CN111580261A

CN111580261A - 一种基于落射式照明的显微成像装置

Info

Publication number: CN111580261A
Application number: CN202010626065.2A
Authority: CN
Inventors: 储开芹; 扎克; 时瑞洁
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2020-08-25
Anticipated expiration: 2040-07-01
Also published as: CN111580261B

Abstract

本申请提供基于落射式照明的显微成像装置，包括：环形光源、第一聚焦模组、显微物镜、样品台、环形衰减片、第二聚焦模组和第一图像采集装置；通过上述显微成像装置，对厚样品的后向散射信号进行采集，并通过环形衰减片降低系统背景和样品漫反射对微弱的后向散射信号产生的干扰，实现采集较为清晰的后向散射信号，从而提高显微成像装置厚样品的Z向分辨率，同时降低图像背景噪声。

Description

一种基于落射式照明的显微成像装置

技术领域

本发明涉及光学成像技术领域，尤其涉及一种基于落射式照明的显微成像装置。

背景技术

高时空分辨率、高对比度的三维显微成像技术对研究模式生物等厚样品有着重要意义，实现可视化模式生物体内各组织且达到细胞级别分辨率在遗传生物学、神经生物学方面都很有应用前景。

但是现有技术中的显微成像技术研究厚样品时，Z向分辨率较低、图像背景噪声较大。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于落射式照明的显微成像装置，以解决现有技术中显微成像装置Z向分辨率较差、图像背景噪声较大的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于落射式照明的显微成像装置，包括：

环形光源、第一聚焦模组、显微物镜、样品台、环形衰减片、第二聚焦模组和第一图像采集装置；

环形光源发出的光经过所述第一聚焦模组聚焦在所述显示物镜的后焦面处；

通过所述显微物镜后的平行光出射倾斜照射所述样品台上的样品；

所述样品台上的样品的界面反射的未散射光和所述样品的后向散射光经过所述显微物镜收集，照射至所述环形衰减片上；

所述环形衰减片对所述界面反射的未散射光进行衰减；

所述样品的后向散射光通过所述环形衰减片后的所述第二聚焦模组聚焦在所述第一图像采集装置上，实现散射通道的三维成像。

优选地，所述第一聚焦模组包括：

沿所述环形光源到所述显微物镜的光轴方向依次设置的工业镜头、第一透镜和第一镜筒透镜；

其中，所述工业镜头、所述第一透镜、所述第一镜筒透镜和所述显微物镜中相邻的两个透镜满足共焦关系；

所述显微成像装置还包括分束镜；所述分束镜位于所述工业镜头和所述第一透镜之间，用于将所述环形光源的照明光的光轴方向改变；以便使得所述界面反射的未散射光和所述样品的后向散射光透过所述分束镜，与所述照明光分开；

所述第二聚焦模组为第二透镜，所述第一图像采集装置为第一相机。

优选地，所述第一聚焦模组包括：工业镜头，所述工业镜头将所述环形光源发出的光聚焦至所述显微物镜的后焦面；

还包括分束镜；所述分束镜位于所述工业镜头和所述显微物镜之间，用于将所述环形光源的照明光的光轴方向改变；以便使得所述界面反射的未散射光和所述样品的后向散射光透过所述分束镜，与所述照明光分开；

所述环形衰减片和所述分束镜之间还包括第一镜筒透镜和第一透镜；

所述第二聚焦模组为第二透镜；所述第一图像采集装置为第一相机。

优选地，所述第一聚焦模组包括：

沿所述环形光源到所述显微物镜的光轴方向依次设置的工业镜头、第一透镜和第二透镜；

所述显微成像装置还包括分束镜；所述分束镜位于所述第二透镜和所述显微物镜之间，用于将所述环形光源的照明光的光轴方向改变；以便使得所述界面反射的未散射光和所述样品的后向散射光透过所述分束镜，与所述照明光分开；

