JP2016029388A - Ｈｉｌｂｅｒｔ位相画像処理のためのシステムと方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｈｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡（ＨＰＭ）を参照した定量的位相画像処理のためのシステムと方法に関し、一回の撮影による立体干渉撮影からフル・フィールドの位相画像を収集できる方法を提供する。【解決手段】Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計２０の基準ビーム１４とサンプル・ビーム１６がオブジェクト２２、２４及びレンズ２６、２８を通過し、ミラー３０の回転により、基準フィールド４０を傾斜させ、レンズ２６、２８の共通フーリエ面内に配置の画像センサー４２にサンプル・フィールド４４の正確な複製が形成される。画像データは、解析及び表示のために、センサー４２からプロセッサー又はコンピューター１２０に送られ、フーリエ高域フィルターリングされ、干渉縞の正弦項のＨｉｌｂｅｒｔ変換として識別される。【選択図】図１

Description

本発明はＨｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡（ＨＰＭ）を参照した定量的位相画像処理のためのシステムと方法に関する。

光学顕微鏡は医学及び生物学で普通に用いられる調査方法であった。生きた細胞を含めて、多くの生物学的サンプル（ｓａｍｐｌｅ）は可視光の照明下で非常に透光性であり、実質的に位相オブジェクトとしての挙動を行う。位相のコントラスト（ｃｏｎｔｒａｓｔ）及びＮｏｍａｒｓｋｉ顕微鏡のような技術が、位相情報を光度分布に変換することにより、ほぼ見えないサンプル（ｓａｍｐｌｅ）にコントラストを与える。それゆえ、生物系の構造的詳細を明らかにする。しかしながら、照明フィールドと関連する位相の移動についてのこれらの技術と共に得られた情報は定性的に過ぎない。高い精度と低いノイズ（ｎｏｉｓｅ）の透光性オブジェクトから定量的位相情報を収集することで、構造及び動力学の生物学的調査内で測定を行なえる。干渉測定と非干渉測定の両方の技術が、生物学的サンプルの定量的位相画像処理のために提案されている。さらに、フーリエ（Ｆｏｕｌｉｅｒ）位相差顕微鏡（ＦＰＭ）が極端に低ノイズの位相画像処理の方法として開発されている。長期間に亘るサブ・ナノメートル（ｓｕｂ−ｎａｎｏｍｅｔｅｒ）の位相の安定性により、ＦＰＭは数秒から細胞の寿命までの時間の規模までの生物系の動力学を調査するのに適している。

細胞骨格の動力学、細胞膜の変動及び神経活動を含む細胞レベルで生じる多くのプロセスがミリ秒の範囲までの短い期間に生じる。それゆえ、ｋＨｚのフレーム・レート（ｆｒａｍｅ ｒａｔｅｓ）でフルフィールド（ｆｕｌｌ−ｆｉｅｌｄ）の定量的位相画像を取得できる顕微鏡が生物系の定量化を行なえる。

時間の異なるフィールドの複素解析信号の形成が光学系の広い用途を見いだしている。特に、複素解析信号の実数部と虚数部の間のＨｉｌｂｅｒｔ変換の関係が、一回の撮影による一時的な干渉撮影の位相の移動を収集するのに用いられる。本発明はＨｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡（ＨＰＭ）を参照した定量的位相画像処理のためのシステムと方法に関する。これにより、一回の撮影による立体干渉撮影からフル・フィールドの位相画像を収集できる。

ＨＰＭでは、一回の撮影による位相画像処理は、画像処理センサーのような記録装置によってのみフレーム取得レートを制限される。画像処理センサーは、電荷結合素子（ＣＣＤ）、又は、ＣＭＯＳ画像処理アレー（ａｒｒａｙ）のようなデジタル画像処理検出器を含む。これは位相移動技術とコントラストになっていて、その中で、単一の位相画像を収集するために、多数の記録を必要とする。さらに、ＨＰＭは非ラップド（ｕｎｗｒａｐｐｅｄ）位相を提供する。これが光の波長より非常に大きな位相対象の研究を可能にする。画像処理装置は好ましくは少なくとも２０万画素を有し、少なくとも、１０フレーム／秒、好ましくは１００フレーム／秒以上を集めることができる。

