WO2004001402A1 - 生体分子解析装置 - Google Patents

Abstract

本発明の生体分子解析装置は、生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置であって、測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料の少なくとも一つの観察領域に対応する画像を取得する画像取得手段と、この画像取得手段で取得した画像上の任意の点を指定する指定手段と、この指定手段で指定された点に対応する試料上の点位置に測定点を継続的に一致するように配置する配置手段と、この配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情報に由来する信号を測定する測定手段と、この測定手段で測定した結果を解析する解析手段と、を具備している。

Description

明 細 書

生体分子解析装置

技術分野

本発明は、 試料内の複数の特定部位の統計的な性質や各部 位間の相互作用などを求める生体分子解析装置に関する。 背景技術

共 焦 点 走 査 型 光 学 顕 微 鏡 に 関 し て は 、 例 え ば 文 献 "Confocal Microscopy" T. Wilsoni ed.) Academic Dress (London)に解説力 Sある。 また、 主に生物試料を対象と した解 説と して、 文献" Handbook of Biological confocal Microscopy" J.B.Pawley(ed.) Plenum Press (New York)な ど力 Sある。 蛍光相 関分光法に関 しては、 例えば文献 "Fluorescence correlation spectroscopy" R.Rigler, E.S.Elson (eds.) Springer (Berlin) な どの解説がある。

1 9 9 0年代に入り 、 蛍光を用いた単一分子の検出 ■ ィ メ 一ジングに関する研究が急増 している。 例えば単一分子の検 出 法 と し て 、 文 献 P.M.Goodwin etc. ACC.Chem.Res. (1996), Vol.29, p607-613、 また蛍光相関分光法 （ F C S ) な どが挙げられる。 蛍光相関分光法では、 共焦点レーザー顕微 鏡の視野の中で蛍光標識したタ ンパク質や担体粒子を溶液中 に浮遊させ、 これらの微粒子のブラ ゥン運動に基づく 蛍光強 度のゆら ぎを解析して 自 己相関関数を求め、 対象とする微粒 子の数や大き さ などを推測する。 この技術については、 例え ば、 特表平 1 1 一 5 0 2 6 0 8 号や金城政孝 「蛋白質 核酸 酵素」 （1999) Vol.44, No.9, pi 431-1437 に論 じられている。 一方、 上記の共焦点走査型顕微鏡および蛍光相関分光法に 関 して、 い く つか特許出願がな されている。 例えば、 特開 200 1 - 1 943 03 号公報では、 レーザー光をシリ ン ド リ カル ' レ ンズに導き、 これによ り スポッ ト光ではないライ ン状に連続 した励起用の光ビームを形成して試料に照射する。 こ のライ ン状の光ビームは、 ガルバ ノ · ミ ラーによ る光走査によって シリ ン ドリ カル · レ ンズの垂直方向に移動 して、 試料の撮像 領域内全体を 2次元的に励起する。 試料からの蛍光信号は C C D の よ う な 2次元光検出器で画像化する。 こ の方法では、 シ リ ン ドリ カル ■ レ ンズの走查速度よ り 遅い並進拡散速度を 有する よ う な分子のみが励起されて画像上に蛍光が表示され る。

また、 特開平 08 -43 739 号公報、 特開 2000- 98245 号公報で は、 走查型光学顕微鏡において、 多重染色された試料からの 蛍光をそれぞれグ レーティ ング、 プリ ズムによ り 分光 し、 複 数の光検出器によ り 成分波長毎に検出を行な う。

特開平 08 - 068694 号公報では、 光ファイバ一を、 液体試料 を収容する反応容器中に侵入させる こ と によ り 、 空間的に離 れた部位から蛍光相関解析を行な う。 マルチプレ タ ス処理に よ り 1 本の光ビームを複数に分離する こ と によ り 、 複数の反 応容器から別々 の蛍光強度を検出する こ と が開示されている 特開平 09 - 1 1 3448 号公報では、 複数個の反応容器をラ イ ン 状に並べて、 全ての反応容器を通過する よ う に 1 本の レーザ 一光を照射 し、 各反応容器内の手前に集光レ ンズを配置する こ と で全ての容器に 1 個の焦点を生じさせて、 各反応容器内 の試料について同時に蛍光相関解析を行な う 。

特開平 1 0 - 206742 号公報では、 レーザー走查型共焦点光学 顕微鏡において、 2つの独立した走査光学系によ って、 異な る時間の観察画像を取得し、 画像を重ねた と きの位置移動に 基づいて標本の動的特性を求める。

従来行なわれている蛍光相関分光法では、 視野内に存在す る蛍光分子からの蛍光強度のゆ らぎを観測 し、 これに基づい て時系列信号を得て、 自 己相関関数を求める。 この場合、 視 野内に存在する蛍光分子が 1種類のみであれば、 得られた蛍 光強度のゆら ぎをそのまま解析する こ と によ り 、 蛍光分子の 並進拡散速度な どの情報を得る こ とができ る。 また、 これら 蛍光分子が移動 した り 、 運動速度を変えた り しても、 これら の変化を統計的に捉えるこ とができ る。 発光波長の異なる 2 種類以上の蛍光分子が試料内に存在する場合は、 波長分離を 行な う こ と によ り 、 それぞれの蛍光分子の 自 己相関や相互相 関を求める こ と ができ る。 しかし、 同一視野内に限定されて しま う。

実際の生体細胞な どを観測しょ う とする場合、 細胞内外、 細胞核内外での所望の分子の挙動を リ アルタイ ムで観察する こ とや、 細胞内のシグナル伝達や物質輸送、 細胞分裂な どの 事象について経時的な変化や局在情報を得る こ と が必要と さ れる。 従来の蛍光相関分光法では、 分子の集団と しての状態 変化や、 挙動については捉える こ とができ るが、 細胞内外の 所望の部位の状態変化などについて、 ダイナミ ック に測定す る こ とは不可能であった。 本発明の 目的は、 対象となる試料の多様な動きや変化を捉 える こ と ができ る生体分子解析装置を提供する こ とにある。 発明の開示

( 1 ) 本発明の生体分子解析装置は、 生体分子の動的挙動 を解析する生体分子解析装置であって、 測定可能な状態に保 持された生体分子を含む生物学的試料の少な く と も一つの観 察領域に対応する画像を取得する画像取得手段と 、 この画像 取得手段で取得した画像上の任意の点を指定する指定手段と この指定手段で指定された点に対応する試料上の点位置に測 定点を継続的に一致する よ う に配置する配置手段 と、 この配 置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情報に由来 する信号を測定する測定手段と 、 この測定手段で測定した結 果を解析する解析手段と、 を具備 している。

( 2 ) 本発明の生体分子解析装置は上記 （ 1 ) に記載の装 置であ り 、 かつ前記画像取得手段で取得する商像は 3 次元領 域を含む画像であ り 、

前記配置手段は、 測定点を 3 次元上の任意の位置に配置す る。

( 3 ) 本発明の生体分子解析装置は上記 （ 1 ) に記載の装 置であ り 、 かつ前記測定手段は、 同一の測定点から時間の異 なる複数の信号を取得し、 前記解析手段は、 前記測定点間の 出力を比較 し演算する。

( 4 ) 本発明の生体分子解析装置は上記 （ 1 ) に記載の装 置であ り 、 かつ前記測定手段は、 光学的信号の強度を測定す る。 ( 5 ) 本発明 の生体分子解析装置は上記 （ 1 ) ま た は ( 2 ) に記載の装置であ り 、 かつ前記解析手段は、 指定され た点が属する試料上の成分に応 じて適切な動的情報に関する 演算式を用いて演算する。