所述环形衰减片和所述分束镜之间还包括第一镜筒透镜和第三透镜；

所述第二聚焦模组为第四透镜；所述第一图像采集装置为第一相机。

优选地，还包括激光器、二向色镜、第三聚焦模组和第二图像采集装置；

所述激光器位于所述环形光源的圆心；

所述二向色镜位于所述显微物镜背离所述样品台的一侧，用于将激光器照射的光照射至所述样品台的样品上，所述样品被激发后得到辐射光；

所述辐射光经过所述显微物镜、所述二向色镜和所述第三聚焦模组聚焦至所述第二图像采集装置，用于形成荧光通道成像。

优选地，所述环形光源为环形LED光源；

所述环形光源包括多个LED灯珠，所述多个LED灯珠组成环形；

或，所述环形光源为通过对圆形LED光源遮挡中心区域后得到。

优选地，所述环形LED光源的波长范围为380nm-780nm，包括端点值。

优选地，所述环形衰减片为光密度值大于或等于1的中性衰减片。

优选地，所述环形衰减片的环形径向宽度为0-5mm，包括5mm，不包括0。

经由上述的技术方案可知，本发明提供的基于落射式照明的显微成像装置，包括环形光源、第一聚焦模组、显微物镜、样品台、环形衰减片、第二聚焦模组和第一图像采集装置；通过上述显微成像装置，对厚样品的后向散射信号进行采集，并通过环形衰减片降低系统背景和样品漫反射对微弱的后向散射信号产生的干扰，实现采集较为清晰的后向散射信号，从而提高显微成像装置厚样品的Z向分辨率，同时降低图像背景噪声。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的环形光源实现的倾斜照射方式与垂直照明对比图；

图2为本发明实施例提供的一种基于落射式照明的显微成像装置结构示意图；

图3为本发明实施例提供的一种环形光源结构示意图；

图4为本发明实施例提供的另一种环形光源结构示意图；

图5为本发明实施例提供的一种环形衰减片的结构示意图；

图6为本发明实施例提供的一种基于落射式照明的显微成像装置结构示意图；

图7为本发明实施例提供的另一种基于落射式照明的显微成像装置结构示意图；

图8为本发明实施例提供的另一种基于落射式照明的显微成像装置结构示意图。

具体实施方式

正如背景技术部分所述，现有技术中的显微成像装置在研究厚样品时，存在Z向分辨率低、图像背景噪声大的问题。

发明人发现，现有技术中的厚样品由于其组织结构致密对光的散射和吸收也随之增强，对成像技术的Z向分辨率要求更高；同时，样品中未散射的光和多次散射的光会导致明亮的背景，如何降低背景提高图像对比度成为关键。

现有技术中当前对厚样品成像的主要工具包括：共聚焦显微镜、双光子荧光显微镜、光片显微镜。这三种显微成像技术都是基于荧光标记来产生图像对比度，荧光标记一定程度上会影响生物样品的结构，荧光物质被激发时对生物样品的结构会产生不可逆的改变发生光漂白现象，这对样品进行长时间连续观察是不利的。

因此，现有技术中提出无标记成像方法，DIC(收集前向散射光)的出色成像质量取决于光束的偏振态的维持，但是当光束传播通过厚样品时，其偏振度会下降，最终导致只能在样品的浅层区域获得较好结构信息。DIC的最新发展GLIM(Gradient lightinterference microscopy)和Epi-GLIM(Epi-illumination gradient lightinterference microscopy)通过对两束偏振光中的一个施加相移来实现三维量化位相成像。由于厚样品对光的偏振状态的改变，通过相移法计算出来的位相图像对比度较低，仍需要图像处理，但数据处理特别是非线性过滤不仅要求图像的信噪比高，还可能会导致不真实结构。

还有利用三维衍射层析技术对厚样品进行散射建模来恢复样品的三维信息。使用单次散射模型而忽略多次散射信息导致最终没有在线虫体内达到细胞级别的分辨率，而还有一些研究，虽然使用多次散射模型，但是其由于数据重建时间与线虫的生长周期相比太长，同时在建模的过程中的近似可能丢失了细胞级精度，数据经过复杂的处理带来的伪影与样品自身的细节如何区分，仍需要进一步的改进和验证。另外一些研究人员提出了一种基于反射式几何照明的适用于任意厚度样品的无标记成像技术OBM(Oblique Back-illumination Microscopy)，系统的照明和探测在样品的同一侧完成，但照明光源的照明方向是偏离探测光轴的，其实际上还是收集样品的前向散射信号，限制了其Z向分辨率，对于结构致密的样品能否达到细胞级分辨率尚有待证实。

因此，高的Z分辨率和低的背景对于厚样品的成像是非常必要的。发明人通过研究发现，检测后向散射的信号更有利于提高系统的轴向分辨率，这是由于在频域中分析可知，收集后向散射信号的光学系统，其传递函数在轴向覆盖的高频区域相比于收集前向散射信号的传递函数更广，因此，高的Z分辨率对厚样品的成像有积极意义。但由于后向散射信号比前向散射低的多，甚至要低几个数量级别，能否在系统背景光和样品漫反射光中检测到这些微弱信号则是关键。

