CN111060485A - 微生物多模态成像系统和微生物多模态成像检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物多模态成像系统和微生物多模态成像检测方法,系统包括激光器组、适于将射入的第一成像激光束分成参考光束和样品光束或通过射入的第二成像激光束的光纤分束器、适于根据射入的样品光束和加载的第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品上或根据射入的第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成的第二结构光并将所述第二结构光照射至样品上的照明单元。它结合了光学衍射层析成像技术和三维结构照明显微镜技术的优势,利用数字微镜为其提供时分结构照明光,既能测量反映活性细胞或生物内部结构的三维定量信息,还能获得细胞或生物的三维荧光像,具有高的时空分辨率和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物多模态成像系统和微生物多模态成像检测方法。
背景技术
目前,饮用水中微生物,如隐孢子虫、贾第鞭毛虫和细菌等,会引起呕吐和腹泻等疾病,严重时可致死亡,为控制寄生虫病的传播和流行,保障人民饮食安全和生命健康,需要从源头上对饮用水中微生物进行检测、识别和预警。
荧光显微镜是一种常见的观测微生物形态的工具,通过特定的荧光蛋白或染料标记细胞内的特定分子来获得分子特异性信息,得到样品荧光图像。常规的荧光显微镜成像分辨率受限于光学衍射极限。近年来,利用三维空间结构光激发的荧光图像获得了优于常规荧光显微镜的横向和轴向分辨率。尽管三维结构光照明荧光成像方法具有出色的空间分辨率,但时间分辨率较差(机械式轴向扫描、长采集时间),而且存在荧光显微镜不可避免的问题,即荧光试剂的光毒性和光漂白性会对样品造成不可恢复的损伤。
光学衍射层析成像技术是一种定量成像方式,可用于测量生物样品的三维折射率分布。光学衍射层析无需荧光标记且无创的,避免了荧光分子对样品内部的破坏,保证了生物样品的活性,且图像采集速度快。然而,光学衍射层析提供的折射率通常只能提供有限的分子特异性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷,提供一种微生物多模态成像系统,它结合了光学衍射层析成像技术和三维结构照明显微镜技术的优势,荧光成像和光学衍射层析成像技术提供的细胞信息互补,故本发明利用数字微镜为其提供结构照明光,既能快速测量反映细胞或生物内部结构的三维定量信息,还能获得细胞或生物的三维荧光像,具有高的时空分辨率和特异性。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案是:一种微生物多模态成像系统,它具有光学衍射层析模态和结构光照明荧光成像模态,它包括:
激光器组,所述激光器组包括第一激光器和第二激光器,所述第一激光器适于产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束,所述第二激光器适于产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
适于将射入的第一成像激光束分成参考光束和样品光束或通过射入的第二成像激光束的光纤分束器;
适于根据射入的样品光束和加载的第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品上或根据射入的第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品上的照明单元;
适于记录用所述第一结构光照射的样品产生的衍射光束和所述参考光束发生干涉时产生的二维全息图像的第一相机;
适于利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内三维折射率图像的第一单元;
适于记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的二维荧光图像的第二相机;
适于根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像的第二单元。
进一步,还包括控制器,所述控制器分别与所述第一激光器和所述第二激光器控制相连,所述控制器适于控制所述第一激光器和所述第二激光器中的一个工作。
进一步,还包括合束器,所述合束器的合束端口分别与所述第一激光器和所述第二激光器的出射端口相连,所述合束器的出射端口与所述光纤分束器的入射端口相连。
进一步,所述照明单元包括:
数字微镜器件,所述数字微镜器件适于接收射入的样品光束和加载所述第一模拟全息图像以及生成样品光束照射第一模拟全息图像后产生的第一结构光或适于接收射入的第二成像激光束和加载第二模拟全息图像以及生成第二成像激光束照射第二模拟全息图像后产生的第二结构光;
将第一结构光或第二结构光照射至样品上的照明光路。
进一步,所述照明光路包括沿光束路径方向依次设置的照明分束镜、照明透镜、照明反射镜和照明物镜,第一结构光或第二结构光依次经过照明分束镜、照明透镜、照明反射镜和照明物镜后照射至样品上。
进一步,还包括适于导向用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下反射的荧光光束的荧光光束导向光路;
进一步,所述荧光光束导向光路包括:
沿荧光光束路径方向依次设置的滤波器、荧光导向反射镜、第一荧光导向透镜和第二荧光导向透镜,样品反射的荧光光束依次经过照明物镜、照明反射镜、照明透镜、照明分束镜、滤波器、荧光导向反射镜、第一荧光导向透镜和第二荧光导向透镜后进入第二相机的成像平面。
