CN114858752A - 基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法 - Google Patents

基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置和方法，所述装置包括沿光束传播方向依次设置的环形光源、显微物镜、镜筒透镜、第一线偏振片、第一透镜、空间光调制器、第二透镜、第二线偏振片和图像采集模块，其中，环形光源用于发射环形光束，显微物镜与镜筒透镜的共焦面形成显微成像装置的光瞳面；第一线偏振片用于将物光波分为沿第一方向的偏振物光波和沿第二方向的偏振物光波；空间光调制器用于加载相位调制图案；图像采集模块用于采集多张微分干涉相衬图像。本发明结构和计算过程简单，且共路径干涉的光学结构使装置对外界扰动具有非常强的免疫性，具有高的时间和空间相位灵敏度。

Description

基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法
技术领域
本发明属于光学显微成像技术领域，具体涉及一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法。
背景技术
光学显微镜自发明以来，作为一种非侵入式的成像技术在许多领域发挥着不可替代的作用。然而，传统的明场显微镜只能获得样品的振幅信息，无法对透明样品进行高对比度成像。荧光显微镜通过探测荧光物质受激发时产生的荧光信号可对样品的显微结构进行选择性成像。然而，荧光标记引起的光毒性及光漂白性等问题限制了荧光显微镜的应用范围。相比而言，定量相位显微镜无需荧光标记，可对样品进行原位定量检测，在生命医学研究及工业检测等领域具有重要的应用价值。
定量相位显微镜在近十年得到了快速的发展，研究人员先后开发了多种相位恢复算法及成像系统。其中，数字全息显微镜将全息技术和显微成像相结合，通过对相机记录的干涉图样进行数字恢复，可再现出透明样品的相位分布，已发展成为定量相位显微成像的金标准。研究人员通过对样品进行环形机械扫描，极大地提高了数字全息显微镜的空间分辨率，但这也限制了其时间分辨率。数字全息显微镜具有很高的测量精度，但其需要额外的参考光，对光源的相干性要求较高。为了获得样品的相位分布信息并去除相干光源引起的散斑噪声，数字全息显微技术需要进行复杂的图像处理。另一方面，基于单光束衍射的定量相位显微技术通过对一系列衍射图案进行迭代计算即可获得样品的相位分布信息，具有成本低，结构简单等优点。其中，傅立叶叠层显微成像技术整合了相位恢复和合成孔径效应，利用不同角度的发光二极管对样品进行顺次照明，并进行空间域和频域之间的反复迭代运算，可以恢复得到分辨率明显增强的相位分布信息。然而，利用这类技术重建一张相位图像需要采集多张原始图像，因此成像速度受到了很大的限制。另外，这类技术需要通过复杂的图像处理才能获得样品的相位信息，重建参数及模型的选择极易引起计算误差。基于则涅克相衬的定量相位显微技术，在环形宽光谱照明下，通过对样品的非散射光进行一系列相位调制，可对透明样品的相位分布信息进行高质量重建。这类技术具有共路径干涉的光学结构，对环境扰动具有非常好的免疫性。值得一提的是，基于则涅克相衬的定量相位显微技术需要仅对非散射光进行相位调制，才能避免光晕伪影并获得样品的准确相位信息。然而，现存的基于则涅克相衬的定量相位显微镜中，环形光源的有效宽度很难做到很窄，导致散射光受到不正确的相位调制，进而影响相位图像的质量和准确性。另一方面，基于则涅克相衬的定量相位显微技术对强散射样品进行成像时，无法在成像系统的光瞳面处产生聚焦的非散射光来进行相移操作，因此该技术无法对强散射样品进行相位恢复。
相比而言，基于微分干涉相衬的定量相位显微技术继承了微分干涉相衬显微镜高轴向分辨率的特点，可以对厚组织等强散射样品进行高质量的定量相位成像。目前，有多种途径可以实现基于微分干涉相衬的定量相位显微成像。梯度光微分干涉显微技术将空间光调制器耦合进传统的微分干涉相衬显微镜中，可对斑马鱼卵等厚的组织样品进行三维定量成像。然而，这种方法中沃拉斯顿棱镜的使用限制了该成像系统的拓展性和应用范围。基于结构光照明的定量微分干涉相衬显微技术利用数字微镜阵列对平行的激光束进行结构化的调制，然后结合相移操作和角谱传递技术对透明样品实现了定量相位成像。该方法结构复杂，不易与其他成像系统进行耦合，并且高相干激光引起的散斑噪声极大地降低了图像的质量。基于光栅调制的定量微分干涉相衬显微技术利用幅值型空间光调制器对样品的频谱进行调制，从而在相机面获得多个相互交错重叠的物光波，结合相移操作即可恢复得到样品的相位分布信息。然而，这种方法要求被测样品的振幅在空间上没有变化，也就是说，样品的振幅梯度为0。对于常规样品来说，利用这种方法恢复得到的相位分布都存在一定的误差。另外，振幅型空间光调制器的使用限制了该技术与其他成像技术的兼容和耦合。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
本发明的一个方面提供了一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，包括沿光束传播方向依次设置的环形光源、显微物镜、镜筒透镜、第一线偏振片、第一透镜、空间光调制器、第二透镜、第二线偏振片和图像采集模块，其中，
所述环形光源用于发射环形光束，且所述环形光束均指向所述显微物镜的物方焦点处，待测样品位于所述显微物镜前焦面处；所述显微物镜与所述镜筒透镜的共焦面形成所述显微成像装置的光瞳面；
所述第一线偏振片用于将来自所述镜筒透镜的物光波分为沿第一方向的偏振物光波和沿第二方向的偏振物光波，所述第一方向与所述第二方向均位于垂直于光束传播方向的平面上且相互垂直；
所述空间光调制器用于加载相位调制图案且仅对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜的后焦面处产生剪切偏移；