基于此，本发明提供一种基于落射式照明的显微成像装置，包括：

所述环形衰减片对所述界面反射的未散射光进行衰减；

本发明实施例中通过设置光学成像系统，使得显微成像装置能够采集厚样品的后向散射信号，提高Z向分辨率；且通过加入环形衰减片来降低系统背景和样品漫反射对微弱的后向散射信号产生的干扰，直接从原始图像中获得样品中细胞级的信息，避免由于去卷积、滤波等处理可能导致的伪影与真实信息之间的混淆，有利于忠实记录样品信息。也即，本发明提供的显微成像系统能够实现采集较为清晰的后向散射信号，从而提高显微成像装置厚样品的Z向分辨率，同时降低图像背景噪声。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供一种基于落射式照明的显微成像装置，大体结构包括：环形光源、第一聚焦模组、显微物镜、样品台、环形衰减片、第二聚焦模组和第一图像采集装置；环形光源发出的光经过第一聚焦模组聚焦在显示物镜的后焦面处；通过显微物镜后的平行光出射倾斜照射样品台上的样品；样品台上的样品的界面反射的未散射光和样品的后向散射光经过显微物镜收集，照射至环形衰减片上；环形衰减片对界面反射的未散射光进行衰减；样品的后向散射光通过环形衰减片后的第二聚焦模组聚焦在第一图像采集装置上，实现散射通道的三维成像。

其中，由于样品通常需要在水溶液环境中，样品放置于培养皿中，培养皿底部是玻璃的，样品台上的样品的界面反射的未散射光中，此处界面为是指水-玻璃界面。

由于本实施例中采用环形光源，从而能够使得通过显微物镜后的平行光出射倾斜照射样品台上的样品，具体可以参见图1所示。

本发明提供的显微成像系统能够实现采集较为清晰的后向散射信号，通过加入环形衰减片来降低系统背景和样品漫反射对微弱的后向散射信号产生的干扰，直接从原始图像中获得样品中细胞级的信息，避免由于去卷积、滤波等处理可能导致的伪影与真实信息之间的混淆，有利于忠实记录样品信息。也即，通过轴向分辨率的提高和对通过添加衰减片对参考光做的衰减，原始数据可以达到比较好的图像质量，因此，无需进行图像处理，从而避免了图像处理过程中可能引入一些图像伪影混淆样品的真实结构。

需要说明的是，只要能够实现上述光路的显微成像装置均在本发明的保护范围中，本实施例中对于能够实现上述光路的显微成像具体结构不做限定。为方便说明本发明实施例中提供的基于落射式照明的显微成像装置的具体结构，下面进行举例说明。

请参见图2，图2为本发明实施例提供的一种基于落射式照明的显微成像装置结构示意图，所述显微成像装置包括：环形光源10、第一聚焦模组20、显微物镜30、样品台40、环形衰减片50、第二聚焦模组60和第一图像采集装置70。

其中，第一聚焦模组20包括：沿环形光源到显微物镜的光轴方向依次设置的工业镜头201、第一透镜202和第一镜筒透镜203；其中，工业镜头201、第一透镜202、第一镜筒透镜203和显微物镜30依次互为4f系统。也即，工业镜头201和第一透镜202满足共焦关系；第一透镜202与第一镜筒透镜203满足共焦关系；第一镜筒透镜203和显微物镜30满足共焦关系。

需要说明的是，为了能够将照明光和散射光信号分开，本实施例中，如图2所示，还包括分束镜80；分束镜位于工业镜头201和第一透镜202之间，用于将环形光源10的照明光的光轴方向改变，以便使得界面反射的未散射光和样品的后向散射光透过分束镜，与照明光分开。本实施例中不限定改变的具体角度，可选的，本实施例中可以使用分束镜将照明光的光轴方向改变90度，这样分束镜设置时，直接设置为与光轴呈45度角即可，方便调节。

本实施例中不限定第二聚焦模组60和第一图像采集装置70的具体结构，可选的，第二聚焦模组60为第二透镜，所述第一图像采集装置70为第一相机。所述环形光源可以为环形LED光源；所述环形光源包括多个LED灯珠，所述多个LED灯珠1-1组成环形，请参见图3；或，所述环形光源为通过对圆形LED面光源1-2遮挡中心区域后得到，请参见图4。为了使散射通道轴向清晰成像的范围更深，又考虑到LED的光源带宽可以在380nm-780nm，可选的，本实施例中环形LED光源的波长范围为380nm-780nm，包括端点值。

