CN112540455A - 反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，属于显微成像系统技术领域。解决了现有技术中透射式傅里叶叠层显微成像系统成像速度慢的技术问题。本发明的显微成像系统，包括发光二极管阵列、透镜阵列、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、连续变焦光学系统、分光棱镜、显微物镜、套筒透镜和探测器；其中，发光二极管阵列由N个二极管组成，透镜阵列由P个平凸透镜组成，连续变焦光学系统包含固定透镜组、变倍透镜组和补偿透镜组。该成像系统减少了图像采集时间，提高了数据采集效率，成像分辨率是对应显微镜物镜分辨率的两倍。

Description

反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统
技术领域
本发明属于显微成像系统技术领域，具体涉及一种反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统。
背景技术
光学显微镜(英文Optical Microscope，简写OM)是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。现有的光学显微镜由于受远场衍射极限的影响，根据瑞利判据，其分辨率一般不会超过波长的一半。而波长低于400nm的光通常会损伤活细胞，无法应用于活细胞观测。因此，现有的光学显微镜横向分辨率一般仅为230nm左右。对于生命科学追求的是在小分子尺度对单个活体细胞的动态成像，因此围绕活体细胞的超分辨成像一直是仪器开发的热点。其中电子显微镜可以达到0.1nm的超高分辨率，但由于生物样品无法存活于高真空环境，无法应用于活细胞。现有的超分辨技术主要是基于荧光分子成像技术，如光激活定位显微技术，随机光学重构显微技术、受激发射损耗技术和多光子显微技术等，然而荧光超分辨显微技术受限于发射光的光谱宽度和光毒性，仅能对几种荧光标记同时成像，不能对细胞内所有细胞器进行标记成像，难以观测细胞器复杂的生理活动。无标记成像则不受荧光标记物的各种限制，是研究活细胞动态过程以及各项生理活动的最佳手段。当光照射几乎透明的细胞时，其振幅几乎不变，但是透射光的相位则包含了关于样品的形貌和折射率信息。由此衍生出一系列的定量相位显微技术，但是该技术是基于高相干性激光和复杂的干涉装置，甚至机械扫描装置。
傅里叶叠层显微技术(FPM)是一种大视场高分辨率定量相位计算显微成像技术，是根据在空域中记录的光强信息和在频域中某种固定的映射关系来进行交替迭代的，同时该技术借用了合成孔径叠层成像的思想，使得最终成像数值口径超出显微物镜数值口径，实现超显微物镜本身的光学衍射极限。
现有的傅里叶叠层成像系统使用一个方形阵列的发光二极管平板作为照明光源，每个发光二极管从不同的角度照射样品对应每个照明角度相机拍摄到一幅低分辨率图像，这些图像最终被用来重构一幅高分辨率复振幅图像。这种透射式成像方式要进行准确的重构就需要拍摄大量的原始低分辨率图像，限制了其成像速度，进而限制了其应用。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中透射式傅里叶叠层显微镜成像速度慢的技术问题，提供一种反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，包括发光二极管阵列、透镜阵列、第一聚焦透镜、第二聚焦透镜、连续变焦光学系统、分光棱镜、显微物镜、套筒透镜和探测器；
所述发光二极管阵列由N个二极管组成；
所述透镜阵列由P个平凸透镜组成，P个平凸透镜与N个二极管一一对应，并且对于对应的平凸透镜和二极管，平凸透镜的数值孔径与二极管的出光发散角相匹配；
所述连续变焦光学系统，包含固定透镜组、变倍透镜组和补偿透镜组；
该反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的光路走向为：发光二极管阵列的N个二极管中位于同一个环形上的二极管依次单独发光，所述环形的数值孔径与显微物镜的数值孔径相匹配，每个二极管发出的光经过透镜阵列中对应的平凸透镜准直后，依次经过第一聚焦透镜和第二聚焦透镜进行光束缩束，然后进入连续变焦光学系统，到达分光棱镜，分光棱镜将光反射进入显微物镜，通过调节连续变焦光学系统的变倍透镜组，使光源的直径与显微物镜的孔径相匹配，同时调节连续变焦光学系统的补偿透镜组，使从显微物镜的出射光斑为均匀光斑，均匀光斑照射样品后，样品产生后向散射光被显微物镜收集变成平行光，然后经过套筒透镜聚焦在探测器上，探测器采集每个二极管照射的样品的图像。
进一步的，所述N个二极管通过控制器进行编程控制。
进一步的，所述发光二极管阵列由N个呈方阵排布的二极管组成，透射阵列由P个呈方阵排布的平凸平凸透镜组成，平凸透镜的外轮廓为圆形，相邻的两个平凸透镜均相切；更进一步的，发光二极管阵列为7×7的方阵阵列，所述透镜阵列为7×7的方阵阵列。
进一步的，所述发光二极管阵列的波长范围为400～1000nm，单波长带宽为10～20nm。
进一步的，所述变倍透镜组为负光焦度，作线性移动实现连续变倍；补偿透镜组为正光焦度，作非线性移动来补偿像面。