( 6 ) 本発明の生体分子解析装置は上記 （ 1 ) 乃至 （ 5 ) のいずれかに記載の装置であ り 、 かつ前記指定手段は、 任意 の 2 以上の点を指定可能に構成され、 前記配置手段及び前記 測定手段は、 指定された 2以上の点のそれぞれにおいて独立 して機能し、 前記解析手段は、 前記 2 以上の点のそれぞれか ら得られた測定結果を比較可能に出力する。

図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の基本構成を示す図。

図 2 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の走査光学系の基本構成を示す図。

図 3 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の走査光学系の具体的な構成を示す図。

図 4 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の具体的な構成を示す図。

図 5 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る多数のレーザー 光源と多数の光検出器を用いた走査光学系の構成を示す図。

図 6 は、 本発明の第 2 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の構成を示す図。

図 7 は、 本発明の第 3 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の構成を示す図。 図 8 A， Bは、 本発明の第 4 の実施の形態に係る標準チヤ 一 ト の例を示す図。

図 9 は、 本発明の第 4 の実施の形態に係る入力電圧に対す る走査角の動的特性と静的特性を示す図。

図 1 0 は、 本発明の第 4 の実施の形態に係る画像メ モ リ 中 に記録される画像を表す図。

発明を実施するための最良の形態

以下、 本発明の実施の形態を図面を参照 して説明する。 図 1 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の基本構成を示す図であ る。 本発明では、 従来から用いら れている レーザー走査型共焦点光学顕.微鏡をベースに してい る。 本第 1 の実施の形態では、 微小な測定領域を レーザー共 焦点光学系によ り 実現する。 微小な共焦点領域の形成のため に、 N A (開口数） 1 . 0程度の大き さの開 口数の対物 レ ン ズを用いる。 これによ り 得られる共焦点領域は、 直径 0 . 6 μ ηι程度、 長さ 2 μ ΐη程度の大き さの略円筒状と なる。

図 1 では、 二つの照明系 S 1 a , S 2 a 、 二つの走査系 S l b， S 2 b 、 及ぴ二つの検出系 S l c， S 2 c を備えてい る。 照明系 S 1 a， S 2 a は、 それぞれレーザー光源 1 a， l b 、 及び第 1 レンズ 2 a ， 2 b 力 らなる。 走査系 S l b，

5 2 b は、 それぞれサーポ方式のガルバノ ズキヤナー （ガル ノ ノ ミ ラー） 6 a , 6 b 力 らな る。 ガルノ ノ スキャナー 6 a

6 b は、 互いに走查方向が垂直方向になる よ う に配置され、 各々 がレーザー光を X軸、 Y軸走査する X軸走査スキャナと Y軸走査ス キャナからなる。 検出系 S l c， S 2 c は、 それ ぞれ受光用 レ ンズ 9 a , 9 b 、 受光用 ピンホール 8 a， 8 b 及び光検出器 1 0 a , 1 0 b 力 らなる。

まず、 ス テージ S T上に測定可能な状態で保持された生物 学的試料 （細胞） S の画像を取得するために、 第 1 の照明系 S l a 、 第 1 の走査系 S i b 、 及び第 1 の検出系 S i c を用 いる。 レーザー光源 1 a から照射されたレーザー光は、 第 1 レンズ 2 a 、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 7 a 、 及びミ ラー 1 0 1 を介して、 ガルバノ スキャナー 6 a に達する。 レーザー光は ガルバノ ス キャナー 6 a で X Y走査され、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラー 1 0 0 を透過 し、 対物レ ンズ 5 を介してス テージ S T上 の試料 S を照明する。

試料 S からの反射光および蛍光は、 対物レンズ 5 を介 して ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 1 0 0 を透過 し、 ガルバ ノ ス キ ャ ナー 6 a 、 ミ ラー 1 0 1 、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 7 a 、 ミ ラー 9 l a 、 受光用 レンズ 9 a 、 及ぴ受光用 ピンホール 8 a を介し て光検出器 1 0 a で受光される。 光検出器 1 0 a は、 光学的 信号の強度を測定する。 光学的信号は、 画像処理装置にてコ ン ト ラ ス ト 向上、 輪郭強調などの画像処理が行なわれた後、 コ ン ピューターに導かれ、 T Vモニター上で 2次元画像と な る。

次に、 試料 S内の蛍光分子の 自 己相関関数を取得するため に、 第 2 の照明系 S 2 a 、 第 2 の走査系 S 2 b 、 及び第 2 の 検出系 S 2 c を用いる。 レーザー光源 1 b から照射されたレ 一ザ一光は、 第 1 レ ンズ 2 b及びダイ ク ロイ ック ミ ラー 7 b を介 して、 ガルバノ ス キ ャ ナー 6 b に達する。 レーザー光は ガノレノ ノ ス キ ャ ナー 6 b で X Y走査され、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ ー 1 0 0 で反射され、 対物 レンズ 5 を介 してス テージ S T 上の試料 S を照明する。 これによ り 、 レーザー光が微小な測 定領域に存在する試料 S 内の蛍光分子を励起 し、 蛍光信号

(フ オ ト ンパルス） が得られる。

得られた蛍光信号、 すなわち蛍光分子からの蛍光の強度ゆ らぎは、 対物レ ンズ 5 を介してダイ ク ロイ ッ ク ミ ラー 1 0 0 で反射し、 ガルバ ノ ス キ ャ ナー 6 b 、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 7 b 、 ミ ラー 9 1 b 、 受光用 レ ンズ 9 b 、 及び受光用 ピ ンホ ール 8 b を介 して光検出器 1 0 b で受光される。 蛍光信号は. 光検出器 1 0 b で光電流パルス に変換され、 信号処理装置に 導かれて波形整形、 2値化処理な どが行なわれ、 コ ン ビユー タ ー （相関解析装置） によ り 蛍光相関分光法 （ F C S ) で 自 己相関関数、 相互相関関数な どが求め られる。 こ こで得られ た自 己相関関数から、 蛍光分子の並進拡散運動の速度な どの 統計的な性質が求め られる。 なお、 レーザー光を X Y走査す るために、 ガ バノ スキャナーに限らず、 A Οモジユ レータ 一 ( A O D ) やポリ ゴン鏡などを用いても よい。

図 2 は、 図 1 に示 した生体分子解析装置の照明光学系、 走 査光学系、 及び検出光学系の基本構成を示す図である。 図 2 において図 1 と 同一な部分には同符号を付してある。

レーザー光源 1 b から出射した レーザー光は、 第 1 レ ンズ

2 b によ り 合焦 （フ ォ ーカ ス ） される。 合焦位置には、 照明 光用 ピンホール 3 b が配置されている。 また、 第 2 レ ンズ 4 の フ ォ ーカ ス位置に照明光用 ピンホール 3 b の位置を合わせ ている。 第 2 レ ンズ 4 は、 対物 レ ンズ 5 までコ リ メ ー ト 光 (平行光） を導く 。 また、 対物レ ンズ 5 の焦点位置に試料面 を合わせている。

レーザー光源 1 b から照射されたレーザー光は、 第 1 レ ン ズ 2 b と 照明光用ピンホール 3 b を介してダイ ク ロイ ッ ク ミ ラー 7 b を透過 し、 第 2 レ ンズ 4 を介 して、 X軸走査スキヤ ナ 6 1 と Y軸走査ス キャナ 6 2 に達する。 X軸走査ス キャ ナ 6 1 と Y軸走査ス キ ャ ナ 6 2 は、 互いに走査方向が直交して いる。 レーザー光は、 X軸走査ス キャ ナ 6 1 と Y軸走査ス キ ャナ 6 2 によ り 、 それぞれ X軸走查及ぴ Y軸走査され、 試料 S面内で 2 次元走査される。