需要说明的是，本实施例中环形衰减片的作用为：降低图像背景提高对比度，对样品界面反射的未散射光进行幅值调制，使得光强衰减；而通过样品的后向散射光，因此可选的，环形衰减片的结构如图5所示，内圈的黑色圆环501对直接反射回的光的幅值做调制，样品的后向散射光由周围的白色区域502透过。本实施例中不限定环形衰减片的具体结构，可选的，所述环形衰减片可以是光密度(OD)值大于或等于1的中性衰减片，也即中性密度滤光片，OD(opticaldensity)为光密度，代表光经过该滤光片的透过率。为实现衰减作用，可选的，所述环形衰减片的环形径向宽度为0-5mm，包括5mm，不包括0，也即内圈黑色区域501的径向宽度。

本实施例中提供的显微成像装置的工作原理为：环形LED光源10发出的光被工业镜头201收集后聚焦，经过分束镜80反射被第一透镜202收集后变成平行光，经过第一镜筒透镜203后被聚焦在显微物镜30的后焦面处，通过显微物镜30后以平行光出射倾斜照射在样品台40上的待测样品上，然后由界面反射的未散射光和样品的后向散射光经过显微物镜30和第一镜筒透镜203、第一透镜202、分束镜80后，未散射光聚焦在衰减片50的幅值调制环上，而样品的后向散射光被第二透镜60收集最终聚焦在第一相机70上，然后通过移动样品台40来对样品聚焦，实现散射通道的三维成像。其中环形光源所在平面垂直与光轴，且环形光源的中心在光轴上，本实施例中不限定环形光源与工业镜头之间的距离，只要满足工业镜头成像要求即可，可选的，环形光源可以距离工业镜头100mm-130mm。

需要说明的是，为了验证本发明中的显微成像装置的效果，可选的，本实施例中提供的基于落射式照明的显微成像装置，如图6所示，还可以包括：激光器21、二向色镜22、第三聚焦模组23和第二图像采集装置24；激光器21位于环形光源10的圆心；二向色镜22位于显微物镜30背离样品台的一侧，用于将激光器21照射的光照射至样品台40的样品上，样品被激发后得到辐射光；辐射光经过显微物镜30、二向色镜22和第三聚焦模组23聚焦至第二图像采集装置24，用于形成荧光通道成像。

其中，本实施例中二向色镜22为低反高通二向色镜，低于580nm的光反射，高于580nm的光透过，本实施例中，激光器选用561nm的波长是由通常RFP(红色荧光蛋白)标记的样品的激发光或辐射光的光谱决定的。

请参见图6，荧光通道的照明从激光器21出发，经过工业镜头201、分束镜80和第一透镜202后完成扩束，接着经过第一镜筒透镜203、二向色镜22和显微物镜30后以平行光出射照射待测样品，样品被激发后的辐射光经过显微物镜30、二向色镜22和第二镜筒透镜203后聚焦在第二相机24上，同样的通过移动样品台40来完成荧光通道成像。

需要说明的是，激光器和环形LED光源理论上可以同时照明，但为了减少荧光通道的图像背景优先选择分开照明，可以通过控制模块实现光源的开关控制。

本发明实施例中提供的显微成像装置为宽场成像，当样品较小时，不需要进行X-Y扫描；当样品较大时，且具有一定厚度，通过X-Y-Z三个方向移动样品台能够获得样品的三维信息。

本发明实施例提供的显微成像装置，除了上面的结构之外，还可以如图7和图8所示的结构。

请参见图7，本实施例中提供的基于落射式照明的显微成像装置中，第一聚焦模组包括：工业镜头31，工业镜头31将环形光源发出的光聚焦至显微物镜30的后焦面；分束镜80位于工业镜头31和显微物镜30之间，用于将环形光源10的照明光的光轴方向改变90度，以便使得界面反射的未散射光和样品的后向散射光透过分束镜，与照明光分开；在其他实施例中，也可以改变为其他角度，本发明中对此不作限定。环形衰减片50和分束镜80之间还包括第一镜筒透镜32和第一透镜33；第二聚焦模组为第二透镜；第一图像采集装置70为第一相机。