好ましい実施例は、単一光源からの光を基準経路とサンプル経路に沿って、分割する。サンプル経路に沿った光がサンプル又は測定オブジェクトを通過する方向にして、基準経路に沿った光は変調要素により変調されるので、サンプルからの光が変調された基準光と結合したとき、干渉パターン（ｐａｔｔｅｒｎ）が生じ、画像処理センサーにより検出される。例えば、変調要素は回転ミラー（ｍｉｒｒｏｒ）又は可動レンズとしうる。本発明
の好ましい実施例には、光ファイバーを含めて、光を画像処理される組織のようなオブジェクト上に光を結合しうる。レーザー（ｌａｓｅｒｓ）又は種々の波長の非常にコーヒーレント（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）の光源を使用できる。コンピューター又は他のデータ処理装置又は画像処理装置を、画像データの処理のために、画像処理装置の出力に接続できる。好ましい実施例では、データ処理装置は最初に画像を処理するために、ソフトウエア・プログラムを用いてプログラムされて、基準として、視野内で選ばれたポイント（ｐｏｉｎｔ）を用いて、ノイズ（ｎｏｉｚｅ）を除去する。そして、画像にＨｉｌｂｅｒｔ変換を行って画像の処理を行う。干渉撮影にフーリエ変換を行ってその後フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）をかけて、フィルター処理済み画像データを得る。この後で、逆フーリエ変換を行ってラップド（ｗｒａｐｐｅｄ）及び非ラップド（ｕｎｗｒａｐｐｅｄ）位相画像を得る。これが関心を持っているオブジェクトの定量的位相画像になる。

本発明の好ましい実施例には本発明に基づくＨｉｌｂｅｒｔ位相画像処理の構造を含めることができ、その中で、光学的幾何学が透過又は反射の画像処理のために設定される。好ましい実施例では、倒立顕微鏡の形態をビームスプリッタと共に使用して、基準及びサンプルの画像を結合できる。

細胞膜に対するポリスチレン・ビーズ（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｂｅａｄｓ）のような反射性材料を取付けることにより、反射測定を実施できる。それで、コーヒーレント（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）光をこの材料から反射でき、干渉写真を得る。これにより、剪断率又は曲げ率のように、膜の機械的特性を測定するのに使用できる。ここに示した手順はヒト又は哺乳動物の組織又は液にインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）で、又は、例えば、他の組織であるヒトの目にインビーボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）で使用できる。

本発明は生物学的応用だけでなく、非生物学的応用も行なえる。例えば、本発明は光ファイバー、及び（又は）、他の透光性又は半透光性のオブジェクト又は結晶構造を含む材料の位相プロフィール（ｐｒｏｆｉｌｅ）を研究するために提供できる。

発明の詳細な記述

本発明の好ましい実施例を図１に示す。この実施例で、ＨｅＮｅレーザーがＭａｃｈ−Ｚｅｎｄｅｒ干渉計２０の画像処理をするための光源１０として用いられる。第一のビームスプリッタ１２が光源１０からのビームを分割して、干渉計の２本のアーム（ａｒｍ）を形成する。そのアームはそれぞれ基準ビーム１４とサンプル・ビーム１６から成っている。ミラー１８がサンプル・ビーム１６をサンプル又はオブジェクト２５上に向ける。干渉計２０の各アームで２系統の伸縮システムがあり、例えば、倍率Ｍ＝２０で、各伸縮システムがオブジェクト２２、２４及びレンズ２６、２８から成っている。第二のミラー３０が基準フィールドを第二のビームスプリッタ３２上に送る。基準フィールド４０の向きを調節できる。例えば、その調節はミラー３０の回転可能な動きにより、基準フィールド４０を傾斜させるために行われる。ＣＣＤのような画像センサー４２をレンズ２６、２８の共通フーリエ面内に配置でき、サンプル・フィールド４４の正確な（拡大された）複製が形成される。基準フィールド４０は、ビームスプリッタ３２によりＣＣＤ画像センサー４２の上に向けられ、ＣＣＤ画像センサー４２のＸ及びＹの軸に対して４５°を向くように均一な干渉縞構造を作るために、サンプル・ビーム４４に対して僅かに傾斜させる。この実施例で用いられたＣＣＤ（Ｃ７７０ 浜松フォトニクス（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）は、４８０ｘ６４０画素のフル解像度で、２９１フレーム／秒の画像取得速度を有している。より高い解像度と取得速度も使用できる。画像データは、解析及び表示のために、センサー４２からプロセッサー（ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）又はコンピューター１２０に送られる。