所述第二线偏振片仅允许来自所述第二透镜的第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波沿第二线偏振片起偏方向的偏振分量通过，使第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波在第二透镜的后焦面产生相干叠加；
所述图像采集模块用于采集第一方向偏振物光波与经过所述空间光调制器相位调制后的第二方向调制偏振物光波在所述第二透镜的后焦面处进行相干叠加产生的多张微分干涉相衬图。
在本发明的一个实施例中，所述环形光源包括多个部分相干的发光二极管，所述发光二极管均匀分布在环形骨架上，且每个发光二极管的轴线均指向所述显微物镜的物方焦点处。
在本发明的一个实施例中，所述第一线偏振片与所述第二线偏振片的起偏方向相同，均与所述第二方向呈45°。
在本发明的一个实施例中，所述空间光调制器上分别加载有第一相位调制图案和第二相位调制图案，并且对所述第一相位调制图案和所述第二相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，以对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，其中，经所述第一相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜的后焦面处产生沿第一方向的剪切偏移，经所述第二相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜的后焦面处产生沿第二方向的剪切偏移。
在本发明的一个实施例中，所述第一透镜和所述第二透镜均为双胶合消色差透镜。
在本发明的一个实施例中，通过将所述第一线偏振片和所述第二线偏振片的起偏方向调节成与所述第二方向平行，同时在所述空间光调制器上加载不同相位的环形相位掩膜，能够将所述定量微分干涉相衬显微成像装置调节为透射式定量则涅克相衬显微模式。
本发明的另一方面提供了一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像方法，包括：
S1：利用上述实施例中任一项所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置获得样品的多张微分干涉相衬图；
S2：利用所述多张微分干涉相衬图获得所述样品的相位信息。
在本发明的一个实施例中，所述S1包括：
打开照明光源；
在所述空间光调制器上加载第一相位调制图案，并对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第一方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像；
在所述空间光调制器上加载第二相位调制图案，并对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第二方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像。
在本发明的一个实施例中，所述S2包括：
S21：利用所述微分干涉相衬图像计算获得所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布；
S22：利用所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布计算获得样品的相位分布。
在本发明的一个实施例中，所述S22还包括：
利用公式
Figure BDA0003546253480000061
获得待测样品的平均折射率分布
Figure BDA0003546253480000062
和三维形貌h(x,y)，其中，n0表示样品周围介质的折射率，λ0表示环形光源上发光二极管的中心波长。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，利用相位型空间光调制器的偏振调制特性，可同时在成像面获得无剪切偏移和有剪切偏移的两束物光波，再经过简单的计算后即可实现定量微分干涉相衬显微成像，结构和计算过程非常简单，继承了微分干涉相衬显微镜高轴向分辨率的特点，可对厚的组织样品进行三维定量相位成像；无剪切偏移和有剪切偏移的两束物光波历经完全相同的光学器件，对外界扰动具有非常强的免疫性，因此本发明的装置拥有非常高的时间相位灵敏度。
2、本发明装置的照明系统仅由多个环形均匀分布的发光二极管组成，结构简单，成本低廉；该环形光源产生的大角度部分相干照明使本发明装置拥有非常高的横向空间分辨率和空间相位灵敏度；另外，该装置具有非常高的时间分辨率，可用于捕捉快速的动态过程。
3、本发明基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置的光学结构与基于则涅克相衬的定量相位显微模式完全相同，仅通过对该显微成像装置中的线偏振片进行旋转就可实现二者之间的轻松切换，因此，所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置可对各类散射样品进行实时、无标记、且高分辨率的原位定量检测，并且在结构和功能上拥有非常好的拓展性，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。
以下将结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置的光路结构示意图；
图2是本发明实施例提供一种透射式定量则涅克相衬显微成像模式的光路结构示意图；
图3是5微米聚苯乙烯小球的定量微分干涉相衬显微成像；
图4是本发明实施例的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微系统的空间和时间相位灵敏度的定量检测结果；
图5是利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对红细胞进行的定量微分干涉相衬显微成像结果；