具体的，基于落射式照明的显微成像装置包括环形LED光源10、工业镜头31、分束镜80、二向色镜22、显微物镜30、样品台40、第一镜筒透镜32、第一透镜33、衰减片50、第二透镜60、第一相机70、激光器21、第二镜筒透镜23、第二相机24，所述的工业镜头31和显微物镜30，显微物镜30、第一镜筒透镜32、第一透镜33和第二透镜60都依次为4f系统；环形LED光源10发出的光被工业镜头31收集后聚焦，经过分束镜80和二向色镜22反射后聚焦在显微物镜30的后焦面处，通过显微物镜30后以平行光出射倾斜照射待测样品上，然后由界面反射的光和样品的后向散射光被显微物镜30收集，经过二向色镜22和分束镜80、第一镜筒透镜32、第一透镜33后未散射光聚焦在衰减片50的幅值调制环上，而样品的后向散射光被第二透镜60收集最终聚焦在第一相机70上，然后通过移动样品台40来对样品聚焦，实现散射通道的三维成像；另外荧光通道的照明从激光器21出发，经过工业镜头31、分束镜80、二向色镜22和显微物镜30后以平行光出射照射待测样品，样品被激发后的辐射光经过显微物镜30、二向色镜4和第二镜筒透镜23后聚焦在第二相机24上，同样的通过移动样品台40来完成荧光通道成像。

请参见图8，本实施例中提供的基于落射式照明的显微成像装置中，第一聚焦模组包括：沿环形光源10到显微物镜30的光轴方向依次设置的工业镜头41、第一透镜42和第二透镜43。分束镜80位于第二透镜43和显微物镜30之间，用于将环形光源的照明光的光轴方向改变90度；以便使得界面反射的未散射光和样品的后向散射光透过分束镜，与照明光分开；在其他实施例中，也可以改变为其他角度，本发明中对此不作限定。环形衰减片50和分束镜80之间还包括第一镜筒透镜32和第三透镜33；第二聚焦模组为第四透镜60；第一图像采集装置为第一相机70。

具体的，如图8所示，基于落射式照明的显微成像装置包括环形LED光源10、工业镜头41、第一透镜42、第二透镜43、分束镜80、二向色镜22、显微物镜30、样品台40、第一镜筒透镜32、第三透镜33、衰减片50、第四透镜60、第一相机70，工业镜头41、第一透镜42、第二透镜43和显微物镜30依次为4f系统；环形LED光源1发出的光被工业镜头收集后聚焦，通过延伸透镜组第一透镜42和第二透镜43，再由分束镜80和二向色镜22反射后聚焦在显微物镜30的后焦面处，通过显微物镜30后以平行光出射倾斜照射待测样品上，然后由界面反射的光和样品的后向散射光被显微物镜30收集，经过二向色镜22和分束镜80、第一镜筒透镜32、第三透镜33后直接反射回的光聚焦在衰减片50的幅值调制环上，而样品的后向散射光被第四透镜60收集最终聚焦在第一相机70上，然后通过移动样品台40来对样品聚焦，实现散射通道的三维成像；另外荧光通道的照明从激光器21出发，经过工业镜头41、延伸透镜组第一透镜42和第二透镜43、分束镜80、二向色镜22和显微物镜30后以平行光出射照射待测样品，样品被激发后的辐射光经过显微物镜30、二向色镜22和第二镜筒透镜23后聚焦在第二相机24上，同样的通过移动样品台40来完成荧光通道成像。

需要说明的是，本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。

还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括上述要素的物品或者设备中还存在另外的相同要素。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，包括：

所述环形衰减片对所述界面反射的未散射光进行衰减；

2.根据权利要求1所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述第一聚焦模组包括：

3.根据权利要求1所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述第一聚焦模组包括：工业镜头，所述工业镜头将所述环形光源发出的光聚焦至所述显微物镜的后焦面；

4.根据权利要求1所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述第一聚焦模组包括：

5.根据权利要求1-4任意一项所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，还包括激光器、二向色镜、第三聚焦模组和第二图像采集装置；

所述激光器位于所述环形光源的圆心；

6.根据权利要求1-4任意一项所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述环形光源为环形LED光源；

所述环形光源包括多个LED灯珠，所述多个LED灯珠组成环形；

7.根据权利要求6所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述环形LED光源的波长范围为380nm-780nm，包括端点值。

8.根据权利要求1所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述环形衰减片为光密度值大于或等于1的中性衰减片。

9.根据权利要求8所述的基于落射式照明的显微成像装置，其特征在于，所述环形衰减片的环形径向宽度为0-5mm，包括5mm，不包括0。