与えられたサンプル２５の場合、ｘ軸とｙ軸に亘る画像面で空間的に変化する放射照度
が以下の形をとる。

ここで、ＩＲとＩＳは、それぞれ、基準及びサンプルの放射照度の分布である。ｑは干渉縞の空間周波数である。φは量が問題になっているオブジェクト２５と関連し、空間的に変化する位相である。式１はＭｉｃｈｅｌｓｏｎ及び他の干渉計での一時的干渉の説明に類似している。その中で、ｑは音響・光変調器又は可動ミラーにより導入された周波数移動に対応する。ここで関心のある透光性オブジェクトの場合、Ｉｓ（ｘ）はｘへの弱い依存性を有すると期待されている。システムの倍率を調節することにより、空間周波数ｑは、計器の開口数により可能になる最大周波数と合致するか、超えるように選ぶことができ、回折を制限した解像度を維持される。正弦項

をフーリエ高域フィルターリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）により分離できる。その後、実数関数ｕ（ｘ）と関連する複素解析信号ｚ（ｘ）が以下として得られる。

式２で、右側の虚数部分が主値（Ｐ）の積分を意味していて、ｕ（ｘ）のＨｉｌｂｅｒｔ変換として識別できる。それゆえ、位相スペクトルφ（ｘ）は複素解析信号ｚ（ｘ）と関連していて、以下のように計算される。

ｚ（ｘ）は周波数ｑによる高速位相変調を示し、それゆえ、φが強くラップドされている。しかしながら、オブジェクトの空間周波数成分よりｑが高いので、非ラッピング（ｗｒａｐｐｉｎｇ）手順が有効に機能する。最後になるが、オブジェクトφ（ｘ）と関連した位相が以下のように単純に抽出される。

この手順が、例えば、光ファイバーの位相プロフィールを収集するために、使用できる。好ましい実施例で、本発明は、以下の数値を有する光ファイバーの位相プロフィールを収集するための装置と方法を提供している。その光ファイバーはコア（ｃｏｒｅ）の直径１００ミクロン、反射係数が１．４５７で、その一方で、クラディング（ｃｌａｄｄｉｎｇ）の場合、直径１１０ミクロンを有し、反射係数１．４５２である。この例では、光ファイバーはグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に浸漬され、位相オブジェクトを模倣しやすくしている。このサンプルの透過度の画像（図２ａ）が低コントラスト（ｃｏｎｔｒａｓ
ｔ）を示し、それがサンプルの透過度の表示になっている。図２ｂ−ｄが位相再構築の手順内の中間ステップを示し、かつ、図２ａに示されている長方形領域に対応している。この領域がグリセロール／クラディングとクラディング／コアの境界を包んでいる。ＣＣＤ（図２ｂ）により記録された干渉撮影は、フーリエの変換と高域フィルターリングであり、正弦波信号が得られる（図２ｃ）。この実数の信号と関連して、複素解析信号を得るために、２次元フーリエ変換を計算し、負の空間周波数を抑制する。逆フーリエ変換の操作で、複素２次元信号が得られ、図２に示すようにオブジェクトの位相についての情報を独自に提供する。強いラップド及び非ラップドの位相画像がそれぞれ図２ｄ及び図２ｅに示されている。光ファイバーの定量的位相画像が、直線的位相を減算することにより得られ、図２ｆに示されている。その一方で、図２ｇには断面が示されている。連続線がモデルとされたフィット（ｆｉｔ）を示し、変動パラメーターとして、グリセロールの反射指数を用いている。最良のフィットのためのグリセロールの反射指数はｎ＝１．４６７の値を有し、ほぼ既知の値である。

本発明の好ましい実施例では、例えば、全血の塗布部からの赤血球のような組織又は体液の位相画像のための定量化パラメーターのような生物学的測定のためにＨＰＭを用いる。図２ｈはそのような画像の一例を示す。その中で、個々の細胞及び細胞集団を容易に識別できる。核が無い赤血球及び主要な細胞小器官を光学的に均質なオブジェクトとしてモデル化できる。それゆえ、ＨＰＭ画像からの位相情報を厚み情報に変換でき、細胞の形状と体積のようなパラメーターを直接提供する。この例で、データが１０．３ミリ秒で記録され、サンプルは全血の液滴を２枚のカバー・スリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐｓ）の間に挟むことにより調製された。

