JPH07333516A - 蛍光顕微鏡 - Google Patents
蛍光顕微鏡Info
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- JPH07333516A JPH07333516A JP6148722A JP14872294A JPH07333516A JP H07333516 A JPH07333516 A JP H07333516A JP 6148722 A JP6148722 A JP 6148722A JP 14872294 A JP14872294 A JP 14872294A JP H07333516 A JPH07333516 A JP H07333516A
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- Japan
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- light
- wavelength
- dichroic mirror
- fluorescence
- laser
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 複数の光源から出射された励起光と励起され
た蛍光とが廉価な波長分離器で分離可能で、明るい蛍光
画像が容易に取得できる蛍光顕微鏡。 【構成】 第１の光源２１からの励起光と第２の光源２
２からの第２の波長の励起光とは第３の光分離手段２７
で同一光路に導かれて標本１１を照射する。標本１１か
らの第２の波長の蛍光と第４の波長の蛍光とは、第３の
光分離手段２７で分離され、それぞれ第１の光検出手段
２３及び第２の光検出手段２４により検出される。
た蛍光とが廉価な波長分離器で分離可能で、明るい蛍光
画像が容易に取得できる蛍光顕微鏡。 【構成】 第１の光源２１からの励起光と第２の光源２
２からの第２の波長の励起光とは第３の光分離手段２７
で同一光路に導かれて標本１１を照射する。標本１１か
らの第２の波長の蛍光と第４の波長の蛍光とは、第３の
光分離手段２７で分離され、それぞれ第１の光検出手段
２３及び第２の光検出手段２４により検出される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光顕微鏡に関するも
のである。更に詳しくは、複数の蛍光色素で標識された
標本を複数の波長のレーザ光を照射して観察するレーザ
走査型蛍光顕微鏡の光学配置に関する。
のである。更に詳しくは、複数の蛍光色素で標識された
標本を複数の波長のレーザ光を照射して観察するレーザ
走査型蛍光顕微鏡の光学配置に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来のレーザ走査顕微鏡の光学配置は図
６に示すようなものようなであった。レーザヘッド１、
２、３とダイクロイックミラー４、５とは励起光用の光
学系を形成しており、それぞれのレーザヘッド１、２、
３から出射するレーザ光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はダイクロイ
ックミラー６で反射され、走査ユニット７、リレーレン
ズ８、９、対物レンズ１０を介して標本１１を照射する
光路に導入される。レーザ光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の照射に
より励起されて標本１１からは蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３が
発光する。光検出器１２、１３、１４とダイクロイック
ミラー１５、１６とは蛍光用の光学系を形成しており、
標本１１から発光した蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３は逆進して
ダイクロイックミラー６を透過し、それぞれ光検出器１
２、１３、１４に入射する。
６に示すようなものようなであった。レーザヘッド１、
２、３とダイクロイックミラー４、５とは励起光用の光
学系を形成しており、それぞれのレーザヘッド１、２、
３から出射するレーザ光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３はダイクロイ
ックミラー６で反射され、走査ユニット７、リレーレン