图6是利用本发明实施例的定量则涅克相衬显微成像模式对红细胞进行的定量则涅克相衬显微成像结果；
图7是红细胞的定量微分干涉相衬显微成像和定量则涅克相衬显微成像之间的误差图像；
图8是利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对贴附在玻片上的油滴进行的定量微分干涉相衬显微成像；
图9是利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对10微米厚的小鼠颌下腺组织切片进行的定量微分干涉相衬显微成像。
附图标记说明：
1-环形光源；2-样品；3-显微物镜；4-镜筒透镜；5-第一线偏振片；6-第一透镜；7-空间光调制器；8-第二透镜；9-第二线偏振片；10-图像采集模块。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及具体实施方式，对依据本发明提出的一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置及方法进行详细说明。
有关本发明的前述及其他技术内容、特点及功效，在以下配合附图的具体实施方式详细说明中即可清楚地呈现。通过具体实施方式的说明，可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效进行更加深入且具体地了解，然而所附附图仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明的技术方案加以限制。
应当说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。
实施例一
请参见图1，图1是本发明实施例提供的一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置的光路结构示意图。该定量微分干涉相衬显微成像装置包括沿光束传播方向依次设置的环形光源1、显微物镜3、镜筒透镜4、第一线偏振片5、第一透镜6、空间光调制器7、第二透镜8、第二线偏振片9和图像采集模块10，其中，环形光源1用于发射环形光束，且所发射的环形光束均指向显微物镜3的物方焦点处，待测样品2位于显微物镜3前焦面处；显微物镜3与镜筒透镜4的共焦面形成显微成像装置的光瞳面；第一线偏振片5用于将来自镜筒透镜4的物光波分为沿第一方向(定义为X轴方向)的偏振物光波和沿第二方向(定义为Y轴方向)的偏振物光波，第一方向与第二方向均位于垂直于光束传播方向(定义为Z轴方向)的平面上且相互垂直；空间光调制器7用于加载预定相位调制图案且仅对沿第二方向的偏振物光波进行调制，调制后的第二方向偏振物光波在第二透镜8的后焦面处产生剪切偏移；第二线偏振片9仅允许来自第二透镜8的第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波沿第二线偏振片9起偏方向的偏振分量通过，使第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波在第二透镜8的后焦面产生相干叠加；图像采集模块10用于采集第一方向偏振物光波与经过空间光调制器7相位调制后的第二方向调制偏振物光波在第二透镜8的后焦面处进行相干叠加产生的多张微分干涉相衬图。
进一步地，本实施例的环形光源1包括多个部分相干的发光二极管，所述发光二极管均匀分布在环形骨架上，且每个发光二极管的轴线均指向显微物镜3的物方焦点处。具体地，环形光源1由多个同型号的发光二极管在环形骨架上均匀分布构成。为了尽可能多地收集发光二极管发出的光，每个发光二极管的轴线均指向显微物镜3的物方焦点处。处于显微物镜3前焦面处的样品2在环形光源1的照射下产生携带有样品幅值和相位信息的物光波。在显微物镜3的傅里叶变换作用下，该物光波的频谱呈现在显微物镜3与镜筒透镜4的共焦面处，该共焦面即为整个显微成像装置系统的光瞳面。
经过镜筒透镜4的傅里叶变换作用后，衍射受限的物光波被放大成像至镜筒透镜4与第一透镜6的共焦面处，此处物光波的高频信息已被显微成像装置系统的光瞳口径限制。
在本实施例中，第一线偏振片5与第二方向(即Y轴方向)呈45°。具体地，衍射受限的物光波经过起偏方向与Y轴呈45度的第一线偏振片5后分为等功率的X方向偏振物光波和Y方向偏振物光波。
本实施例的空间光调制器7为相位型空间光调制器，其对光场的调制具有偏振选择性，在本实施例的装置中，该相位型空间光调制器7仅对沿Y轴方向偏振的光场起作用。而X方向的偏振物光波不受相位型空间光调制器7的调制作用，经过第一透镜6与第二透镜8构成的共焦系统后直接成像到第二透镜8的后焦面处。相比而言，Y方向的偏振物光波经过第一透镜6的傅里叶变换作用后，其频谱的相位信息受到处于第一透镜6与第二透镜8共焦面处的相位型空间光调制器7的调制作用，再经过第二透镜8的傅里叶变换作用后，Y方向的偏振物光波成像到第二透镜8的后焦面处，并产生剪切偏移，如图1所示。剪切偏移的方向与加载在相位型空间光调制器7上的相位调制图案有关，一般取X方向和Y方向。
进一步地，第二线偏振片9与第一线偏振片5的起偏方向相同，与所述第二方向呈45°。X方向的偏振物光波以及产生剪切偏移的Y方向的偏振物光波经过起偏方向与Y轴呈45度的第二线偏振片9以后，只有与第二线偏振片(9)起偏方向相同的偏振分量通过，并于第二透镜(8)的后焦面产生相干叠加，随后被位于第二透镜8后焦面处的图像采集模块10探测。此时图像采集模块10探测到的强度信号仅包含物光波相位梯度的余弦值。
进一步地，本实施例的空间光调制器7上分别加载有第一相位调制图案和第二相位调制图案，并且对所述第一相位调制图案和所述第二相位调制图案，以对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，其中，经所述第一相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在第二透镜8的后焦面处产生沿第一方向的剪切偏移，经所述第二相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜8的后焦面处产生沿第二方向的剪切偏移，据此，在图像采集模块10处采集到与不同相位值对应的八张微分干涉相衬图。