それで、本発明の好ましい実施例に基づいて、ＨＰＭは透光性のサンプル内の定量的な位相画像を提供できる。さらにこの方法は、照明光の波長よりずっと高い位相プロフィールを用いて位相のオブジェクトを測定できる。この重要な特徴は画像に課せられる高い空間変調による。位相画像上で良く定義されたラッピング（ｗｒａｐｐｉｎｇ）ポイントを生じ、それゆえ、非ラッピング手順を容易にしている。それゆえ、１回限りの撮影による測定から定量的位相画像を得るためのＨＰＭの能力が透明又は透過性のシステム内の高速動的なプロセスを監視できる。

本発明の別の実施例では、例えば、ミクロン・サイズの液滴の蒸発を分析するような透光性媒体の高速プロセスを研究するために用いられる。図３ａは顕微鏡スライド上に散布された水滴のＦＰＭ画像を示している。ｚ軸の情報は、これらの液滴の厚みがその横断方向の寸法よりも有意に小さいことを示している。この蒸発現象を監視するために、一連の３３３枚の位相画像が１０．３ミリ秒の間隔で記録された。各位相画像が１件のＣＣＤ記録から得られているので、２本の干渉計のアーム（ａｒｍｓ）の間のノイズを除去する必要が無く、位相移動技術で有意な利点を与える。連続的フレーム間のノイズは位相画像を不明瞭にせず、視野内の固定点を各画像の基準とすることにより便利に表示できる。この基準点を“Ｒ”により図２ａに記す。位相画像シリーズ内に存在する横断方向の残留ノイズを定量化するために、図３ａに示されているポイントＯと関連した一時的経路の長さの変動が記録された。画像処理オプティックス（ｏｐｔｉｃｓ）の回折制限スポット（ｓｐｏｔ）に対応した領域に亘ってこれらの変動を平均化した（０．４５ ｘ ０．４５μｍ²）。これらの変動の標準偏差は１．３２ｎｍの値を有し、示されているように、ミリ秒の時間目盛上でナノメートルの経路の長さの感度を得られることを示している。図３ｃは、ＨＰＭ画像から計算されたように、この記録の間に水滴の質量の変化を示す。回折を制限した横断方向の解像力及び現在の位相感度にとって、ＨＰＭは１０^-18リットルのオーダーで驚くほど小さな水の蒸発体積に鋭敏である。さらに、定量的位相画像がこれらの均質な構造についての詳細な三次元情報を提供する。そして、水滴の蒸発と関連する最大厚みの一時的依存性を容易に算定できる（図３ｄ）。これらの曲線は質量の時間的変化より
も有意に不規則である（あるときに非単調性）。質量の時間的変化は、蒸発中の形状変化の不連続性を示す。

本発明の好ましい実施例は利点を与える。例えば、本発明に基づくＨｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡はナノメートル・レベルの感度を用いて、１回だけの測定から高い横断的解像度による定量的位相画像を収集できる。空間領域に複素解析信号を適用することは電磁場の一時的・空間的変動を示す方程式の間に存在する類似性に基づいている。ＨＰＭは生物系及び生きた細胞のダイナミックス（ｄｙｎａｍｉｃｓ）を含めて、透光性媒体内の高速現象を測定する方法を提供している。

ここで図４を見て、本発明の別の好ましい実施例はＨｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡の原理を倒立形状で、高速・高感度の定量的位相差顕微鏡６０に提供している。倒立形状は特に生きた細胞の調査に適している。定量的生物顕微鏡の方法が、赤血球の形状及び変動をミリ秒の時間的スケールでナノメートルの経路の長さの感度で定量化することにより実証されている。

