和相位的双模式同步成像。

实施例四

在上述实施例二的基础上，本实施例提供了另一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置。请参加图5，本实施例是在实施例二的基础上增加了荧光激发与探测部分，用于同时实现荧光成像定量相位成像模式、透射式及落射式定量相位成像。各个部分的结构与前述实施例相同，这里不再赘述。

本实施例的定量相位显微装置具有高的测量精度，通过落射式照明结构可有效提高系统的轴向分辨率，可对厚的组织样品实现三维定量相位成像，同时可对不透明的样品进行纳米级分辨率的三维形貌检测；可对透射式显微技术无法观测的厚组织及不透明样品进行实时、无标记、高分辨的原位检测，并且可以和各类荧光显微技术相结合构成多模态显微成像系统。综上所述，该装置稳定性高、获取的图像质量高、可对厚组织或不透明的样品进行实时定量相位成像，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。

实施例四

在实施例一的基础上，本实施例提供了一种基于环形光照明的落射式定量相位显微方法，包括：

S1：利用实施例一所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置获得样品的多个干涉相移图；

具体地，打开照明光源；通过空间光调制器对样品的非散射光进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制；利用相位图像采集模块记录样品在所述相位调制下对应的干涉相移图；根据多个所述干涉相移图计算获得所述样品的相位信息。

S2：根据多个所述干涉相移图计算获得所述样品的相位信息。

具体地，所述S2包括：

S21：获取相位图像采集模块探测到的各个所述干涉相移图的总光强分布：

其中，

表示空间光调制器对样品非散射光调制的相位，I₀(x,y)表示非散射光的总强度，I_s(x,y)表示散射光的总强度，Γ(x,y)表示散射光与非散射光之间的二维互相干函数，

表示样品对光场的相位调制函数；

S22：利用所述总光强分布计算得到样品的相位分布：

以下将对步骤S2所述的计算过程进行详细描述。

本发明实施例中的环形光源由多个型号完全相同的LED组成，每一个LED发出的照明光是具有一定波长范围的自然光。对于某一个LED发出的一列单色波而言，其角频率可以表示为w，在该列波照射下，假设样品7是一个非均匀的散射介质，其折射率分布可以表示为

其中，

表示该散射介质的三维坐标。为简单起见，本实施例仅考虑垂直照明的情况，也就是说，角频率为w的单色波沿着垂直于样品面的方向正向传播并照射到散射介质上。该列照明光的复振幅可表示为：

其中，A(w)表示该列照明光的振动幅值，k₀＝w/c＝2π/λ表示该列照明光在真空中的波数，λ表示波长，n₀表示背景空间的折射率，z表示z轴坐标。该列照明光波在上述散射介质内传播时产生的总光场可以表示为

其满足非均匀介质中的Helmholtz方程，即：

其中，

表示拉普拉斯运算，

表示散射介质的散射势。本质上讲，总光场

是照明光场

与散射场

的线性叠加。因此，在一阶Born近似下，方程(1)可化为：

对方程(2)两端进行空间傅里叶变换并进行简单计算可以得到：

其中，

表示散射介质的频谱坐标，k＝n₀·k₀，

～表示变量在空间域上的傅里叶变换。方程(3)右侧的两项分别表示沿Z轴正向和反向传播的散射场。进一步地，对方程(3)两端进行相对于g_z的逆空间傅里叶变换，也即求解散射场沿Z轴传播的空间分布，可得到：

其中，

其中，

和

分别表示前向散射场和背向散射场，也就是沿Z轴正向和反向传播的光场。值得注意的是，照明光场U_i也是沿Z轴正向传播的。因此，对于透射式定量相位成像而言，探测器探测到的光场是前向散射场

和照明光场U_i的总和，也就是：

假定散射介质沿Z轴的厚度为L，则方程(6)就可进一步计算为：

其中，

表示散射介质沿Z轴的平均折射率。因此，对全透明的样品进行透射式定量相位成像时，本实施例通过成像恢复得到的相位值就是

而对于本发明实施例中的落射式定量相位成像而言，如果样品是不透明的反射型样品，则探测器探测到散射场与方程(4)和(5)完全一致，唯一的区别在于，计算得到相位值是

值得注意的是，对于强散射样品而言，本发明实施例的落射式定量相位显微成像采集到的信号包含两个部分，一部分是背向散射场

另一部分是照明光场U_i在样品玻片底部反射回的非散射光，此时，本发明实施例的落射式定量相位显微装置采集到的信号就可表示为：

进一步地，方程(8)可计算为：

因此，对于强散射样品的落射式定量相位成像而言，本实施例通过定量相位成像恢复得到的相位值就是：

不同于透射式定量相位成像，该落射式定量相位成像装置恢复得到相位值是样品不同层折射率差的指数加权和，这也说明落射式定量相位成像具有更高的轴向分辨率。需要指出的是，为了计算的简单性，本实施例在前述推导过程中令照明光为沿Z轴正向传播的平面波，而落射式定量相位显微成像中运用了由LED环形分布组成的环形光源，实际的照明光应该表示为：