具体地，为了定量获得物光波的相位梯度分布，相位型空间光调制器7在加载原有预定第一相位调制图案和第二相位调制图案的同时所有像素额外分别添加0、0.5π、π以及1.5π的相位值，并由图像采集模块10分别记录获得八张微分干涉相衬图像。也就是说，对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，以对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，会在第二透镜8的后焦面处产生沿第一方向的剪切偏移，偏移量与第一相位调制图案有关，并与第一方向偏振物光波在第二透镜8的后焦面处进行相干叠加，产生能够反映目标样品X方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像。对应的，对所述第二相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，以对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，会在第二透镜8的后焦面处产生沿第二方向的剪切偏移，偏移量与第二相位调制图案有关，并与第一方向偏振物光波在第二透镜8的后焦面处进行相干叠加，产生能够反映目标样品Y方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像。
分别根据上述能够反映目标样品X方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像，以及能够反映目标样品Y方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像，再通过简单的三角函数计算，就可定量获得该剪切方向上物光波的相位梯度分布。在获得X方向(第一方向)和Y方向(第二方向)物光波的相位梯度分布后，再利用Frankot-Chellappa公式即可定量获得样品的相位分布信息。
综上所述，本实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，利用相位型空间光调制器的偏振调制特性，可同时在成像面获得无剪切偏移和有剪切偏移的两束物光波，再经过简单的计算后即可实现定量微分干涉相衬显微成像，结构和计算过程非常简单，继承了微分干涉相衬显微镜高轴向分辨率的特点，可对厚的组织样品进行三维定量相位成像；无剪切偏移和有剪切偏移的两束物光波历经完全相同的光学器件，对外界扰动具有非常强的免疫性，因此本发明的装置拥有非常高的时间相位灵敏度。本实施例的装置的照明系统仅由多个环形均匀分布的发光二极管组成，结构简单，成本低廉；该环形光源产生的大角度部分相干照明使本发明装置拥有非常高的横向空间分辨率和空间相位灵敏度；另外，该装置具有非常高的时间分辨率，可用于捕捉快速的动态过程。
实施例二
在上述实施例的基础上，本实施例通过对定量微分干涉相衬显微成像装置的简单调整，即可转换为透射式定量则涅克相衬显微成像模式。请参见图2，图2是本发明实施例提供的一种透射式定量则涅克相衬显微成像模式的光路结构示意图。本实施例在实施例一的基础上，第一线偏振片5和第二线偏振片9的起偏方向相同，均与所述第二方向平行。
具体地，本实施例将第一线偏振片5和第二线偏振片9的起偏方向旋转至Y轴方向，以保证成像系统中光波的偏振方向与空间光调制器7起作用的偏振方向一致，如此，就可对弱散射样品实现透射式定量则涅克相衬显微成像。
相应地，在空间光调制器7上分别加载不同相位(0、0.5π、π以及1.5π)的环形相位掩膜，以在图像采集模块10处采集到与不同环形相位掩膜对应的四张相移强度图。
具体地，环形光源1照射到位于显微物镜3前焦面处的样品2后，产生携带有样品幅值和相位信息的物光波。该物光波由不受样品影响的非散射光和包含样品信息的散射光组成，其中，非散射光经过由显微物镜3、镜筒透镜4及第一透镜6组成的双共焦系统后以环形光源的形式成像到位于第一透镜6与第二透镜8共焦面处的空间光调制器7上。空间光调制器7先后加载值为0、0.5π、π以及1.5π的环形相位掩膜对非散射光进行相位调制，调制后的非散射光以平面波的形式传播到图像采集模块10上。
另一方面，散射光经过由显微物镜3、镜筒透镜4、第一透镜6及第二透镜8组成的三个共焦系统后以球面波的形式传播到图像采集模块10上。散射光与非散射光在第二透镜8的后焦面处发生干涉并先后产生4张相移强度图，然后利用简单的相移算法即可获得弱散射样品的相位分布信息。
本实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置的光学结构与透射式定量则涅克相衬显微成像装置完全相同，仅通过对该显微成像装置中的线偏振片进行旋转就可实现二者之间的轻松切换，因此，本发明实施例所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置可对各类散射样品进行实时、无标记、且高分辨率的原位定量检测，并且在结构和功能上拥有非常好的拓展性，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。
实施例三
在实施例一的基础上，本实施例提供了一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微方法，包括：
S1：利用实施例一中所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置获得样品的多张微分干涉相衬图。