試料 S 内の蛍光分子からの蛍光信号は、 照射された レーザ 一光と 同 じ光路を通って、 第 2 レ ンズ 4 と照明光用ピンホー ル 3 b の間に配置されたダイ ク ロイ ツク ミ ラー 7 b で反射さ れる。 こ の反射光は、 第 2 レ ンズ 4 の焦点位置に配置された 受光用 ピ ンホール 8 b を通過 して、 受光用 レ ンズ 9 b に導か れる。 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラー 7 b は、 照射された レーザー光 (励起光） を透過し、 蛍光分子から発せられた蛍光を反射さ せるスぺク トル特性を持っている。 受光用 レ ンズ 9 b の焦点 位置に受光用 ピ ンホール 8 b が位置している。 蛍光は、 受光 用 レンズ 9 b を通って光検出器 （受光器） 1 0 b に到達する 光検出器 1 O b と しては、 画像取得用の C C Dカ メ ラなどの 2次元光検出器を用いる。 蛍光の強度ゆらぎの測定には、 A P D (ァノ ラ ンシェ フ オ ト ダイオー ド） 、 あるいは光電子増 倍管などを用いる。 図 3 は、 図 1 に示 した生体分子解析装置の走査光学系の具 体的な構成を示す図である。 図 3 において図 2 と 同一な部分 には同符号を付してある。 以下、 レーザー光の 3 次元走査に ついて図 3 を基に説明する。

図 3 の光学系は、 光軸方向 （ Z軸方向） の フ ォ ーカ ス移動 を実施でき る よ う構築されている。 図 3 では、 図 2 における 照明光用 ピンホール 3 b とダイ ク ロイ ック ミ ラー 7 b と の間 に可動レ ンズ 1 1 が配置されている。 こ の可動レ ンズ 1 1 を 光軸方向に適量移動させるこ と によ り 、 レーザー光源 1 の 試料面での フ ォ ーカ ス位置を光軸方向 （ Z軸方向） に変化さ せる こ と ができ る。 例えば、 可動レンズ 1 1 を a の方向へ移 動させる と、 試料面でのフ ォーカス位置は a ' と なる。 逆に 可動レ ンズを c の方向へ移動させる と 、 試料面でのフォー力 ス位置は c ' と なる。

このよ う に可動レ ンズ 1 1 を移動させる こ と によ り 、 可動 レンズ 1 1 を通過した光束が可動レンズ 1 1 の移動量に応じ た拡が り 角を持つよ う になる。 これによ り 、 対物レンズ 5 を 通過 した照射レーザー光のフ ォーカ ス位置を光軸方向に適量 移動させる こ と ができ る。 さ らに、 3 次元走査を行な う こ と ができ る と共に、 試料内の 3次元的位置に対して、 照射レー ザ一光の フ ォーカ スを試料の深さ方向に合わせられ、 深さ方 向に分布 した所望の蛍光分子を励起する こ とができ る。

なお、 光軸方向 （ Z軸方向） の フ ォ ーカ ス移動は、 対物レ ンズ 5 を光軸方向に移動させる こ とでも実施でき る。

図 4 は、 本発明の第 1 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の具体的な構成を示す図である。 以下、 生体分子解析装置 の動作について図 4 を基に説明する。 こ の装置では、 レーザ 一走査型共焦点光学顕微鏡によ り 試料の 2 次元、 あるいは 3 次元画像を T Vモニ タ ー上に得る。 2次元画像を得るための X Yスキャナー 2 1 と して、 例えばガルバノ スキャナーを用 いて X Y走査を行な う。 これを、 例えば第一走査系 P 1 とす る。 も う 一方の X Yスキャナー 2 2 と して第一走查系 P 1 と 同 じガルバ ノ ス キ ャ ナーを用い、 これを例えば第二走查系 P 2 とする。

顕微鏡による観察画像を取得する場合、 例えば第一走査系 P 1 の X Y走査によ り 、 細胞内に レーザー光を照射し、 反射 光、 蛍光を光検出器 1 0 a で受光 し、 光強度信号を電気信号 に変換し、 信号処理装置 2 8 で波形整形した後、 画像処理装 置 2 9 で 2 次元画像を生成し、 T Vモニタ ー 3 0 上に出力さ せる。 また、 上述した可動レ ンズまたは対物レ ンズ 5 を光軸 方向に移動させる こ と によ り 、 レーザー光のフォーカ ス位置 を光軸方向に沿って上下させる こ とができ る。 これによ り 、 3 次元画像を T Vモニター 3 0上に生成させる こ とができ る 2 つの X Yス キ ャ ナー 2 1， 2 2 は、 互レヽに直交する方向 に走査される よ う に配置されてお り 、 コ ン ピューター 2 0 に よ って制御される X Yス キャ ナー駆動装置 2 3 , 2 4 によ り 走查運動が精確に制御される。 X Yス キャ ナー駆動装置 2 3 2 4 には走査位置検出機構 2 5 が装備されてお り 、 走査位置 が リ アルタ イ ム で精度良く 検知され、 コ ン ピュ ー タ ー 2 0 に フィ ー ドバ ック制御される。 これによ り 、 試料 S 内をラ ンダ ム にス キ ャ ン して、 試料 S 内の所望の位置に存在する蛍光分 子からの蛍光信号を 2つ同時に測定する こ と ができ る。 なお コ ン ピュ ー タ ー 2 0 が X Yス キャ ナー駆動装置 2 3， 2 4 を 制御する こ と によ り 、 試料 S 内の同一の位置から時間の異な る複数の蛍光信号を取得する こ と もでき る。

励起光と して の レーザーには、 波長 488nm の アルゴン レ 一ザ一、 633nm の He · Ne レーザーを用いる。 試料 S の細胞 内の所望の箇所を標識する蛍光色素は、 ローダミ ン · グ リ ー ン（RhG)、 サイ フ ァイ ヴ（Cy5)を用いる。 ローダミ ン · グ リ ー ン（RhG)は、 レーザー光源 1 a からの波長 488nm のアルゴン レーザーで励起する。 サイ フ ァ イ ヴ（Cy5)は、 レーザー光源 1 b からの波長 633nmの He - Ne レーザーで励起する。 所望 の箇所の蛍光色素分子からの蛍光は励起光と 同 じ光路を通 り それぞれの色素の発光波長に合わせて光学的に調整されたダ ィ ク ロイ ツ ク ミ ラー 2 6 , 2 7 によ り 、 入射光路から分離さ れて光検出器 1 0 a， 1 O b で受光される。

光検出器 1 0 a , 1 0 b に入射した光強度信号は電気信号 に変換され、 信号処理装置 2 8 で波形整形され、 on-off の 2 値化パルス に変換されて、 コ ン ピューター 2 0 に導かれる。 コ ン ピューター 2 0 では、 入力された 2値化パルス信号に対 して相関演算が行なわれ、 自 己相関関数が求め られる。 さ ら に、 得られた自 己相関関数から、 蛍光分子の並進拡散速度や 測定領域中の蛍光分子の数の変化などが求め られる。 光検出 器 1 0 a， 1 0 b に入射する光強度信号が比較的大きい場合 は、 光検出器 1 0 a , 1 0 b から出力 される電気信号は時系 列信号と なる。 この場合は、 その時系列信号を信号処理装置 2 8 で A Z D変換し、 デジタル信号に変換した後、 波形整形 を行ない、 先と 同様に 2値化パルス信号に変換する。 この 2 値化パルス信号をコ ンピューター 2 0 に導く こ と によって相 関演算が行なわれ、 自 己相関関数が求められる。 あるいは、 デジタル化された時系列信号をそのままコ ンピューター 2 0 に導いて相関演算を行なっても よい。