其中，

表示照明波矢的单位向量。另外，对于小的相移来说，

因此，针对方程(7)和(9)而言，相机探测到的总光强就可表现为如下形式：

其中，I₀(x,y)表示非散射光的总强度，I_s(x,y)表示散射光的总强度，Γ(x,y)表示散射光与非散射光之间的二维互相干函数，

表示样品对光场的相位调制函数。对于透射式定量相位成像中的全透明样品而言，

对于本发明实施例的落射式定量相位成像中的不透明反射型样品而言，

而对于落射式定量相位显微成像中的强散射样品而言，

在本发明实施例中，利用一个高速空间光调制器对不被样品影响的非散射光进行一系列的相位调制(

0.5π，π，及1.5π)，如图6所示，浅灰色方形区域表示空间光调制器的工作面；环形分布的多个黑色圆形表示聚焦的非散射光；覆盖多个圆形非散射光光斑的环形区域内顺次添加一系列相位值。进而，方程(10)可表示为：

因此，利用简单的反正切函数可计算得到样品的相位分布：

同时，可以很容易计算得到散射光与非散射光之间的互谱密度(也就是三维互相干函数

的空间傅里叶变换)：

这里，

其中，

是散射势

的三维空间傅里叶变换；

表示散射光的单位向量；

表示散射介质的频谱坐标。由此可知，定量相位显微成像本质上是样品散射势的低通滤波过程，而方程(14)表示的就是环形LED照明下定量相位显微系统的传递函数，该式对透射式和落射式定量相位显微成像都适用。从公式(14)可知，定量相位显微成像的空间分辨率与多个因素有关，首先是探测物镜收集散射信号的能力，也就是数值孔径NA_det，反映在

的积分范围上；然后是环形光源的照明角度，也就是环形光源的数值孔径NA_s，反映在

相对于Z轴的夹角上；最后是环形光源的波长λ，反映在真空中的波数k₀上。

图7和图8分别给出了透射式定量相位显微成像和落射式定量相位显微成像的传递函数示意图。从图中可以看出，环形光源极大地拓展了成像系统接收横向频谱信息的能力，而本发明实施例的落射式定量相位显微则进一步拓展了系统接收轴向频谱信息的能力。因此，该落射式定量相位显微装置可以探测透射式定量相位显微模式无法探测的强散射样品。根据瑞利判据，在环形光源照明下，透射式定量相位显微和落射式定量相位显微的横向空间分辨率均可计算为λ/(NA_s+NA_det)。而它们的轴向分辨率表达极为不同。透射式定量相位显微成像的轴向分辨率可计算为λ/n₀/[1-cos(asin(NA_s/n₀))]；而本发明实施例的落射式定量相位显微成像的轴向分辨率计算为λ/n₀/[1+cos(asin(NA_s/n₀))]。比较二者的轴向分辨率表达式可以知道，本发明实施例的落射式定量相位显微装置极大地提高了系统接收轴向频谱信息的能力，也就是说落射式照明极大地提高了系统的轴向分辨率。

另外，本发明实施例的落射式定量相位显微装置使用的环形光源是由多个具有一定光谱范围的LED组成的，一方面，单个LED自身的部分相干特性及不同LED之间的非相干特性避免了激光等相干光源带来的散斑噪声；另一方面，环形光源多个LED的平均效应可以有效地提高图像质量。值得注意的是，传统的定量相衬显微技术还需要对非散射光进行幅值衰减，不可避免地增加了结构的复杂度。相比而言，本发明实施例的落射式定量相位显微模式和透射式定量相位显微模式均去除了对非散射光的幅值调制模块，这是因为，公式(12)完全去除了对非散射光的幅值调制作用，因此，本发明在保证准确获取散射样品相位的前提下极大地简化了系统的结构。

以下通过实验对基于环形光照明的落射式定量相位显微装置的性能进行进一步描述。

半导体硅晶片是一种不透明的材质，其表面可通过专门的工艺刻蚀数以百万计的微型晶体管，对这些微型器件的加工质量进行实时检测对于集成电路的制造非常关键。利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置，对透射式显微系统无法观测的硅晶片进行了反射式定量相位成像，结果如图9A至图9C所示，其中，图9A是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对半导体硅晶片进行反射式定量相位成像时非散射光在空间光调制器表面所成的像。为了实现对该半导体硅晶片样品的定量相位成像，本实施例利用空间光调制器对图9A所示的非散射光区域进行了四步相位调制，也就是0，0.5π，π和1.5π，并利用sCOMS相机进行了数据的同步采集，见图9B所示。然后利用公式(12)对这四张相移图进行计算得到了该硅晶片对照明光的相位调制图，进一步地利用公式

可计算获得硅晶片表面微型器件的厚度分布图，如图9C所示，其中左下角所示为微结构的高度标尺，图中相同的颜色对应相同的高度。由图9A至图9C所示的一系列结果可见，本发明实施例的落射式定量相位显微装置可对透射式显微系统无法探测的不透明反射型样品进行高分辨率无标记检测。