具体地，打开照明光源；在所述空间光调制器上加载第一相位调制图案，并对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第一方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像；在所述空间光调制器上加载第二相位调制图案，并对所述第二相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第二方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像。
S2：利用所述多张微分干涉相衬图获得所述样品的相位信息。
在本实施例中，所述S2包括：
S21：利用所述微分干涉相衬图像计算获得所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布；
S22：利用所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布计算获得样品的相位分布。
对于本发明实施例所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其详细的成像机理如下：
为了保证空间光调制器对光场进行准确的相位调制，本发明实施例所使用的环形光源由多个型号完全相同的窄带宽发光二极管组成，波长范围为λ0±20纳米。其中，每个发光二极管发出的光是具有一定波长范围的自然光。对于本发明实施例所使用的光学元件而言，±20纳米的光谱带宽相对于中心波长λ0所产生的光学偏移不会超过衍射极限的二十分之一。因此，为简化起见，每个发光二极管的光谱用其平均波长λ0表示。现考虑一个位于显微物镜3物方焦面处的非均匀散射样品，其复振幅表示为
Figure BDA0003546253480000141
其中，(x,y)表示样品面的空间域坐标，a(x,y)表示样品的振幅信息，
Figure BDA0003546253480000143
表示样品的相位信息。该样品在某一个发光二极管发出的近似平面波的照明下所产生的光场表示为：
Figure BDA0003546253480000142
其中，m表示发光二极管的序号，n0表示样品周围介质的折射率，φ表示照明波矢与Z轴之间的夹角；θm表示照明波矢在X-Y平面内的投影与X轴之间的夹角。
在先不考虑第二线偏振片9的条件下，光场sm(x,y)依次经过图1中所示的光学元件——显微物镜3、镜筒透镜4、第一线偏振片5、第一透镜6、相位型空间光调制器7和第二透镜8后，在图像采集模块10处分别产生沿X轴方向偏振的物光场(用
Figure BDA0003546253480000151
表示)以及沿Y轴方向偏振的物光场(用
Figure BDA0003546253480000152
表示)。值得注意的是，相位型空间光调制器7仅对沿Y轴方向偏振的光波起作用，因此在图像采集模块10处，沿X轴方向偏振的物光场和沿Y轴方向偏振的物光场分别表示为：
Figure BDA0003546253480000153
Figure BDA0003546253480000154
其中，(x',y')表示图像采集模块10处的空间域坐标，(ξ,η)表示光瞳面处的频域坐标，
Figure BDA0003546253480000155
表示光场sm(x,y)沿X轴方向的偏振分量，
Figure BDA0003546253480000156
表示光场sm(x,y)沿Y轴方向的偏振分量，以及
Figure BDA0003546253480000157
空间光调制器调制的相位，分别取0、0.5π、π和1.5π。
另外，在第m个发光二极管的倾斜照明下，样品的复振幅沿X轴方向和沿Y轴方向的偏振分量在光瞳面处的频谱分布分别为：
Figure BDA0003546253480000158
和
Figure BDA0003546253480000159
进一步地，该显微成像装置系统对沿X轴方向和Y轴方向偏振的物光场的相干传递函数分别表示为：
Figure BDA0003546253480000161
和
Figure BDA0003546253480000162
其中，NA表示显微物镜3的数值孔径，(x0',y0')表示在图像采集模块10处沿Y轴方向偏振的物光波相对于沿X轴方向偏振的物光波所产生的剪切位移向量。
值得注意的是，由于相位型空间光调制器7仅对沿Y轴方向偏振的光波起作用，因此对于沿X轴方向偏振的物光波来说，其相干传递函数
Figure BDA0003546253480000163
仅与系统的光瞳函数有关，而对于沿Y轴方向偏振的物光波而言，其相干传递函数
Figure BDA0003546253480000164
还与预加载在空间光调制器7上的线性相位分布有关。另外，从公式(7)和(8)可以很明显地得到，
Figure BDA0003546253480000165
进一步地，公式(3)可表示为：
Figure BDA0003546253480000166
其中，
Figure BDA0003546253480000167
表示空间域的卷积操作，
Figure BDA0003546253480000168
表示成像装置不存在衍射受限的约束时(即系统的光瞳口径无限大)，沿X轴方向的偏振分量
Figure BDA0003546253480000169
在图像采集模块10处的理想放大像；而
Figure BDA00035462534800001610
表示针对沿X轴方向偏振的物光波的复振幅点扩散函数。
另一方面，公式(4)可表示为：
Figure BDA0003546253480000171
其中，
Figure BDA0003546253480000172
表示成像装置不存在衍射受限的约束(即系统的光瞳口径无限大)时，沿Y轴方向的偏振分量
Figure BDA0003546253480000173
在图像采集模块10处产生的带有剪切偏移的理想放大像。值得注意的是，
Figure BDA0003546253480000174
与
Figure BDA0003546253480000175