进一步,还包括适于用所述第一结构光照射的样品产生的衍射光束和所述参考光束导入所述第一相机的成像平面上的光学衍射层析光路。
进一步,所述光学衍射层析光路包括:
衍射光束导向光路,所述衍射光束导向光路用于导向衍射光束并沿衍射光束路径方向依次设置的衍射光束物镜、衍射导向反射镜和衍射导向透镜;
分光镜,所述分光镜适于收集参考光束和衍射光束并将其导入所述第一相机的成像平面上。
本发明还提供了一种微生物多模态成像检测方法,其特征在于它包括在光学衍射层析模态下的第一成像检测方法和在结构光照明荧光成像模态的第二成像检测方法;其中,
第一成像检测方法的步骤中含有:
产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束;
将第一成像激光束分成参考光束和样品光束;
模拟第一模拟全息图像,根据样品光束和第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品上;
记录样品上衍射产生的衍射光束和参考光束发生干涉时产生的二维全息图像;
利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内的三维折射率图像;
第二成像检测方法的步骤中含有:
产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
根据第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品上;
记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的二维荧光图像;
根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像。
进一步,一种微生物多模态成像检测方法,它基于微生物多模态成像系统实现。
采用了上述技术方案后,本发明提出的微生物多模态成像系统和微生物多模态成像检测方法与现有技术相比,结合了光学衍射层析和结构光照明荧光成像的优势,可以分别获得样品的无标记三维折射率图像和三维荧光成像图像,而且具有出色的时空分辨率以及高分子特异性。
附图说明
图1为本发明的微生物多模态成像系统的结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解,下面根据具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明。
实施例一
如图1所示,一种微生物多模态成像系统,它具有光学衍射层析模态和结构光照明荧光成像模态,它包括:
激光器组,所述激光器组包括第一激光器11和第二激光器12,所述第一激光器11适于产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束,所述第二激光器12适于产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
适于将射入的第一成像激光束分成参考光束和样品光束或通过射入的第二成像激光束的光纤分束器2;
适于根据射入的样品光束和加载的第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品10上或根据射入的第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品10上的照明单元;
适于记录用所述第一结构光照射的样品10产生的衍射光束和所述参考光束发生干涉时产生的二维全息图像的第一相机3;第一结构光是时分复用的,可生成多个不同的二维全息图像;
适于利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内三维折射率图像的第一单元;
适于记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的多个二维荧光图像的第二相机4;
适于根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像的第二单元。
具体地,如图1所示,系统还包括控制器5,所述控制器5分别与所述第一激光器11和所述第二激光器12控制相连,所述控制器5适于控制所述第一激光器11和所述第二激光器12中的一个工作。
在本实施例中,通过控制器5可使得系统在光学衍射层析模态和结构光照明荧光成像模态之间切换,每次只有一种模态起作用。
具体地,如图1所示,为了简化设置,系统还包括合束器 6,所述合束器6的合束端口分别与所述第一激光器11和所述第二激光器12的出射端口相连,所述合束器6的出射端口与所述光纤分束器2的入射端口相连。使用合束器6将两束不同类型激光束耦合进光纤分束器2中,一束激光作为光学衍射层析的光源,另一束激光作为结构光照明荧光成像光源。在本实施例中,光纤分束器采用1×2单模光纤分束器。
具体地,如图1所示,所述照明单元包括:
数字微镜器件71,所述数字微镜器件71适于接收射入的样品光束和加载所述第一模拟全息图像以及生成样品光束照射第一模拟全息图像后产生的第一结构光或适于接收射入的第二成像激光束和加载第二模拟全息图像以及生成第二成像激光束照射第二模拟全息图像后产生的第二结构光;
将第一结构光或第二结构光照射至样品10上的照明光路。
在本实施例中,样品光束可以通过一准直透镜20照射入数字微镜器件71中。
具体地,如图1所示,所述照明光路包括沿光束路径方向依次设置的照明分束镜72、照明透镜73、照明反射镜74和照明物镜75,第一结构光或第二结构光依次经过照明分束镜72、照明透镜73、照明反射镜74和照明物镜75后照射至样品10上。
还包括适于导向用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下反射的荧光光束的荧光光束导向光路;