図４を参照すると、好ましい実施例が倒立顕微鏡６０を組込むことによりＨＰＭを拡張している。光源５０は、例えば、ＨｅＮｅレーザー（λ＝６３２ｎｍ）のようなもので、第一ミラー５２と第二ミラー５４を結合して、１×２のシングルモード（ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｄｅ）の光ファイバーのカプラー５６とし、ファイバースプリッタ５８により分割して基準アーム６４に送る。それは第一の光ファイバーのカプラー出力６６とコリメータ７４から成っている。第一出力フィールドはサンプル・アームを通して提供され、１００ｘの対物レンズ８８を装備した倒立顕微鏡８０用照明フィールドとして機能する。チューブ・レンズ（ｔｕｂｅ ｌｅｎｓ）９０はサンプル８５の画像がビームスプリッタ・キューブ（ｂｅａｍ ｓｐｌｉｔｔｅｒ ｃｕｂｅ）９２を経由して画像センサーＣＣＤの面１００に形成される。第二のファイバー・カプラーの出力６６が、コリメーター６８により平行光にされ、第二の顕微鏡用対物レンズ７０とチューブ・レンズ（ｔｕｂｅ ｌｅｎｓ）９０から成っている伸縮システムにより拡張されている。この基準フィールドのビームは平面波により近似しうる。平面波はサンプル画像フィールド９６により干渉される。基準フィールド９４はサンプルフィールド９４に対して傾斜している（例えば、コリメーター６８を調節することにより）。それで、ＣＣＤ１００のｘ軸及びｙ軸に対して４５度の角度で均一な干渉縞が生じる。ＣＣＤは（Ｃ７７７０ 浜松フォトニクス）を用いていて、６４０ｘ４８０画素のフル解像度で２９１フレーム／秒の取得速度を有している。ＣＣＤ１００はコンピューター１２０に接続され、かつ、制御される。この例では基準アームの対物レンズ７０とズームレンズ９０の焦点間の焦点距離ｆは２５０ｍである。

１方向を横断した干渉撮影と関連する空間的放射照度が上記図１に示されている。ここでＩ_RとＩ_S（ｘ）はそれぞれ基準及びサンプルの照度分布である。ｇは干渉縞の空間周波数であり、φ（ｘ）はオブジェクト８５と関連した空間的に種々の位相であり、φ（ｘ）は解析で重要な又関心のある量である。上記のように正弦波の項

を分離するために、空間的高域フィルタリングを用いて、又、複素解析信号ｚ（ｘ）を得るために、上記の式２のように、Ｈｉｌｂｅｒｔ変換を用いると、（及び、それによる式３による位相スペクトラムφ（ｘ））、さらに式４により、値φ（ｘ）を１回だけの撮影画像の各ポイントについて収集できる。

倒立形状により新しいＨＰＭ顕微鏡が生きた細胞の定量的調査には特に適している。ミリ秒とナノメートルの目盛での細胞構造を定量化する新しい計器の能力を実証するために、赤血球（ＨＢＣｓ）の時間で分解するＨＰＭ画像を得た。追加の調製無しの全血の液滴をカバー・スライド（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｄｅ）の間に挟んだ。図５は生きた血液細胞の定量的位相画像を示している。分離された又凝集状態の両方の赤血球の両方が容易に識別される。白血球（ＷＢＣ）も視野に存在する。細胞と周辺の血漿の屈折率に１．４０と１．３４をそれぞれ用いることにより、ＲＢＣｓと関連した位相情報を細胞トポグラフィ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）のナノメートル目盛の画像に容易に変換できる。さらに、個々の細胞の体積を評価でき、図５で（フェムトリットルの単位で）測定した体積を個々の赤血球の下に表示している。

逐次のフレーム間の長手のノイズを無くすために、各位相画像について、Ｒで示した細胞を含まない視野内の領域に亘って平均値を参照した。細胞トポグラフィの動的変化に対する計器の安定性及びそれゆえ感度を定量化するために、１００枚の画像セットが記録された。それぞれが１０．３ｍｓかかり、ノイズ分析が視野内の第二の空白領域で行われた。この領域（図５ａで０と表示）に亘って経路の長さの変動を空間的標準偏差σｓには一定の時間内変動があり、それで、一時的平均＜σｓ＞を特徴とする。σｓの時間依存性が図５ｂにプロットされた。一方、平均値＜σｓ＞対平均フレーム数が図５ｃに示されている。特に、＜σｓ＞は、２件の逐次フレームのみを平均した１ｎｍの値未満に低くなっている。このノイズ評価は、本発明の好ましい実施例に基づく倒立ＨＰＭ測定がサブ・ナノメートルの目盛で、ＲＢＣｓのような生物系の構造と動力学についての定量的情報を提供できると言うことを実証している。