在幅值上是处处相等的。另外，在实际成像中，为了使公式(10)和(11)所示的两偏振物光场之间产生相干叠加，在第二透镜8与图像采集模块10之间设置了与Y轴呈45度的第二线偏振片9，如图1所示。因此，在第m个发光二极管的倾斜照明下，图像采集模块10处的总物光场表示为：
Figure BDA0003546253480000176
此时，图像采集模块10采集到的总强度分布为：
Figure BDA0003546253480000177
其中，
Figure BDA0003546253480000178
Figure BDA0003546253480000179
Figure BDA00035462534800001710
表示在环形光源照明下经过实际成像系统后在图像采集模块10处待测样品的平均相位分布，其沿X轴方向和Y轴方向的梯度分布可分别计算为：
Figure BDA00035462534800001711
和
Figure BDA0003546253480000181
其中，atan表示反正切函数。
如上所述，根据实施例一所述的定量微分干涉相衬显微成像装置所获得的反映目标样品X方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像代入公式(16)，即可获得待测样品沿X轴方向的梯度分布，将反映目标样品Y方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像代入公式(17)，即可获得待测样品沿Y轴方向的梯度分布。
对公式(16)和(17)的两边同时做空间傅里叶变换就可以进一步得到：
Figure BDA0003546253480000189
和
Figure BDA0003546253480000182
其中，
Figure BDA0003546253480000183
表示空间傅里叶变换运算，
Figure BDA0003546253480000184
表示
Figure BDA0003546253480000185
的空间傅里叶变换，(ρ,γ)表示与(x',y')对应的频域坐标。
最终，利用Frankot-Chellappa相位积分算法，可定量获得待测样品的相位分布：
Figure BDA0003546253480000186
其中，
Figure BDA0003546253480000187
表示逆空间傅里叶变换运算。
需要说明的是，为实现准确的相位恢复，在图像采集模块10处，x0'和y0'的幅值优先设定为成像系统横向空间分辨率的一半。
进一步地，所述S22还包括：
利用公式
Figure BDA0003546253480000188
获得待测样品的平均折射率分布
Figure BDA0003546253480000191
和三维形貌h(x,y)，其中，n0表示样品周围介质的折射率，λ0表示环形光源上发光二极管的中心波长。
具体地，在获得样品的相位分布以后，依据公式
Figure BDA0003546253480000192
可进一步获得待测样品的平均折射率分布
Figure BDA0003546253480000193
或三维形貌h(x,y)。结合公式(3)至(8)可以看出，在环形光源的倾斜照明下，所测样品通过系统的频谱范围得到了有效地增加，再结合微分干涉相衬显微成像的高轴向分辨特性，所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置具有显著增强的三维空间分辨能力。另外，组成环形光源的每一个发光二极管都具有一定的光谱带宽，有效避免了高相干光源引起的散斑噪声；同时，环形光源的各个发光二极管之间是非相干的，通过平均效应进一步地提高了图像质量。由于沿X轴偏振的物光场和沿Y轴偏振的物光场历经完全相同的光路元件，因此本发明装置对外界扰动具有非常强的免疫性。
另外，本发明实施例所提显微成像装置和方法的时间分辨率受图像采集模块的曝光时间和空间光调制器的切换时间的限制，其中，空间光调制器的切换时间固定为2毫秒，而图像采集模块的曝光时间可低至1毫秒。结合重复使用数据的交替重建算法，所提定量微分干涉相衬显微成像装置的时间分辨率可以达到1000/(4×(1+2))＝83帧每秒。总的来说，该成像装置可对各类散射样品进行实时、无标记、且高分辨率的原位定量检测，并且在结构和功能上拥有非常好的拓展性。
进一步地，为了反映本发明实施例所提定量微分干涉相衬显微成像装置的可行性，这里列举一套实施例一具体结构，所选器件型号及参数如下，需要说明的是，本实施例所提定量微分干涉相衬显微成像装置中的元件不限于下述参数或类型。
具体地，本实施例的环形光源1由38个直径为5毫米的发光二极管组成，所有发光二极管具有完全相同的型号参数，其光谱范围为473±20纳米。所有发光二极管均匀分布在环形骨架上，使用时所有发光二极管同时点亮。显微物镜3是浸油物镜，放大倍率为100X，数值孔径NA＝1.44；镜筒透镜4的焦距为200毫米。物光波经过第一线偏振片5和第二线偏振片9以后波前变形均小于1/4波长；第一透镜6是焦距为250毫米的双胶合消色差透镜；第二透镜8是焦距为300毫米的双胶合消色差透镜；所选第一透镜6和第二透镜8的直径均为2英寸。空间光调制器7的液晶切换时间为2毫秒，其相位调制分辨率为8比特。图像采集模块10优选地为sCOMS相机，单个像素的尺寸为6.5微米×6.5微米。
利用上述配置下的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，本发明实施例对直径为5微米的透明聚苯乙烯小球进行了定量微分干涉相衬显微成像，结果如图3所示，其中，图3(A)和3(B)分别为沿X轴和Y轴方向的相位梯度分布图像；3(C)是利用公式(20)恢复得到的定量相位分布图；3(D)是3(C)中某一个聚苯乙烯小球的相位轮廓线。实验中所用聚苯乙烯小球的平均折射率为1.47，全都浸没在折射率为1.33的水中。利用公式(16)和(17)，得到如图3(A)和图3(B)所示的聚苯乙烯小球沿X轴和Y轴方向的相位梯度分布图，从中可以明显看到，沿剪切方向存在明显的正负梯度变化，即明暗变化。进一步地，利用公式(20)对图3(A)和图3(B)所示的相位梯度图进行了恢复运算，得到如图3(C)所示的相位分布图。