进一步地，利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对比较厚的菠萝切片进行了落射式定量相位成像。对于强散射样品而言，照明光透过它们时会发生很强的散射，几乎不会产生不受样品影响的非散射光，因此无法用传统的透射式定量相位显微装置对生物组织等强散射样品进行定量相位显微成像。相比而言，本发明实施例的落射式定量相位显微装置具有很高的轴向分辨率，可以对厚组织等样品进行高分辨率的定量相位成像。图10A是利用本发明实施例的落射式定量相位显微装置对菠萝切片进行落射式定量相位成像时非散射光在空间光调制器表面所成的像。需要说明的是，这里的非散射光来自于环形光源在样品玻片底部的反射。进一步地，利用空间光调制器对图10A所示的非散射光区域进行了四步相位调制，得到了如图10B所示的四张相移图。然后利用公式(12)计算得到了该菠萝切片对照明光的相位调制图，如图10C所示。如前所述，强散射样品的落射式定量相位成像和弱散射样品的透射式定量相位成像本质上是一致的，但利用它们获得的相位分布具有不同的物理意义，本发明实施例的落射式定量相位显微装置为不透明的反射型样品和厚的强散射样品带来了新的定量显微成像途径。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，包括第一环形光源(1)、工业镜头(2)、第一薄透镜(3)、分束镜(4)、第一镜筒透镜(5)、显微物镜(6)、线偏振片(8)、第二薄透镜(9)、空间光调制器(10)、第三薄透镜(11)和相位图像采集模块(12)，其中，

所述第一环形光源(1)、所述工业镜头(2)和所述第一薄透镜(3)沿光传播方向依次同轴设置在所述分束镜(4)的入射光路上，所述第一镜筒透镜(5)和所述显微物镜(6)沿光传播方向依次同轴设置在所述分束镜(4)的反射光路上，所述第一镜筒透镜(5)和所述显微物镜(6)共焦，样品(7)放置在所述显微物镜6的前焦面；

所述线偏振片(8)、所述第二薄透镜(9)和所述空间光调制器(10)按照与所述分束镜(4)从近到远的顺序依次设置在所述分束镜(4)与所述第一镜筒透镜(5)相反的一侧，且所述线偏振片(8)和所述第二薄透镜(9)位于所述空间光调制器(10)的入射光轴；

所述第三薄透镜(11)和所述相位图像采集模块(12)依次设置在所述空间光调制器(10)的反射光轴，所述第二薄透镜(9)和所述第三薄透镜(11)构成共焦系统；

所述空间光调制器(10)能够对所述样品(7)的非散射光进行相位调制以得到所述样品(7)的多个干涉相移图，所述相位图像采集模块(12)用于采集所述多个干涉相移图。

2.根据权利要求1所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述第一环形光源(1)由环形均匀分布的多个同型号的LED组成，且每个LED的轴线均指向所述工业镜头(2)的中心。

3.根据权利要求1所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述空间光调制器(10)能够对所述样品(7)的非散射光进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制。

4.根据权利要求1所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述第二薄透镜(9)的主轴与所述空间光调制器(10)的工作面法线之间的夹角小于5°，所述第三薄透镜(11)的主轴与所述空间光调制器(10)的工作面法线之间的夹角小于5°。

5.根据权利要求1所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述样品(7)为不透明样品或透明样品。

6.根据权利要求1所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，还包括第二环形光源(13)，所述第二环形光源(13)设置在所述样品(7)远离所述显微物镜(6)的一侧。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，还包括第一二向色镜(14)、第二镜筒透镜(15)、第二二向色镜(16)、荧光图像采集模块(17)和荧光激发光源(18)，其中，

所述第一二向色镜(14)倾斜设置在所述第一镜筒透镜(5)与所述显微物镜(6)之间，

所述第二镜筒透镜(15)和所述荧光图像采集模块(17)同轴设置在所述第一二向色镜(14)的一侧，所述第二二向色镜(16)倾斜设置在所述第二镜筒透镜(15)与所述荧光图像采集模块(17)之间，

所述荧光激发光源(18)用于产生平行光，且所述平行光能够依次经过所述第二二向色镜(16)、所述第二镜筒透镜(15)和所述第一二向色镜(14)入射到所述显微物镜(6)中。

8.一种基于环形光照明的落射式定量相位显微方法，其特征在于，包括：

S1：利用权利要求1至5中任一项所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置获得样品的多个干涉相移图；

S2：根据多个所述干涉相移图计算获得所述样品的相位信息。

9.根据权利要求8所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述S1包括：

S11：打开照明光源；

S12：通过空间光调制器对样品的非散射光进行0、0.5π、π和1.5π的相位调制；

S13：利用相位图像采集模块记录样品在所述相位调制下对应的干涉相移图。

10.根据权利要求8所述的基于环形光照明的落射式定量相位显微装置，其特征在于，所述S2包括：

S21：获取相位图像采集模块探测到的各个所述干涉相移图的总光强分布：

其中，

表示空间光调制器对样品非散射光调制的相位，I₀(x,y)表示非散射光的总强度，I_s(x,y)表示散射光的总强度，Γ(x,y)表示散射光与非散射光之间的二维互相干函数，

表示样品对光场的相位调制函数；

S22：利用所述总光强分布计算得到样品的相位分布：

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