生きた赤血球の有意な動的変化の例が、図６ａ及び図６ｃに示す。その位相画像は図５ａに示された赤血球に対応し、１０．３ミリ秒離れて取得していて、１，０００フレームのデータ・セット内の最初と最後のフレームを代表している。図６ｂと６ｄは、ナノメートルの精度で２ステージ（ｓｔａｇｅｓ）での水平と垂直の細胞プロフィールを示している。面白いこととして、細胞形態の有意な変化は、画像の左下のコーナー（ｃｏｒｎｅｒ）での隣接する白血球との高速の相互作用による（さらに図５ａにＷＢＣと表示）。これにより、ＨＰＭにより容易に定量化しうる高速の非対称の形状変化となる。この顕著な結果を原子の力のような技術又は電子顕微鏡により定量化できる。

ヘモリシス（赤血球の溶解）は、赤血球の膜が破壊して、細胞がヘモグロビン成分を失う現象である。このプロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）は最近光学的浄化の分野で最近研究されている。ＨＰＭ技術を用いて、自然分解の結果として、細胞の変化を動的に定量化するために、１０．３ミリ秒の取得時間で、一連の１，０００枚の位相画像を用いた。図７ａ−７ｅはヘモリシスの種々の段階の間に細胞の体積が減少することを示している。細胞の異常に平坦な形に注目されたい。排出されたヘモグロビンによる位相の移動を図７ｆ−７ｈで観察できる。グレー・スケール（ｇｒａｙ−ｓｃａｌｅ）の飽和を避けるために、細胞を囲む領域のみが示されている。図７ｆ−７ｈの非対称性が示すように、膜の破壊が非常に局部的に生じている。そして、ヘモグロビンは細胞の点源から拡散しているように見える。ＲＢＣの体積がその処理中に評価され、その一時的依存性が図７ｉにプロットされている。この非常に動的なプロセスの間、細胞の体積が４秒以内に５０％低下する。（信号は２フレームに亘って平均化された。他方、細胞付近のポイントと関連する位相の移動が約１秒以内に、定常状態の最大値が約９ｎｍに達する。この超高感度測定の信号対ノイズを改善するために、１１×１１画素を超えるスペース及び１０フレームを超える時間内で信号の平均を求めた。これらのデータから得られた標準偏差は０．０９ｎｍという著しく低い値に達した。測定された位相の移動はヘモグロビンの局部的濃度に直線的に比例している。それゆえ、約１５００ｍｓの後で、経路の長さの移動がほぼ一定に達したことは、細胞からの分子の発生とその拡散プロセスの間の平衡状態の結果として解釈できる。

Ｈｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡の好ましい実施法は図８の処理手順２００に示されている。この処理はコンピューター上のソフトウエア・プログラムを用いて実施できる。第一に、校正ステップ２０２がオプション（ｏｐｔｉｏｎ）として、既知のサンプルの画像を得ることにより実行できる。そして、そして、システム内のバックグラウンド・ノイズ（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ）の除去に使用できる。そして測定されるサンプルはホルダー（ｈｏｌｄｅｒ）内に取付けられる。サンプルの１以上の干渉撮影画像が集められる２０４。そして、フーリエ変換が各画像に適用される。その後、画像のフィルタリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）２０８が行われる。そして、逆フーリエ変換が適用され２１０，その後ノイズ除去２１２が行われる。位相非ラッピング・ステップ２１４とサンプルの他の定量的特性の決定が実現できる２１６。

本発明の好ましい実施例には、本発明に基づくＨｉｌｂｅｒｔ位相画像処理の構造を含めることができる。その中で、透過及び反射のモードのために光学的ジオメトリー（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）が設定される。

本発明は生物学的用途だけでなく、非生物学的用途にも対応している。例えば、本発明は、光ファイバー及び（又は）他の透光性又は半透光性のオブジェクト又は材料の位相プロフィールの研究に対応できる。本発明の好ましい実施例が、光源オプティックス（ｏｐｔｉｃｓ）の一部としてレーザー（ｌａｓｅｒ）又は他のコーヒーレント（ｃｏｈｅｒｅｎｔ）の光源を使用しうる。電磁スペクトラム（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）の紫外線、可視光線、赤外線の領域からの波長を使用できる。

本発明の利点には、定量的画像データを得ることの速度と簡便性が含まれる。倒立Ｈｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡はサブ・ナノメートル及びミリ秒の目盛で、細胞の定量的位相画像を測定できる。倒立形状が定量的細胞生物学、例えば、それに限定しないが、赤血球の膜構造の非接触特性のような非接触特性を探る新手段になる。