ズ８、９、対物レンズ１０を介して標本１１を照射する
光路に導入される。レーザ光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の照射に
より励起されて標本１１からは蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３が
発光する。光検出器１２、１３、１４とダイクロイック
ミラー１５、１６とは蛍光用の光学系を形成しており、
標本１１から発光した蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３は逆進して
ダイクロイックミラー６を透過し、それぞれ光検出器１
２、１３、１４に入射する。
【０００３】上記のように光が進行するために、ダイク
ロイックミラー４はレーザ光Ｌ１を反射し、レーザ光Ｌ
２、Ｌ３を透過し、ダイクロイックミラー５はレーザ光
Ｌ２を反射し、レーザ光Ｌ３を透過する。ダイクロイッ
クミラー１５は蛍光Ｆ１を反射し、蛍光Ｆ２、Ｆ３を透
過し、ダイクロイックミラー１６は蛍光Ｆ２を反射し、
蛍光Ｆ３を透過する。ダイクロイックミラー６はレーザ
光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３をいずれも反射し、蛍光Ｆ１、Ｆ
２、Ｆ３をいずれも透過する。
ロイックミラー４はレーザ光Ｌ１を反射し、レーザ光Ｌ
２、Ｌ３を透過し、ダイクロイックミラー５はレーザ光
Ｌ２を反射し、レーザ光Ｌ３を透過する。ダイクロイッ
クミラー１５は蛍光Ｆ１を反射し、蛍光Ｆ２、Ｆ３を透
過し、ダイクロイックミラー１６は蛍光Ｆ２を反射し、
蛍光Ｆ３を透過する。ダイクロイックミラー６はレーザ
光Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３をいずれも反射し、蛍光Ｆ１、Ｆ
２、Ｆ３をいずれも透過する。
【０００４】レーザ用のダイクロイックミラー４、５及
び蛍光用のダイクロイックミラー１５、１６の分光特性
は、所定波長を境として、励起光側を反射し、蛍光側を
透過する分光特性であれば良い。しかしダイクロイック
ミラー６の分光特性はもっと複雑なものである。
び蛍光用のダイクロイックミラー１５、１６の分光特性
は、所定波長を境として、励起光側を反射し、蛍光側を
透過する分光特性であれば良い。しかしダイクロイック
ミラー６の分光特性はもっと複雑なものである。
【０００５】ダイクロイックミラー６の分光透過特性の
一例を図７に示して説明する。図７は横軸に波長、縦軸
に透過率を示し、透過しない光は全て反射する。ダイク
ロイックミラー６は不連続な複数の帯域の光を反射し、
それらの帯域の間の帯域の波長の光を透過する分光特性
を有している。Ａ、Ｂ、Ｃは透過率極小即ち反射率極大
の波長を示し、λA 、λB 、λC はそれぞれレーザ光Ｌ
１、Ｌ２、Ｌ３の波長であり、λa 、λb 、λc はそれ
ぞれ蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の波長である。λA 、λB 、
λC はそれぞれ反射率極大のＡ、Ｂ、Ｃとほぼ一致し、
λa 、λb 、λc はそれぞれＡ、Ｂ、Ｃより長波長側の
透過率の高い部分に対応している。 一般に蛍光の波長
は励起光の波長と大きく異なる波長ではない。したがっ
て、λa はλA より長波長であるが、λB より短波長で
あり、同様にλb はλB より長波長であるが、λC より
短波長である。
一例を図７に示して説明する。図７は横軸に波長、縦軸
に透過率を示し、透過しない光は全て反射する。ダイク
ロイックミラー６は不連続な複数の帯域の光を反射し、
それらの帯域の間の帯域の波長の光を透過する分光特性
を有している。Ａ、Ｂ、Ｃは透過率極小即ち反射率極大
の波長を示し、λA 、λB 、λC はそれぞれレーザ光Ｌ
１、Ｌ２、Ｌ３の波長であり、λa 、λb 、λc はそれ
ぞれ蛍光Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の波長である。λA 、λB 、
λC はそれぞれ反射率極大のＡ、Ｂ、Ｃとほぼ一致し、
λa 、λb 、λc はそれぞれＡ、Ｂ、Ｃより長波長側の
透過率の高い部分に対応している。 一般に蛍光の波長
は励起光の波長と大きく異なる波長ではない。したがっ