进一步的，所述分光棱镜为半反半透棱镜。
进一步的，所述显微物镜为平场消色散无限远矫正物镜，放大倍率范围为10～100倍。
进一步的，套筒透镜为无限远矫正透镜，焦距为200mm、180mm或165mm。
进一步的，所述探测器为sCMOS型探测器或EMCCD型探测器。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，该系统采用环形照明的方式，即只拍摄高频分量的图像来减少图像采集时间，提高了数据采集效率，根据傅里叶重构算法重构出一幅高分辨图像，从而实现高速傅里叶叠层成像。
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统使用倒置显微成像技术对样品进行成像，成像系统的最大数值口径等于显微物镜的数值口径，因此反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的数值口径为显微物镜数值口径的两倍，理论上反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的成像分辨率是对应显微镜物镜分辨率的两倍。
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统能用于长时间对活细胞进行生命活动观察，在研究肿瘤细胞特性，活细胞内细胞器生理的动态过程以及细胞相互作用的领域有应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式中的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的结构示意图；
图2为本发明提供的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的发光二极管阵列的结构示意图；
图3为本发明提供的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的透镜阵列的结构示意图；
图4为本发明提供的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的连续变焦光学系统的结构示意图；
图中，1、发光二极管阵列，2、透镜阵列，3、第一聚焦透镜，4、第二聚焦透镜，5、连续变焦光学系统，5-1、固定透镜组、5-2、变倍透镜组、5-3、补偿透镜组，6、分光棱镜，7、显微物镜，8、样品，9、套筒透镜，10、探测器。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。应当理解，本发明所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
如图1所示，本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，包括发光二极管阵列1、透镜阵列2、第一聚焦透镜3、第二聚焦透镜4、连续变焦光学系统5、分光棱镜6、显微物镜7、套筒透镜9和探测器10。
如图2所示，发光二极管阵列1由N个二极管组成，N个二极管中位于同一个环形上的二极管能够依次单独发光，该环形的数值孔径与显微物镜的数值孔径相匹配。优选发光二极管阵列1由N个呈方阵排布的二极管组成，相邻的两个二极管可接触也可不接触，没有限制，通过控制N个呈方阵排布的二极管中一部分二极管发光，其他二极管不发光，实现位于同一个环形上的二极管依次单独发光。优选N个二极管通过控制器进行编程控制。N没有特殊限制，优选为49个，以7×7方阵排布。发光二极管阵列1，可选波长范围为400～1000nm，单波长带宽为10～20nm。
如图3所示，透镜阵列2由P个平凸透镜组成，P个平凸透镜与N个二极管一一对应，并且对于对应的平凸透镜和二极管，平凸透镜的数值孔径与二极管的出光发散角相匹配。优选透射阵列2由P个呈方阵排布的平凸透镜组成，平凸透镜的外轮廓为圆形，相邻的两个平凸透镜均相切。P没有特殊限制，优选为49个，以7×7方阵排布。透镜阵列2的平凸透镜用于将对应的二极管出射的发散光进行准直。
如图4所示，连续变焦光学系统5，包含固定透镜组5-1、变倍透镜组5-2和补偿透镜组5-3，其中，变倍透镜组5-2为负光焦度，作线性移动实现连续变倍；补偿透镜组5-3为正光焦度，作非线性移动来补偿像面，使系统像质保持良好。连续变焦光学系统5用于连续调节成像系统的放大倍率，使光源的直径与显微物镜7的孔径相匹配。
分光棱镜6将环形照明光源的光反射入显微物镜7，然后照射到样品8上，优选分光棱镜6为半反半透棱镜。
显微物镜7为平场消色散无限远矫正物镜，放大倍率范围为10～100倍，可以为浸油型物镜或非浸油型物镜，显微物镜7用于接收样品8的成像光。
套筒透镜9为无限远矫正透镜，焦距可以为200mm、180mm或165mm，套筒透镜9与显微物镜7构成无限远成像系统。
探测器10，用于接收环形照明光源中的各个照明方向的样品成像，获得与显微物镜7数值孔径相匹配的高频成像信息，然后进行数据处理，获得高分辨成像结果。探测器10优选为sCMOS型探测器或EMCCD型探测器。