生きている細胞のような生物学的構造は特に明るいフィールド照明の下で透光性である。位相コントラスト（ＰＣ）及び微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡が外因性コントラスト因子を必要とせずに細胞の形態的特徴を詳細に推定するのに用いられる。これらの技術は、最終画像の強度分布に画像処理フィールドの位相内に符号化された情報を伝送する。それで、与えられたサンプルを通じた光学的位相移動を強力な内因性コントラスト因子と見なすことができる。それがサンプルの厚みと屈折率の両方についての情報を含んでいるからである。この観点から成熟した赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｏｒ
ＲＢＣｓ）は非常に特殊なタイプの構造で、細胞核と主要な細胞小器官が欠落している。それで、ＲＢＣｓは光学的に均質なオブジェクトとしてモデル化できる。即ち、それらは、局部的、光学的、厚みに比例した位相の移動を生じる。それゆえ、赤血球の定量的位相画像は、光学的波長の非常に小さな部分に対応した精度で細胞の厚みプロフィールを提供する。ナノスケール（ｎａｎｏｓｃａｌｅ）の形態学的情報が、細胞の生物物理的特性及び健康状態の洞察を提供する。核又は光学的不透明成分を有する細胞を前記の反射プロセスを用いて測定できる。

本発明の好ましい別の実施例は、フーリエ位相差顕微鏡（ＦＰＭ）の技術的補完として、Ｈｉｌｂｅｒｔ位相差顕微鏡を用いて、ミリ秒の目盛のＲＢＣ膜の変動のような高速の生物学的現象を定量化する方法を提供している。ＨＰＭは複素解析信号の概念を空間的領域に拡張し、１回のみの空間的干渉撮影記録から定量的位相画像を測定する。その一回だけ撮影の性質により、ＨＰＭの取得時間は記録装置によってのみ制限される。又、多くの関連する生物学的現象を生じているミリ秒の時間目盛で、ナノメートル・レベルの経路の長さの移動を正確に定量化するのに使用できる。画像は好ましくは１秒未満の間隔で、多
くの用途では１００ミリ秒未満の適用で得られる。結果として、動的事象のビデオ記録を分子レベルで記録できる。

本発明は特定の方法及び装置と関連させて示されているけれども、説明は同等の装置及び方法の例示によっているが、本発明の範囲を限定せず、それは請求項に示されていることを理解されたい。

本発明に基づく画像処理システムの好ましい実施例を示す。 以下を含む得られた画像を示す。ａ）伝送強度の画像；ｂ）干渉撮影；ｃ）正弦波の信号；ｄ）ａ）に示された長方形領域から測定されたラップド位相；ｅ）フル・フィールドの非ラップド位相；ｆ）フル・フィールドの定量化された位相画像；ｇ）模型化したフィットを示す連続線を付けたｆ内の位相画像を横断した輪郭；ｈ）全血塗布部のＨＰＭ画像（倍率４０）、５ミクロンの目盛線が示されていて、グレースケールの線でａ−ｃに対して強度を示し、ｄ−ｈに対してラジアン単位の位相を示す。 ａ）水滴のＨＰＭを、色付き線はミクロン単位の厚みを、目盛線は１０ミクロン単位で示している；ｂ）図３ａのポイントＯの経路の長さの変動を示す；ｃ）蒸発中の水滴質量の一時的変化（フェムト・グラム（ｆｅｍｔｏ−ｇｒａｍ）の単位、）；ｄ）蒸発中の水滴の最大厚み、３．４秒の間隔で集めたデータと継続的フレーム（ｆｒａｍｅｓ）の間の１０．３ｍｓを用いている。 本発明に基づく画像処理システムの好ましい実施例を示す。 以下を含めて得られた画像とデータを示す。ａ）全血塗布部の定量的位相画像、ＲＢＣｓ（赤血球）がフェムト・リットルで示されている、色付き線はラジアン単位である；ｂ）領域ｏに関連した立体標準偏差の一時的変動；ｃ）平均フレーム（ｆｒａｍｅ）の関数として一時的平均のシグマ・サブ・エス（ｓｉｇｍｅ．ｓｕｂ．ｓ）。 １０秒間の赤血球と関連した形状変化の定量的評価を示す。 以下を含めて得られた画像とデータを示す。ａ−ｅ）４秒間のヘモリシス（ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）の種々の段階；ｆ−ｈ）示されているように、ｔ＝０．５秒、１．０秒、１．５秒に対応した細胞から除去されたヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）の位相画像；ｉ）４秒の間、（図７ｆに矢印で示された）細胞の外側のポイントと関連した細胞体積の変化と、光学的経路の長さの移動。 本発明の好ましい実施例に基づいて画像データを処理するソフトウエア・プログラムで用いられる処理手順である。