值得注意的是，由于显微成像装置本身是低通滤波的，因此样品周围存在振铃效应。图3(D)是图3(C)中经过某一个聚苯乙烯小球中心的相位轮廓线，从中可以得到，5微米聚苯乙烯小球中心处引起的相位值是9.3弧度。该测量值与理论的相位值2π×(1.47-1.33)×5/0.473＝9.36弧度保持一致，说明所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置可以对透明样品进行准确的定量相位成像。
如前所述，共路径干涉的光学结构使本发明实施例的显微成像装置对外界扰动具有非常强的免疫性，因此本发明实施例的装置拥有非常好的时间相位灵敏度；其次，由多个发光二极管产生的环形部分相干光源使本发明装置拥有非常好的空间相位灵敏度。
为了定量表征本发明显微成像装置的时间和空间相位灵敏度，在没有任何样品的情况下，以1分钟为间隔，连续拍摄了200组数据。请参见图4，图4是本发明实施例的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微系统的空间和时间相位灵敏度的定量检测结果，其中，图4(A)表示某一时刻没有任何样品时的定量相位图像，而图4(B)所示的结果是某一像素处相位随时间的变化图。进一步地，对图4(A)中的所有像素计算均方根误差，得到该定量微分干涉相衬显微成像装置的空间相位灵敏度为0.003弧度；然后，计算图4(B)中数据的均方根误差，可以得到该定量微分干涉相衬显微成像装置的时间相位灵敏度为0.002弧度。也就是说，在空间和时间尺度上，本发明实施例所提显微成像装置可以分辨的最小相位变化分别为0.003弧度和0.002弧度。因此，所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置具有很好的空间和时间相位灵敏度。
另一方面，通过旋转本发明装置中的两个线偏振片就可实现定量微分干涉相衬显微成像与定量则涅克相衬显微成像之间的轻松切换，如图1和2所示。因此，利用实施例一所示的定量微分干涉相衬显微系统和实施例二所示的定量则涅克相衬显微系统，本实施例对同一份红细胞样品进行了数据采集并分别恢复得到了它们的相位分布图像。
请参见图5，图5是利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对红细胞进行的定量微分干涉相衬显微成像。具体地，利用实施例一所示的定量微分干涉相衬显微成像装置采集得到沿X轴方向偏移和沿Y轴方向偏移的各四张微分干涉相衬图像，然后分别利用公式(16)和(17)计算得到了红细胞样品在X轴方向和Y轴方向的相位梯度分布图，如图5(A)和5(B)所示。随后，利用公式(20)对图5(A)和5(B)所示的相位梯度图进行运算，得到图5(C)所示的红细胞相位分布图像。
进一步地，将实施例一中的显微成像装置中的两个线偏振片5和9旋转45°，使它们的偏振方向与空间光调制器起作用的偏振方向一致，此时，实施例一所示的定量微分干涉相衬显微成像装置转换为实施例二所示的定量则涅克相衬显微成像装置。随后，对上述实验过程中的同一份红细胞样品进行了定量则涅克相衬显微成像。请参见图6，图6是利用本发明实施例的定量则涅克相衬显微成像装置对红细胞进行的定量则涅克相衬显微成像结果。
当空间光调制器先后加载0、0.5π、π以及1.5π的环形相位掩膜来对非散射光进行相位调制时，图像采集模块先后捕捉到图6(A)至图6(D)所示的四张相移强度图像。然后利用四步相移算法即可获得图6(E)所示的红细胞定量相位图像。进一步地，计算了图5(C)和图6(E)之间的误差图像，如图7所示，结果表明，利用两种装置恢复得到的相位图像之间存在很小的误差，该误差主要是由于成像机制不同所造成的。因此，图5至图7说明利用本发明装置可对同一样品实现定量微分干涉相衬显微成像和定量则涅克相衬显微成像。
进一步地，利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对贴附在玻片上的油滴进行了定量微分干涉相衬显微成像。请参见图8，其中，图8(A)和图8(B)分别是油滴样品在X轴方向和Y轴方向上的相位梯度分布图像，图8(C)是利用公式(20)恢复得到的油滴的定量相位分布图像。从图8可以看到，本实施例的定量微分干涉相衬显微成像装置可以对透明的薄油滴进行高对比度的定量相位成像。
另一方面，请参见图9，图9是利用本发明实施例基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置对10微米厚的小鼠颌下腺组织切片进行的定量微分干涉相衬显微成像，其中，图9(A)和图9(B)分别是组织切片在X轴方向和Y轴方向上的相位梯度分布图像，图9(C)是利用公式(20)恢复得到的组织切片的定量相位分布图像。图9(D)是图9(C)中穿过蛋白微丝的白线上的相位分布曲线，从中可以看到，直径400纳米左右的两根蛋白微丝所引起的相位分布被本发明实施例的显微成像装置准确恢复得到。从图9可以看到，本发明实施例的定量微分干涉相衬显微成像装置可以对比较厚的组织样品进行高对比度的定量相位成像。
总的来说，本发明基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置的光学结构与基于则涅克相衬的定量相位显微镜完全相同，仅通过对该显微成像装置中的线偏振片进行旋转就可实现二者之间的轻松切换，因此，所提基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置可对各类散射样品进行实时、无标记、且高分辨率的原位定量检测，并且在结构和功能上拥有非常好的拓展性，在生物医学及工业检测等领域具有很大的应用价值。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，包括沿光束传播方向依次设置的环形光源(1)、显微物镜(3)、镜筒透镜(4)、第一线偏振片(5)、第一透镜(6)、空间光调制器(7)、第二透镜(8)、第二线偏振片(9)和图像采集模块(10)，其中，