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的光路走向为：发光二极管阵列的N个二极管中位于同一个环形上的二极管依次单独发光，该环形的数值孔径与显微物镜的数值孔径相匹配，每个二极管发出的光经过透镜阵列中对应的平凸透镜准直后，依次经过第一聚焦透镜3和第二聚焦透镜4进行光束缩束，然后进入连续变焦光学系统5，到达分光棱镜6，分光棱镜6将光反射进入显微物镜7，通过调节连续变焦光学系统5的变倍透镜组5-2，使光源的直径与显微物镜7孔径相匹配，同时调节连续变焦光学系统5的补偿透镜组5-3，使从显微物镜7出射的光斑为均匀光斑，均匀光斑照射样品8后，样品8产生后向散射光被显微物镜7收集变成平行光，然后经过套筒透镜9聚焦在探测器10上，探测器10依次采集每个二极管照射的样品8的图像。进而上位机根据傅里叶重构算法重构出一幅高分辨图像。
本发明的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的工作原理为：采用环形照明的方式，即只拍摄高频分量的图像来减少图像采集时间，提高了数据采集效率，根据傅里叶重构算法重构出一副高分辨图像，从而实现高速傅里叶叠层成像。成像系统的数值口径NAill等于显微物镜7的数值口径NAobj，因此成像系统数值口径NAFPM为物镜数值口径NAobj的2倍，理论上成像系统的成像分辨率是对应显微镜物镜分辨率的2倍。
显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，包括发光二极管阵列(1)、透镜阵列(2)、第一聚焦透镜(3)、第二聚焦透镜(4)、连续变焦光学系统(5)、分光棱镜(6)、显微物镜(7)、套筒透镜(9)和探测器(10)；
所述发光二极管阵列(1)由N个二极管组成；
所述透镜阵列(2)由P个平凸透镜组成，P个平凸透镜与N个二极管一一对应，并且对于对应的平凸平凸透镜和二极管，平凸透镜的数值孔径与二极管的出光发散角相匹配；
所述连续变焦光学系统(5)，包含固定透镜组(5-1)、变倍透镜组(5-2)和补偿透镜组(5-3)；
该反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统的光路走向为：发光二极管阵列(1)的N个二极管中位于同一个环形上的二极管依次单独发光，所述环形的数值孔径与显微物镜(7)的数值孔径相匹配，每个二极管发出的光经过透镜阵列(2)中对应的平凸透镜准直后，依次经过第一聚焦透镜(3)和第二聚焦透镜(4)进行光束缩束，然后进入连续变焦光学系统(5)，到达分光棱镜(6)，分光棱镜(6)将光反射进入显微物镜(7)，通过调节连续变焦光学系统(5)的变倍透镜组(5-2)，使光源的直径与显微物镜(7)的孔径相匹配，同时调节连续变焦光学系统(5)的补偿透镜组(5-3)，使从显微物镜(7)出射的光斑为均匀光斑，均匀光斑照射样品(8)后，样品(8)产生后向散射光被显微物镜(7)收集变成平行光，然后经过套筒透镜(9)聚焦在探测器(10)上，探测器(10)采集每个二极管照射样品(8)的图像。
2.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述N个二极管通过控制器进行编程控制。
3.根据权利要求2所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述发光二极管阵列(1)由N个呈方阵排布的二极管组成，透射阵列(2)由P个呈方阵排布的平凸透镜组成，平凸透镜的外轮廓为圆形，相邻的两个平凸透镜均相切。
4.根据权利要求3所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述发光二极管阵列(1)为7×7的方阵阵列，所述透镜阵列(2)为7×7的方阵阵列。
5.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述发光二极管阵列(1)的波长范围为400～1000nm，单波长带宽为10～20nm。
6.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述变倍透镜组(5-2)为负光焦度，作线性移动实现连续变倍；补偿透镜组(5-3)为正光焦度，作非线性移动来补偿像面。
7.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述分光棱镜(6)为半反半透棱镜。
8.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述显微物镜(7)为平场消色散无限远矫正物镜，放大倍率范围为10～100倍。
9.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述套筒透镜(9)为无限远矫正透镜，焦距为200mm、180mm或165mm。
10.根据权利要求1所述的反射式环形照明傅里叶叠层高分辨显微成像系统，其特征在于，所述探测器(10)为sCMOS型探测器或EMCCD型探测器。
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