Claims (15)

1. 光源、撮影対象を有する第一の光学的経路、第二の基準光学的経路、及び第一の光学的経路及び第二の基準光学的経路からの光を受けるように配置された撮影装置、
   撮影装置での二次元画像の撮影を可能とする干渉縞構造を形成するために第二の基準光学的経路に対して角度を以って第一の光学的経路が傾斜されるように光源からの光を配置する装置、及び
   撮影装置に接続され、撮影装置から二次元画像データを受けて撮影対象の位相画像を形成するように二次元画像データのヒルベルト（Ｈｉｌｂｅｒｔ）変換を実施する、ソフトウエア・プログラムでプログラム組みされたプロセッサー、
   を具備するヒルベルト（Ｈｉｌｂｅｒｔ）位相撮影顕微鏡装置。
2. 光源から第一の光学的経路及び第二の基準光学的経路に光を結合する光ファイバー装置を更に備えている、請求項１記載の装置。
3. 前記光源がレーザーを備え、
   １回の撮影によるフルフィールド位相画像が前記撮影装置で形成されるように、前記第二の基準光学的経路からの画像と前記第一の光学的経路からの画像とを結合するビームスプリッタを更に有している、請求項１記載の装置。
4. 前記装置が可動ミラーを有している請求項１記載の装置。
5. 撮影装置で撮影された干渉縞構造を形成するために第二の基準光学的経路に対して角度を以って第一の光学的経路が傾斜されるように、光源からの光を配置する調節装置を更に有し、
   撮影対象用のホルダーにより倒立顕微鏡に対して撮影対象が取付けられている、
   請求項１記載の装置。
6. 倒立顕微鏡は、撮影対象用のホルダー、対物レンズ、ビームスプリッタ、及び撮影装置上に光を結ぶレンズを有している請求項５記載の装置。
7. 複数の画像を一時的シークエンスで発生させる撮影装置、ここで各画像が対象の１回の撮影によるフルフィールド位相画像を含む、を含む、請求項１記載の装置。
8. プロセッサーは、フーリエ高域フイルターリングにより放射照度をフーリエ変換し、周波数が所定の値より高い成分だけ取り出して逆フーリエ変換するソフトウエア・プログラムを有している請求項１記載の装置。
9. 撮影装置が、少なくとも４８０×６４０の画素を有し且つ少なくとも１０フレーム／秒で動作するＣＣＤ又はＣＭＯＳ装置を備えている請求項１記載の装置。
10. 光源からの光で撮影対象を照射して、ｘ軸とｙ軸を有する撮影装置で対象を撮影し、ここで、撮影装置は第二の基準光学的経路に対して角度をもっている第一の光学的経路から光を受ける、過程と、
    二次元画像データを形成するために撮影装置で干渉縞構造を検出する過程と、
    撮影装置に接続され、撮影対象の二次元定量位相画像を形成するために画像データのヒルベルト（Ｈｉｌｂｅｒｔ）変換を行うようにソフトウエア・プログラムでプログラム組みされたデータプロセッサーで二次元画像データを処理する過程と、
    を有する顕微鏡で撮影対象を撮影する方法。
11. 撮影装置の直交軸に対して４５°の角度で干渉パターンの縞構造を配置する過程を有する請求項１０記載の方法。
12. 生物学的材料または組織サンプルを撮影する過程を有している請求項１０記載の方法。
13. レーザー光源を設ける過程を有し、１回の撮影によるフルフィールド位相画像を検出する第一の光学的経路及び第二の基準光学的経路内に撮影装置が配置されている請求項１０記載の方法。
14. フーリエ高域フイルターリングにより放射照度をフーリエ変換し、周波数が所定の値より高い成分だけ取り出して逆フーリエ変換する請求項１０記載の方法。
15. 測定のために哺乳動物の身体から採取した組織又は血液を撮影する過程を有している請求項１４記載の方法。

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