観察画像上でのス キャ ンニングポィ ン ト の指定は、 以下の よ う に行な う。 観察者は、 T Vモニター 3 0 上の観察画像を 見ながら所望のポイ ン ト の蛍光分子からの発光を見出 し、 こ の点で X Yス キャナー 2 1 , 2 2 の走査ミ ラーのスキャ ンを 停止する よ う に、 コ ンピュータ 2 0 に付属の指定手段、 例え ば、 キーボー ドやマ ウスポイ ンタ等によって画像上のポイ ン ト を指定して走査ミ ラー駆動機構 2 5 に位置情報を伝える こ と によって、 光軸が調整される。 これによ り 、 試料 Sの 3次 元上の任意の位置に測定点が配置される。 このと きの走查ミ ラーの角度は走査位置検出機構 2 5 によって精度よ く 求め ら れる。

図 5 は、 多数の照明光学系と多数の検出光学系を用いた構 成を示す図である。 以下、 多数の レーザー光源と多数の光検 出器を用いた測定について図 5 を基に説明する。 図 5 の構成 は、 基本的に 1 走査光学系、 1 検出光学系の場合と同様であ る。 図 5 に示すよ う に、 三つの レーザー光源 l a ， l b , 1 c と 四つの光検出器 1 0 a , 1 0 b , 1 0 c , 1 0 d を備え てレ、る。 レーザー光源 1 a は波長 488nm のァノレゴン レーザー、 レ 一ザ一光源 1 b は波長 514.5nm のァノレゴン レーザー、 レー ザ一光源 1 c は波長 632.8nm のヘ リ ゥ ムネ オン レーザーか らなる。 試料 S への蛍光色素 と しては、 ロ ーダミ ング リ ー ン (RhG)s テ ト ラ メ チルロ ーダ ミ ン（TMR)、 サイ フ ァ イ ヴ（Cy5) を用いる。 波長 488nm のアルゴ ン レーザーによ り ロ ーダ ミ ング リ ー ン（RhG)を励起する。 波長 514.5nm のァノレゴン レー ザ一に よ り テ ト ラ メ チルロ ーダ ミ ン（TMR)を励起する。 波長 632.8nm の ヘ リ ゥ ム ネ オ ン レー ザー に よ り サイ フ ア イ ヴ (Cy5)を励起する。 各蛍光色素は細胞内の所望の 目 的分子、 例えば D N Aを構成する塩基やコ レス テ ロ ールを標識する。 これによ り 細胞内に取 り 込まれた と き のコ レステ ロ一ノレの凝 集な どの構造変化に関する情報を得る。

レーザー光源 1 a から照射された レーザー光は、 ダイ ク 口 イ ツ ク ミ ラ ー 3 1 a を透過 し、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラー 2 6 で 反射され、 X Yス キ ャ ナー 2 1 と X Yス キ ャ ナー 2 2 に達す る。 レーザー光源 1 b から照射さ れた レーザー光は、 ダイ ク 口イ ツク ミ ラー 3 l b で反射され、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ ー 3 l a で反射され、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 2 6 で反射され、 X Yス キャ ナー 2 2 と X Yス キャ ナー 2 1 に達する。 レーザー 光源 1 c か ら照射された レーザー光は、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ 一 3 1 c で反射され、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラー 3 1 b を透過 し ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラー 3 1 a で反射され、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 2 6 で反射され、 X Yス キ ャ ナー 2 1 と X Yス キ ャ ナー 2 2 に達する。 レーザー光は、 X Yス キャ ナー 2 1 と X Yス キヤナー 2 2 によ り 、 対物レンズ 5 を介 して試料 S面内で走 査される。

試料 S からの反射光おょぴ蛍光は、 対物レ ンズ 5、 X Yス キヤナー 2 1 と X Yスキャナー 2 2 を介 してダイ ク ロ イ ツク ミ ラー 2 6 を透過し、 ミ ラー 3 2 で反射され、 ミ ラー 3 3 で 反射される。 ミ ラー 3 3 で反射されダイ ク ロイ ツク ミ ラー 3 4 a で反射された前記反射光おょぴ蛍光は、 レンズ 3 5 a 、 受光用 ピ ンホール 8 a 、 及び受光用 レ ンズ 9 a を介して、 光 検出器 1 0 a に受光される。 同様に、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 3 4 a を透過 し、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 3 4 b， 3 4 c , 3 4 d で反射された前記反射光および蛍光は、 それぞれレンズ 3 5 b， 3 5 c , 3 5 d、 受光用 ピンホーノレ 8 b , 8 c， 8 d 、 及ぴ受光用 レ ンズ 9 b ， 9 c , 9 d を介して、 光検出器 1 0 b , 1 0 c , 1 0 d に受光される。

図 5 では、 レーザー光源のひとつを走査光学系、 観察光学 系 と して共有している。 これはさ らに レーザー光源を 1個増 やして 4本と して、 その う ち 1本を観察光学系と して試料画 像の取得に用い、 他の 3本を蛍光励起用に用いても良い。 ま た レーザー光源はこれに限る こ と なく 、 5本以上と しても良 い

こ の よ う に、 2 個の X Y ス キャ ナー 2 1 ， 2 2 を用 いて、 それぞれ互いに直交する方向に走査を行な う。 本第 1 の実施 の形態では X Y ス キ ャ ナー 2個を各レーザー光源 1 a ， 1 b 1 c で共有 して、 同 じ方向に レーザー光を走査する構成にな つているが、 これに限る こ と な く 、 X Yスキャナーを 4個、 あるいは 6 個用いて、 それぞれの レーザー光について、 別々 な方向に走査 しても良い。

また、 走査位置検出機構によ り X Yスキャナーの角度を検 知し、 その位置で X Yスキャナーを固定して、 試料の 目 的分 子の位置に レーザー光を照射し、 目的分子からの蛍光信号を 検出する。 蛍光分子から発せられる蛍光信号をそれぞれ別々 の光検出器 1 0 a , 1 0 b , 1 0 c , 1 0 d で受光する。 得 られた時系列パルス信号を信号処理装置で波形整形、 2値化 処理を行なって、 コ ンピューターに導き、 相関演算を行なつ て、 それぞれ自 己相関関数を求める。

本第 1 の実施の形態によ り 、 同一細胞内の異なる蛋白質な どの 目的分子の挙動を同時に リ アルタイムで捉えるこ と がで き る。 また、 異なる 目的分子の相互相関についても情報を得 る こ とができ る。

図 6 は、 本発明の第 2 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の構成を示す図である。 図 6 において図 1 と 同一な部分に は同符号を付してある。