所述荧光光束导向光路包括:
沿荧光光束路径方向依次设置的滤波器81、荧光导向反射镜82、第一荧光导向透镜83和第二荧光导向透镜84,样品10反射的荧光光束依次经过照明物镜75、照明反射镜74、照明透镜73、照明分束镜72、滤波器81、荧光导向反射镜82、第一荧光导向透镜83和第二荧光导向透镜84后进入第二相机4的成像平面。
具体地,如图1所示,系统还包括适于用所述第一结构光照射的样品10产生的衍射光束和所述参考光束导入所述第一相机3的成像平面上的光学衍射层析光路。
具体地,如图1所示,所述光学衍射层析光路包括:
衍射光束导向光路,所述衍射光束导向光路用于导向衍射光束并沿衍射光束路径方向依次设置的衍射光束物镜94、衍射导向反射镜91和衍射导向透镜92;
分光镜93,所述分光镜93适于收集参考光束和衍射光束并将其导入所述第一相机3的成像平面上。
在本实施例中,参考光束可以通过另一准直透镜20进入分光镜93再由分光镜93导向第一相机3中。
实施例二
一种基于本实施例中的微生物多模态成像系统实现的微生物多模态成像检测方法,它包括在光学衍射层析模态下的第一成像检测方法和在结构光照明荧光成像模态的第二成像检测方法;其中,
第一成像检测方法的步骤中含有:
通过第一激光器11产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束;
通过光纤分束器2将第一成像激光束分成参考光束和样品光束;
通过计算机模拟一系列时分复用的第一模拟全息图像,并加载到数字微镜器件71,根据样品光束和第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品上;从样品10上衍射的衍射光束依次通过衍射导向反射镜91和衍射导向透镜92、分光镜93进入第一相机3的成像平面,参考光束通过分光镜93导入所述第一相机3的成像平面上;
通过第一相机3记录样品上衍射产生的衍射光束和参考光束发生干涉时产生的二维全息图像;
第一结构光是时分复用的,可生成多个不同的二维全息图像,利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内的三维折射率图像;
第二成像检测方法的步骤中含有:
通过第二激光器12产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
通过计算机模拟一系列时分复用的第二模拟全息图像,根据第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品上,激发样品10中的荧光分子,从样品10反射的荧光光束依次经过照明物镜75、照明反射镜74、照明透镜73、照明分束镜72、滤波器81、荧光导向反射镜82、第一荧光导向透镜83和第二荧光导向透镜84后进入第二相机4的成像平面;
通过第二相机4记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的多个二维荧光图像;
根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像。
通过本方法,可以分别获得样品的无标记三维折射率图像和三维荧光成像图像,而且具有出色的时空分辨率以及高分子特异性。
具体地,使用光学衍射层析模态和结构光照明荧光成像模态分别测量了隐孢子虫卵囊形态及内部结构的三维折射率分布和三维荧光图像。卵囊外面有一层薄的卵囊壁,内部有一个大的残留体和3个点状子孢子。由于光学衍射层析的轴向分辨率大于孢子的直径,从重建的三维折射率分布绘制的细胞的三维等值面,很难区分卵囊内的子孢子与周围的细胞质。结合光学衍射层析获得的三维折射率分布和结构光照明三维荧光图像,便清楚地显示了子孢子的位置和形态。根据此方法,可以有效区分隐孢子虫卵囊与其他寄生虫。
以上所述的具体实施例,对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的描述中,需要理解的是,指示方位或位置关系的术语为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中,需要说明的是,术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。此外,术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
此外,术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂,而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平,并不是表示该结构一定要完全水平,而是可以稍微倾斜。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,第一特征在第二特征之上或之下可以包括第一和第二特征直接接触,也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且,第一特征在第二特征之上、上方和上面包括第一特征在第二特征正上方和斜上方,或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征之下、下方和下面包括第一特征在第二特征正下方和斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
Claims (10)
1.一种微生物多模态成像系统,它具有光学衍射层析模态和结构光照明荧光成像模态,其特征在于,它包括:
激光器组,所述激光器组包括第一激光器(11)和第二激光器(12),所述第一激光器(11)适于产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束,所述第二激光器(12)适于产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
适于将射入的第一成像激光束分成参考光束和样品光束或通过射入的第二成像激光束的光纤分束器(2);
适于根据射入的样品光束和加载的第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品(10)上或根据射入的第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品(10)上的照明单元;
适于记录用所述第一结构光照射的样品(10)产生的衍射光束和所述参考光束发生干涉时产生的二维全息图像的第一相机(3);
适于利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内三维折射率图像的第一单元;
适于记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的二维荧光图像的第二相机(4);
适于根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像的第二单元。
2.根据权利要求1所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
还包括控制器(5),所述控制器(5)分别与所述第一激光器(11)和所述第二激光器(12)控制相连,所述控制器(5)适于控制所述第一激光器(11)和所述第二激光器(12)中的一个工作。
3.根据权利要求1所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
还包括合束器(6),所述合束器(6)的合束端口分别与所述第一激光器(11)和所述第二激光器(12)的出射端口相连,所述合束器(6)的出射端口与所述光纤分束器(2)的入射端口相连。
4.根据权利要求1所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
所述照明单元包括:
数字微镜器件(71),所述数字微镜器件(71)适于接收射入的样品光束和加载所述第一模拟全息图像以及生成样品光束照射第一模拟全息图像后产生的第一结构光或适于接收射入的第二成像激光束和加载第二模拟全息图像以及生成第二成像激光束照射第二模拟全息图像后产生的第二结构光;
将第一结构光或第二结构光照射至样品(10)上的照明光路。
5.根据权利要求4所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
所述照明光路包括沿光束路径方向依次设置的照明分束镜(72)、照明透镜(73)、照明反射镜(74)和照明物镜(75),第一结构光或第二结构光依次经过照明分束镜(72)、照明透镜(73)、照明反射镜(74)和照明物镜(75)后照射至样品(10)上。
6.根据权利要求5所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
还包括适于导向用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下反射的荧光光束的荧光光束导向光路;
所述荧光光束导向光路包括:
沿荧光光束路径方向依次设置的滤波器(81)、荧光导向反射镜(82)、第一荧光导向透镜(83)和第二荧光导向透镜(84),样品(10)反射的荧光光束依次经过照明物镜(75)、照明反射镜(74)、照明透镜(73)、照明分束镜(72)、滤波器(81)、荧光导向反射镜(82)、第一荧光导向透镜(83)和第二荧光导向透镜(84)后进入第二相机(4)的成像平面。
7.根据权利要求1所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
还包括适于用所述第一结构光照射的样品(10)产生的衍射光束和所述参考光束导入所述第一相机(3)的成像平面上的光学衍射层析光路。
8.根据权利要求7所述的微生物多模态成像系统,其特征在于,
所述光学衍射层析光路包括:
衍射光束导向光路,所述衍射光束导向光路用于导向衍射光束并沿衍射光束路径方向依次设置的衍射光束物镜(94)、衍射导向反射镜(91)和衍射导向透镜(92);
分光镜(93),所述分光镜(93)适于收集参考光束和衍射光束并将其导入所述第一相机(3)的成像平面上。
9.一种微生物多模态成像检测方法,其特征在于它包括在光学衍射层析模态下的第一成像检测方法和在结构光照明荧光成像模态的第二成像检测方法;其中,
第一成像检测方法的步骤中含有:
产生在光学衍射层析模态下的第一成像激光束;
将第一成像激光束分成参考光束和样品光束;
模拟第一模拟全息图像,根据样品光束和第一模拟全息图像生成相应的第一结构光并将所述第一结构光照射至样品上;
记录样品上衍射产生的衍射光束和参考光束发生干涉时产生的二维全息图像;
利用多个二维全息图像通过波恩近似和傅里叶变换算法得到样品内的三维折射率图像;
第二成像检测方法的步骤中含有:
产生在结构光照明荧光成像模态下的第二成像激光束;
根据第二成像激光束和加载的第二模拟全息图像生成第二结构光并将所述第二结构光照射至样品上;
记录用所述第二结构光照明的样品在不同轴向位置下的二维荧光图像;
根据多个二维荧光图像通过图像合成得到样品的三维荧光图像。
10.一种如权利要求9所述的微生物多模态成像检测方法,其特征在于,它基于如权利要求1至8中任一项所述的微生物多模态成像系统实现。
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