所述环形光源(1)用于发射环形光束，且所述环形光束均指向所述显微物镜(3)的物方焦点处，待测样品(2)位于所述显微物镜(3)前焦面处；所述显微物镜(3)与所述镜筒透镜(4)的共焦面形成所述显微成像装置的光瞳面；
所述第一线偏振片(5)用于将来自所述镜筒透镜(4)的物光波分为沿第一方向的偏振物光波和沿第二方向的偏振物光波，所述第一方向与所述第二方向均位于垂直于光束传播方向的平面上且相互垂直；
所述空间光调制器(7)用于加载相位调制图案且仅对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜(8)的后焦面处产生剪切偏移；
所述第二线偏振片(9)仅允许来自所述第二透镜(8)的第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波沿第二线偏振片(9)起偏方向的偏振分量通过，使第一方向偏振物光波和第二方向偏振物光波在第二透镜(8)的后焦面产生相干叠加；
所述图像采集模块(10)用于采集第一方向偏振物光波与经过所述空间光调制器(7)相位调制后的第二方向调制偏振物光波在所述第二透镜(8)的后焦面处进行相干叠加产生的多张微分干涉相衬图。
2.根据权利要求1所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，所述环形光源(1)包括多个部分相干的发光二极管，所述发光二极管均匀分布在环形骨架上，且每个发光二极管的轴线均指向所述显微物镜(3)的物方焦点处。
3.根据权利要求1所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，所述第一线偏振片(5)与所述第二线偏振片(9)的起偏方向相同，均与所述第二方向呈45°。
4.根据权利要求1所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，所述空间光调制器(7)上分别加载有第一相位调制图案和第二相位调制图案，并且对所述第一相位调制图案和所述第二相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，以对沿所述第二方向的偏振物光波进行调制，其中，经所述第一相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜(8)的后焦面处产生沿第一方向的剪切偏移，经所述第二相位调制图案调制后的第二方向偏振物光波在所述第二透镜(8)的后焦面处产生沿第二方向的剪切偏移。
5.根据权利要求1所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，所述第一透镜(6)和所述第二透镜(8)均为双胶合消色差透镜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置，其特征在于，通过将所述第一线偏振片(5)和所述第二线偏振片(9)的起偏方向调节成与所述第二方向平行，同时在所述空间光调制器(7)上加载不同相位的环形相位掩膜，能够将所述定量微分干涉相衬显微成像装置调节为透射式定量则涅克相衬显微模式。
7.一种基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像方法，其特征在于，包括：
S1：利用权利要求1至5中任一项所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像装置获得样品的多张微分干涉相衬图；
S2：利用所述多张微分干涉相衬图获得所述样品的相位信息。
8.根据权利要求7所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像方法，其特征在于，所述S1包括：
打开照明光源；
在所述空间光调制器上加载第一相位调制图案，并对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第一方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像；
在所述空间光调制器上加载第二相位调制图案，并对所述第一相位调制图案中所有像素分别加载0、0.5π、π以及1.5π的相位值，随后利用图像采集模块获取能够反映目标样品第二方向梯度分布的四张微分干涉相衬图像。
9.根据权利要求8所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像方法，其特征在于，所述S2包括：
S21：利用所述微分干涉相衬图像计算获得所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布；
S22：利用所述待测样品沿第一方向的梯度分布和第二方向的梯度分布计算获得样品的相位分布。
10.根据权利要求9所述的基于光瞳面调制的定量微分干涉相衬显微成像方法，其特征在于，所述S22还包括：
利用公式
Figure FDA0003546253470000031
获得待测样品的平均折射率分布
Figure FDA0003546253470000032
和三维形貌h(x,y)，其中，n0表示样品周围介质的折射率，λ0表示环形光源上发光二极管的中心波长。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115711866A (zh) * 2022-10-31 2023-02-24 西安电子科技大学 基于环形扫描照明的定量相衬层析显微装置和方法
CN115718068A (zh) * 2022-10-21 2023-02-28 华南师范大学 一种动态定量微分干涉相衬显微成像系统及方法

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