図 6 では、 四つの照明系 S I l a , S 1 2 a 、 S 2 2 a _s S 3 2 a 、 三つの走査系 S l l b , S 1 2 b 、 S 1 3 b 、 及 び四つの検出系 S l l c ， S 1 2 c 、 S 2 2 c 、 S 3 2 c を 備えている。 照明系 S l l a , S 1 2 a 、 S 2 2 a 、 S 3 2 a は、 それぞれレーザー光源 1 1 a ， l l b 、 2 1 b 、 3 1 b及ぴ第 1 レンズ 1 2 a 、 1 2 b 、 2 2 b 、 3 2 b 力、らなる 走査系 S I l b , S 1 2 b 、 S I 3 b は、 それぞれサーボ方 式のガルバノ ス キャナー （ガルバノ ミ ラー） 1 6 a ， 1 6 b 1 6 c 力 ら なる。 ガノレノ ノ ス キャ ナー 1 6 a， 1 6 b、 1 6 c は、 各々 が X軸走査スキャナ と Y軸走查ス キャナからなる， 検出系 S l l c , S 1 2 c、 S 2 2 c、 S 3 2 c は、 それぞ れ受光用 レンズ 1 9 a , 1 9 b、 2 9 b、 3 9 b 、 受光用 ピ ンホール 1 8 a， 1 8 b、 2 8 b、 3 8 b及び光検出器 1 1 0 a , 1 1 0 b、 2 1 0 b、 3 1 0 b 力 らなる。

まず、 ステージ S T上に測定可能な状態で保持された生物 学的試料 （細胞） S の画像を取得するために、 第 1 の照明系 S 1 1 a 第 1 の走査系 S l l b 、 及び第 1 の検出系 S 1 1 c を用いる。 レーザー光源 1 1 a から照射された レーザー光 は、 第 1 レンズ 1 2 a 及ぴダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 7 a を介 して、 ガルバノ スキャナー 1 6 a に達する。 レーザー光は、 ガノレバノ ス キャナー 1 6 a で X Y走査され、 ダイ ク ロ イ ツク ミ ラー 1 0 2 で反射 し、 ダイ ク ロ イ ツク ミ ラー 1 0 3 を透過 して、 対物 レンズ 5 を介してステージ S T上の試料 S を照明 する。

試料 Sからの反射光おょぴ蛍光は、 対物 レンズ 5 を介して ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 0 3 を透過し、 ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ 一 1 0 2 で反射して、 ガルノ ノ ス キャナー 1 6 b 、 ダイ ク 口 イ ツク ミ ラー 1 7 a 、 ミ ラー 1 9 1 a 、 受光用 レンズ 1 9 a 及び受光用 ピンホール 1 8 a を介 して光検出器 1 1 0 a で受 光される。 光検出器 1 1 0 a は、 光学的信号の強度を測定す る。 光学的信号は、 画像処理装置にてコ ン ト ラス ト向上、 輪 郭強調な どの画像処理が行なわれた後、 コ ン ピューターに導 かれ、 T Vモニタ ー上で 2次元画像と なる。 次に、 試料 S 内の蛍光分子の 自 己相関関数を取得するため に、 例えば第 2 の照明系 S 1 2 a 、 第 2 の走査系 S I 2 b、 及び第 2 の検出系 S 1 2 c を用いる。 レーザー光源 1 1 b か ら照射された レーザー光は、 第 1 レンズ 1 2 b 、 ダイ ク ロイ ック ミ ラー 1 7 b、 及びミ ラー 1 0 4 を介して、 ガルノ ノ ス キヤナー 1 6 b に達する。 レーザー光は、 ガルバノ ス キ ャ ナ 一 1 6 b で X Y走査され、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 0 3 で反 射され、 対物レ ンズ 5 を介 してス テージ S T上の試料 S を照 明する。 これによ り 、 第 1 の実施の形態と 同様に レーザー光 が微小な測定領域に存在する試料 S内の蛍光分子を励起し、 蛍光信号 （フ オ ト ンパルス ） が得られる。

得られた蛍光信号、 すなわち蛍光分子からの蛍光の強度ゆ らぎは、 対物レンズ 5 を介 してダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 0 3 で反射し、 ガルバノ ス キ ャ ナー 1 6 b 、 ミ ラー 1 0 4、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 1 7 b 、. ミ ラー 1 9 l b 、 受光用レ ンズ 1 9 b 、 及び受光用ピンホール 1 8 b を介 して光検出器 1 1 0 b で受光される。 蛍光信号は、 光検出器 1 1 0 b で光電流パ ルス に変換され、 信号処理装置に導かれて波形整形、 2値化 処理などが行なわれ、 コ ン ピューター （相関解析装置） によ り 蛍光相関分光法 （ F C S ) で自 己相関関数、 相互相関関数 な どが求め られる。 こ こ で得られた自 己相関関数から、 蛍光 分子の並進拡散運動の速度などの統計的な性質が求め られる 上記の例では、 蛍光分子の相関関数を取得するために、 第 2 の照明系 S 1 2 a 、 第 2 の走査系 S I 2 b 、 及び第 2 の検 出系 S 1 2 c の組み合わせを用いたが、 その他、 第 3 の照明 系 S 2 2 a 、 第 2 の走査系 S I 2 b 、 及び第 3 の検出系 S 2 2 c の組み合わせと、 第 4 の照明系 S 3 2 a 、 第 3 の走査系 S 1 3 b 、 及ぴ第 4 の検出系 S 3 2 c の組み合わせを用いる こ と ができ る。 すなわち、 各光学系によ り 個別に、 試料内の 所望の異なる部位に存在する蛍光分子からの 自 己相関関数ま たは相互相関関数の取得を行な う こ と ができ る。 各ガルバノ ス キ ャ ナー 1 6 a ， 1 6 b、 1 6 c は互いに独立 して動作し 試料内の異なる複数部位に レーザー光ス ポ ッ ト を集光させる あるレヽは、 各ガノレノ ノ スキヤナー 1 6 a , 1 6 b、 1 6 c を 互いに連動させて、 試料内の所望の一部位に同時にレーザー 光スポッ ト を集光させる こ と もでき る。

本第 2 の実施の形態では、 蛍光色素を 1 種類と している。 例えばロ ーダミ ング リ ー ン（RhG)を用い、 レーザーはァル ゴ ンレーザー （波長 488nm) を用レヽる。 アルゴン レーザーの出 力光強度は例えば 1 0 m Wとする。 レーザーの出力光強度は 大き ければ大きいほど、 強く 蛍光色素を励起する こ とができ 強い蛍光を受光する こ とができ る。 しかし、 レーザーの出力 光強度が大きすぎる と、 バック グラ ウン ドノ イズが増大する と共に、 蛍光色素を褪色させて しま う こ と も ある。 したがつ て、 装置構成な どにも よるが、 1 0 m W程度の出力光強度が 適当である。

本第 2 の実施の形態によれば、 試料内の所望の異なる部位 に存在する蛍光分子からの蛍光の強度ゆら ぎを光検出器で受 光し、 相関解析装置に導く 。 これによ り 得られる 自 己相関関 数または相互相関関数から、 蛍光色素が付け られた細胞な ど の状態や大き さ な どを知る こ と ができ る。

図 7は、 本発明の第 3 の実施の形態に係る生体分子解析装 置の構成を示す図である。 図 7 において図 6 と 同一な部分に は同符号を付してある。

図 7では、 四つの走査系 S I l b , S 1 2 b 、 S 1 3 b、 S 1 4 b を備えている。 ス テージ S T上に測定可能な状態で 保持された生物学的試料 （細胞） Sの画像を取得する動作手 順は、 第 2 の実施の形態と 同様である。 また、 試料 S 内の蛍 光分子の 自 己相関関数を取得するために、 第 2 の照明系 S 1 2 a 、 第 2 の走查系 S 1 2 b 、 及び第 2 の検出系 S I 2 c を 用いた場合の動作手順も、 第 2 の実施の形態と同様である。

試料 S 内の蛍光分子の自 己相関関数を取得するために、 例 えば第 3 の照明系 S 2 2 a 、 第 4 の走査系 S 1 4 b、 及び第 3 の検出系 S 2 2 c を用いる。 レーザー光源 2 1 bから照射 されたレーザー光は、 第 1 レ ンズ 2 2 b及びダイ ク ロ イ ック ミ ラー 2 7 b を介して、 ガルバノ スキャナー 1 6 d に達する レーザー光は、 ガルバ ノ ス キ ャ ナー 1 6 d で X Y走査され、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 0 5 で反射され、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 1 0 2 、 ダイ ク ロイ ツク ミ ラー 1 0 3 、 及び対物レ ンズ 5 を介してス テージ S T上の試料 S を照明する。 これによ り 第 1 、 第 2 の実施の形態と 同様に レーザー光が微小な測定領 域に存在する試料 S 内の蛍光分子を励起し、 蛍光信号 （ フ ォ ト ンパルス ） が得られる。

得られた蛍光信号、 すなわち蛍光分子からの蛍光の強度ゆ らぎは、 対物レ ンズ 5 、 ダイ ク ロ イ ツク ミ ラー 1 0 3 、 及び ダイ ク ロ イ ツ ク ミ ラ ー 1 0 2 を介 してダイ ク ロイ ッ ク ミ ラー 1 0 5 で反射し、 ガノレノ ノ ス キ ャ ナー 1 6 d 、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー 2 7 b 、 ミ ラー 2 9 1 b 、 受光用 レ ンズ 2 9 b 、 及 ぴ受光用 ピ ンホール 2 8 b を介 して光検出器 2 1 0 b で受光 される。 また、 第 4 の照明系 S 3 2 a 、 第 3 の走査系 S I 3 b 、 及び第 4 の検出系 S 3 2 c を用いた場合、 レーザー光は ガルバノ ス キャナー 1 6 c で X Y走査される。

本第 3 の実施の形態では、 レーザー光源、 第 1 レンズ、 ダ ィ ク ロイ ツ ク ミ ラー、 ミ ラー、 受光用 レ ンズ、 受光用 ピ ンホ ール、 及ぴ光検出器の組み合わせから なる各光学系に対 して それぞれ一組のガルバノ ス キャ ナーを用いた構成をな してい る。 これ ら各光学系では、 レーザーの発振波長が異な り 、 ま たダイ ク ロ イ ッ ク ミ ラーの波長特性も異なる。

このよ う な構成にする こ と で、 各光学系に よ り 、 ほぼ同一 の集光位置に波長の異なる レーザー光を同時に集光させる こ と ができ 、 異なる蛍光色素から の蛍光を検出する こ と ができ る。 また、 各光学系に よ り 、 同一の対物 レンズを介 して試料 内の異な る部位に レーザー光を照射する こ と ができ る。 こ の よ う に、 各光学系にて、 独立して動作する ガルバノ ス キ ャ ナ 一で走査をする ため、 各光学系に よ り 異なる位置に レーザー 光が照射さ れる。 したがって、 試料内の複数の離散的な部位 に レーザー光スポッ ト を同時に、 またはタ イ ミ ングをず ら し て集光さ せる こ と ができ る。

なお、 レーザー光源、 第 1 レンズ、 ダイ ク ロイ ツ ク ミ ラー ミ ラ ー、 受光用 レンズ、 受光用 ピ ンホール、 及び光検出器の 組み合わせからなる一つの光学系に対して、 ガルバノ ス キヤ ナ一で構成される走査系を 2組以上用いても よい。

本第 3 の実施の形態によれば、 試料内の所望の異なる部位 に、 同時にまたはタイ ミ ングをずら して、 単一または複数の 異なる波長からなる レーザー光をまたは複数の異なる波長の レーザー光を複数本照射し、 蛍光分子からの蛍光を取得 し、 画像と して記緑、 観察する と共に、 蛍光の強度ゆ らぎから、 演算によ り 自 己相関関数または相互相関関数などを取得する こ と ができ る。

以下、 第 1 〜 3 の実施の形態に示 した生体分子解析装置に おいて動的特性と静的特性を補正する方法について説明する レーザー顕微鏡で得た画像に表示される任意の点を選択 し て蛍光相関分光法 （ F C S ) によ り 一分子の蛍光分析を行な う場合、 レーザー顕微鏡で得られる画像は走査手段を高速で 駆動 しなが ら描画されている。 このため、 走査手段は同 じ制 御信号を入力 して静止させても、 一般に異なる位置に停止す る。 特に、 ガルバノ ス キャナーのよ う な機械的な走査手段で は、 その影響は顕著である。 よ って、 レーザー顕微鏡で得た 画像に表示される 目標に対 して正 しく レーザー光を静止させ るには、 何らかの補正手段が必要である。

1 ) 標準チャー ト を用いる方法

図 8 A， B は、 標準チャー ト の例を示す図であ り 、 図 8 A は格子模様、 図 8 B はラ ンダム模様である。 この方法では、 標準チャー ト を用意 し、 動的特性が静的特性と同 じになる く らい低速で走査を行ない画像データ を取得し、 通常の高速走 査で得た画像データ と比較 して補正データ を得る。

こ の方法を実現する構成要素は、 通常の高速走査で得た画 像を記録する第 1 のメ モ リ 、 低速走査で得た画像を記録する 第 2 のメ モ リ 、 第 1 のメ モ リ と第 2 のメ モ リ に記録された二 つの画像を比較する演算装置、 演算装置での比較結果 （補正 データ） を記録する第 3 のメ モ リ 、 レーザー顕微鏡で得た画 像上で指定された位置を補正データ を用いて制御データ に変 換する補正装置からなる。 なお、 通常これらメ モ リ 、 演算装 置、 補正装置は全てコ ンピュータ で実現する。

以下、 標準チャー ト を用いる方法の手順を説明する。 標準 チャー ト を構成する標準画像データは、 図 8 A , B に示すよ う な格子データ、 ラ ンダムデータ などが考えられる。 まず、 通常の高速走査で画像を取得して第 1 のメモ リ に記 録する。 そ して、 低速走査で画像を取得して第 2 のメ モ リ に 記録する。 次に演算装置で、 高速走査で得た画像と低速走査 で得た画像と の位置のずれ或いは歪みを比較し、 その比較結 果を第 3 のメ モ リ に記録する。 通常こ の比較には相関演算が 用い られる。 次に演算装置で、 高速走査で得た画像の制御信 号に対する低速走査で得た画像の制御信号の補正データ を作 成する。 通常、 この補正データは走査の角度を制御する電圧 値である。 なお、 こ の捕正データ は、 高速走査のス ピー ド毎 走査角度毎に作成する。

図 9 は、 入力電圧に対する走査角の動的特性と静的特性を 示す図である。 以下、 図 9 を用いて上記の方法をよ り 具体的 に説明する。 レーザー顕微鏡で高速走査を行なっている場合 電圧がい く つの と き に走査角 （画像上での位置） がどこか特 定するのは難しい。 実際には、 電圧を軸と して画像上での座 標が決ま る。

そこで、 まず低速走査で得た画像の中で、 図 9 に示すよ う に観測点 c を選択して電圧 b を求める。 次に、 高速走査で得 た画像の中から この観測点 c (電圧 a ) を見出し、 低速走査 で得た画像と の位置の違いを求める。 この差が静的特性と動 的特性と の差である。 標準チャー ト を用いて画像全域に渡り この補正データ を設定しておく こ と によ り 、 任意の位置で補 正ができ る。

実際に画像中で観測点を指定する場合、 高速走査で得た画 像上で観測点を指定し、 レーザー光を観測点に停止させる場 合は補正データ を用いて電圧 b を入力する。 このよ う に して レーザー顕微鏡で得た画像上で指定した任意の位置に、 レー ザ一光を正確に固定でき F C S測定を行な う こ と ができ る。 この方法によ り 、 光学系の歪な ど全ての誤差を補正でき る。

2 ) 蛍光試料を用いる方法

蛍光色素を均一に塗布した試料に対して、 走査手段を静止 させて レーザー光を照射し退色させる。 退色の仕方は、 格子 点状でもその他の模様でも 良い。 次に、 通常の高速走査によ り レーザー顕微鏡で得た蛍光画像を観察する。 する と 、 退色 した模様が画像上に現れている。 この時の画像のずれから、 動的特性と静的特性の差が明 らかになる。

図 1 0 は、 画像メ モ リ 中に記録される画像を表す図である 画像中の各画素は、 サンプリ ングされたと きの走査手段の角 度或いは制御電圧 （制御入力） を軸に記録されている と考え る こ とができ る。 まず、 走査手段を停止させて蛍光色素を退 色させる。 その時の走査手段への制御入力を （ a， b ) とす る。 次に、 通常の レーザー顕微鏡で得た蛍光画像を観察 し、 退色を確認した座標を （ c , d ) とする。 こ の （ a , b ) と ( c， d ) の差が静的特性と動的特性との差である。

こ の差を求める手法と して、 一般に相関演算がある。 画像 全面に渡ってある間隔でこのよ う な作業を行なえば、 補正デ ータ を得る こ とができ る。 各画素毎の細かい補正は、 実験で 得た補正データを内挿する こ と によ り 実施でき る。 実際の位 置指定は、 通常のレーザー顕微鏡で得た画像上で観察位置を 指定 （例えば （ c ， d ) ) し、 補正データ を用いて （ a , b ) に変換すれば、 正確な制御ができ る。 以上の方法によ り 顕微鏡画像から観察点を正確に設定できる。

本発明では、 蛍光色素分子の励起用光源と して、 複数の連 続発振レーザーあるいはパルス レーザーを測定点に応 じて選 択して （ レーザーの波長を選択して） 用い、 細胞内領域で複 数の所望の点を励起 し、 その蛍光強度のゆ らぎを測定して、 複数の種類の蛍光分子の並進拡散運動を解析する こ と ができ る。 こ の方法では、 細胞核内外、 細胞質内外で複数の 目的分 子をターゲッ ト と して捉える こ とができ、 細胞内のシグナル 伝達や物質輸送、 細胞分裂といった動的な変化を 3 次元的に リ アルタ イ ムで観察、 記録しなが ら、 解析を行な う こ と がで き る。 また、 細胞核內外における転写制御反応や情報伝達シ ステムが明 らかにされ得るので、 ゲノ ム創薬研究において有 益な情報を提供する こ とができ る。 これらは従来の蛍光相関 分光測定法では実現できなかったこ と である。

また、 細胞内の所望の 2種類の分子に対して、 相互相関を 測定したい場合、 それぞれを異なる蛍光色素で標識し、 蛍光 信号を並列に同時に検出 して、 蛍光強度ゆ らぎの時系列信号 (分子の動的情報に由来する信号） の解析を行な う。 これに よ り 、 両者の相関が明確になる と共に、 遊離している分子の 数、 結合 している分子の数な どの情報も得る こ と ができ る。 また、 異なる 2 以上の離散的な位置同士で、 1 以上の刺激に よる応答性を同時に経過測定する のに適 している。

同 じ細胞內でも、 核付近の深部と外界に近い細胞膜の近傍 では、 P H、 イ オン濃度勾配、 酸素濃度の違いゃ蛋 S質の分 布の偏在な ど、 さま ざまな違いが予想される。 特に核内では 転写因子な どの蛋白質の流入や流出、 転写複合体の形成や解 離な どが起こ り 、 時々刻々 ダイナ ミ ック に変化している。 こ のよ う な細胞内の離散的な複数箇所の変化を、 本発明によ り リ アルタイ ムに画像化するだけでなく 、 その挙動をそれぞれ 統計的に解析し、 動きの変化を解明する こ と ができる。 また 互いの相関性についての情報も得る こ と ができ る。

以上のよ う に本実施の形態によれば、 共焦点走査型光学顕 微鏡をベース に し、 視野内の特定の部位が蛍光標識された生 物学的試料に レーザー光を照射し、 試料画像を観察、 記録し なが ら、 試料内の複数の特定部位からの蛍光の強度ゆ らぎを 相関解析し、 該部位の統計的な性質や各部位間の相互作用な どを求める。

すなわち、 試料中に離散的に存在する所望の蛍光分子を認 識し、 視野内の 2次元あるいは 3 次元画像を観察、 記録する と共に、 試料画像上での位置を検知 しなが ら、 蛍光分子から の蛍光強度のゆ らぎを同時あるいは別々 に検出する。 そ して . 各々 の蛍光分子の強度ゆら ぎ （系列信号） の 自 己相関関数を 解析する と と もに、 所望の異なる蛍光分子間の相互相関解析 を行ない、 測定点間の時間的、 空間的な関連性を解析する こ と ができ る。

このよ う に、 同一の細胞内の複数の部位について、 これを 同定して観察、 記録しなが ら、 それぞれの部位からの蛍光信 号を個々 に受光 して相関解析を行ない、 各部位の統計的な性 質 （拡散速度、 粒子密度な ど） や異なる部位間の相関などを 求める。 これによ り 、 従来解析できなかった、 同一細胞内に 存在する複数の所望の部位からのダイ ナミ ック な挙動や統計 的性質の変化を求める こ と ができ る。

また、 同時に複数の部位での相関解析を実行でき るので、 同一細胞内の異なる成分同士についての機能の比較検討を リ アルタイ ムに解析でき る。 同様に して、 組織上の別々 の細胞 についての同時比較も行なえる。 さ ら に、 細胞内または細胞 間の異なる部位における経時的な変化についても、 同時の比 較検討によ って解析する こ と ができ る。 なお、 癌等の異変を 細胞毎に生きたまま調べる場合にも、 所望の対象部位につい て高精度に、 且つ迅速に解析でき るので、 細胞診断の信頼性 を向上する と と もに、 病理ないし再生医療に大き く 貢献する 本発明によれば、 以下の生体分子解析装置を構成する。 ( 1 ) . 生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置で あって、

測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料 の少な く と も一つの観察領域に対応する画像を取得する画像 取得手段と 、

こ の画像取得手段で取得した画像上の任意の点を指定する 指定手段と 、

この指定手段で指定された点に対応する試料上の位置に測 定点を配置する配置手段と、

こ の配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情 報に由来する信号を測定する測定手段と、

この測定手段で測定した結果を解析する解析手段と、 を具備 したこ と を特徴とする生体分子解析装置。

( 2 ) . 前記画像取得手段で取得する画像は 3次元領域を含 む画像であ り 、

前記配置手段は、 測定点を 3 次元上の任意の位置に配置す る こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 3 ) . 前記測定手段は、 同一の測定点から時間の異なる複 数の信号を取得し、 前記解析手段は、 前記測定点間の出力 を比較し演算する こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生体 分子解析装置。

( 4 ) . 前記測定手段は、 光学的信号の強度を測定する こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 5 ) . 前記解析手段は、 蛍光強度のゆ らぎを測定する こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 6 ) . 前記解析手段は、 蛍光相関分光法で前記蛍光強度の ゆ らぎを測定する こ と を特徴とする上記 （ 5 ) に記載の生体 分子解析装置。

( 7 ) . 前記画像取得手段は、 レーザー走査型共焦点方式か らなる こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生体分子解析装 置。

( 8 ) . 前記画像取得手段は、 ガルバノ スキャナーを用いて 前記試料を走査するこ と を特徴とする上記 （ 5 ) に記載の生 体分子解析装置。

( 9 ) . 前記測定手段は共焦点光学系からなる こ と を特徴と する上記 （ 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 1 0 ) . 前記画像取得手段は、 試料上の測定点に応 じて波 長を選択可能である こ と を特徴とする上記 （ 1 ) に記載の生 体分子解析装置。

( 1 1 ) . 前記解析手段は、 異なる前記被測定物質を 自 己相 関 と 相互相関 に よ り 相関解析す る こ と を特徴 と する 上記 ( 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 1 2 ) . 前記相関解析に用いる走査光学系は、 前記画像取 得手段の走査光学系と 同 じである こ と を特徴とする上記 （ 1 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 1 3 ) . 前記相関解析に用いる走査光学系は、 前記画像取 得手段の走査光学系と異なる こ と を特徴とする上記 （ 1 1 ) に記載の生体分子解析装置。

( 1 4 ) . 前記走査光学系を少な く と も二つ設け、 その う ち 少な く と も一つを画像取得に用い、 その他を前記相関解析に 用いる こ と を特徴とする上記 （ 1 1 ) に記載の生体分子解析 なお、 本発明は上記実施の形態のみに限定されず、 要旨を 変更 しない範囲で適宜変形して実施でき る。

例えば、 測定点から光強度以外にも明度ないし輝度に関す る測定データ を得る よ う に して、 生体分子の活性度を解析す る よ う に しても よい。 また、 単一分子を検出する原理と して 光学的偏光度や共鳴エネルギーの変化を測定する よ う に して も よい。 また、 測定点と して指定された試料上の部位におけ る成分特性に応 じて、 異なる演算式の中から適切な式を選択 して解析を行な う よ う に解析手段を改良する こ と によ って、 細胞内部や多種類の由来が異なる生体試料のよ う な多様な物 理学的環境にも対応して正確な解析結果を得る よ う に しても よい。 この場合、 画像上で指定可能な点が属する試料表面及 び/または内部の成分毎に適切な演算式を予めメ モ リ に記憶 しておいて、 実際に指定された点に応 じて最適な演算式を読 み出 して解析を行な う よ う にする と よい。

また例えば、 上述 した実施の形態では、 蛍光相関分光法を 用いた測定を例に説明 したが、 本発明はこれに限定されない すなわち本発明は、 測定対象と しての試料の特定部位または 特定領域に限定して種々 の光学特性 （偏光、 散乱、 電気化学 発光、 共鳴エネルギー転移、 プラズモ ン共鳴等） を測定する 任意の微小光学測定に適用可能である。 また、 試料について 取得する 2次元乃至 3 次元画像は、 1 枚の静止画像に限らず リ アルタイ ムに逐次更新される複数の静止画像またはビデオ 画像でも よい。 こ うする こ とで、 更新された最新の試料画像 に基づいて、 所望のタイ ミ ングで測定用のポイ ン ト を任意の 個数指定する こ とができ る。 指定した個数が、 同時に測定で き る個数よ り 多い場合には、 所望の組合わせで測定ポイ ン ト をグループ化する よ う な指定を行 う こ と によ って、 グループ 単位で複数のボイ ン ト毎に同時測定をする こ と も可能である 例えば、 同時に比較したい異なる箇所同士のポイ ン ト を同 じ グループに分類する のが望ま しい。 また、 本発明では、 微小 光学測定の種類によっては、 画像取得のための照射光量と検 出のための照射光量と を最適化する よ う に設計するのが望ま しい。 例えば、 上述 した蛍光相関分光法では、 光強度揺らぎ を計測するために一定時間継続してレーザを照射する ので、 画像取得のための瞬間的な走查レーザに比べて弱いレーザ出 力に設定するのが望ま しい。 また、 独立した走査系で測定用 ボイ ン ト を設定し得る例では、 複数の測定ボイ ン トにおいて 測定する部位の光学特性や測定項目 に応じて、 最適な測定結 果が得られる よ う に任意のタイ ミ ングおよび照射時間に設定 した り 、 レーザ光源からの出力を測定ポイ ン ト毎に異な らせ る こ と も可能である。 また、 光信号を得るための指標物質と して、 蛍光色素を用いたが、 蛍光を発生 し得る融合蛋 白質 (緑色蛍光蛋白質、 黄色蛍光蛋白質等） や、 化学発光物質、 磁性物質等であっても よい。 また、 試料の保持手段も、 細胞 その他の任意な材料について自然の状態を保つ条件で適宜の 容量を保持できれば、 いかなる種類のも ので も構わない。 産業上の利用可能性

本発明によれば、 対象と なる試料の多様な動きや変化を捉 える こと ができ る生体分子解析装置を提供でき る。

すなわち本発明によれば、 細胞内の離散的に存在する複数 の微小領域の 目 的分子を顕微鏡観察、 記録しなが ら、 生体分 子の動的挙動、 数な どについての情報や、 所望の異なる分子 間の相関を得る こ と ができ る。 これによ り 、 細胞内のシグナ ル伝達や物質移送、 細胞分裂な どの多彩な生命活動を リ アル タイ ムで捉え、 解析する こ とができ る。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 生体分子の動的挙動を解析する生体分子解析装置であ つて、

測定可能な状態に保持された生体分子を含む生物学的試料 の少な く と も一つの観察領域に対応する画像を取得する画像 取得手段と 、

こ の画像取得手段で取得した画像上の任意の点を指定する 指定手段と 、

こ の指定手段で指定された点に対応する試料上の点位置に 測定点を継続的に一致する よ う に配置する配置手段と、

こ の配置手段で配置された測定点から被測定物質の動的情 報に由来する信号を測定する測定手段と、

この測定手段で測定した結果を解析する解析手段と、 を具備 したこ と を特徴とする生体分子解析装置。

2 . 前記画像取得手段で取得する画像は 3 次元領域を含む 画像であ り 、

前記配置手段は、 測定点を 3 次元上の任意の位置に配置す る こ と を特徴とする請求項 1 に記載の生体分子解析装置。

3 . 前記測定手段は、 同一の測定点から時間の異なる複数 の信号を取得し、

前記解析手段は、 前記測定点間の出力を比較し演算する こ と を特徴とする請求項 1 に記載の生体分子解析装置。

4 . 前記測定手段は、 光学的信号の強度を測定する こ と を 特徴とする請求項 1 に記載の生体分子解析装置。

5 . 前記解析手段は、 指定された点が属する試料上の成分 に応 じて適切な動的情報に関する演算式を用いて演算する こ と を特徴とする請求項 1 または 2 に記載の生体分子解析装置 6 . 前記指定手段は、 任意の 2以上の点を指定可能に構成 され、 前記配置手段及び前記測定手段は、 指定された 2以上 の点のそれぞれにおいて独立して機能し、

前記解析手段は、 前記 2 以上の点のそれぞれから得られた 測定結果を比較可能に出力する こ と を特徴とする請求項 1 乃 至 5 のいずれかに記載の生体分子解析装置。