て、λa はλA より長波長であるが、λB より短波長で
あり、同様にλb はλB より長波長であるが、λC より
短波長である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】このように、従来の蛍
光顕微鏡では不連続な複数の帯域の光を反射し、それら
の帯域の間の帯域の波長の光を透過する分光特性を有す
るダイクロイックミラーで、励起光用の光学系と蛍光用
の光学系とが結合され、この１個のダイクロイックミラ
ーが励起光を反射し、蛍光を透過して両者を分離する構
成となっていた。
光顕微鏡では不連続な複数の帯域の光を反射し、それら
の帯域の間の帯域の波長の光を透過する分光特性を有す
るダイクロイックミラーで、励起光用の光学系と蛍光用
の光学系とが結合され、この１個のダイクロイックミラ
ーが励起光を反射し、蛍光を透過して両者を分離する構
成となっていた。
【０００７】ところで、蛍光顕微鏡で観察する標本の蛍
光像は非常に暗いことが多いく、従って蛍光をいかに効
率良く結像するかが大きな課題であった。明るい蛍光像
を得るためには励起光以外の光を多く結像面に集光しな
くてはならない。対物レンズやリレーレンズの透過率を
向上させるのには限度があり、ダイクロイックミラーの
分光透過率特性の向上に努力がされている。良い分光透
過率特性とは、励起光の反射率が高く、蛍光の透過率が
高いことであるが、使用可能なレーザ光の波長は少数の
特定の波長に限定され、又レーザ光の波長帯域は数ｎｍ
と極めて狭い特徴がある。蛍光は励起波長に近接し、そ
れより１０〜３０ｎｍ程度長波長側にやや広いブロード
な波長帯域の分光特性を有している。
光像は非常に暗いことが多いく、従って蛍光をいかに効
率良く結像するかが大きな課題であった。明るい蛍光像
を得るためには励起光以外の光を多く結像面に集光しな
くてはならない。対物レンズやリレーレンズの透過率を
向上させるのには限度があり、ダイクロイックミラーの
分光透過率特性の向上に努力がされている。良い分光透
過率特性とは、励起光の反射率が高く、蛍光の透過率が
高いことであるが、使用可能なレーザ光の波長は少数の
特定の波長に限定され、又レーザ光の波長帯域は数ｎｍ
と極めて狭い特徴がある。蛍光は励起波長に近接し、そ
れより１０〜３０ｎｍ程度長波長側にやや広いブロード
な波長帯域の分光特性を有している。
【０００８】単一のレーザ光が励起光である場合に使用
するダイクロイックミラーは、そのレーザ光の波長より
短い波長をほぼ全て反射しレーザ光の波長より長い波長
の光をほぼ全て透過するような単純な特性を有するもの
で良く、製造が容易で廉価であった。
するダイクロイックミラーは、そのレーザ光の波長より
短い波長をほぼ全て反射しレーザ光の波長より長い波長
の光をほぼ全て透過するような単純な特性を有するもの
で良く、製造が容易で廉価であった。
【０００９】複数のレーザ光が励起光である場合には、
複数の特定の不連続な波長に限定されたレーザ光の波長
帯域に合致した複数の反射極大を有し、それ以外の波長
帯域の透過率が高いダイクロイックミラーが必要であ
る。このためには、コーティング層の数が大きい多層コ
ーディング膜によらなくてはならない。それでも反射極
大波長とレーザ光の波長との一致は充分にとることがで
きず、図４に示すように、ＡとλA とを一致させるとＢ
とλB との一致が悪くなると言うようなことが起こり、
又反射帯域の幅が不必要に広くなったりしていた。
複数の特定の不連続な波長に限定されたレーザ光の波長
帯域に合致した複数の反射極大を有し、それ以外の波長
帯域の透過率が高いダイクロイックミラーが必要であ
る。このためには、コーティング層の数が大きい多層コ
ーディング膜によらなくてはならない。それでも反射極
大波長とレーザ光の波長との一致は充分にとることがで
きず、図４に示すように、ＡとλA とを一致させるとＢ
とλB との一致が悪くなると言うようなことが起こり、
又反射帯域の幅が不必要に広くなったりしていた。
【００１０】コーティング層の数を大きくして設計の努
力をしても、このような多層コーディング膜の設計や製
造は容易ではなく、特性のばらつきも大きく歩留りも悪
くて非常に高価なものとなり、廉価に供給することは困
難であるという問題があった。
力をしても、このような多層コーディング膜の設計や製
造は容易ではなく、特性のばらつきも大きく歩留りも悪
くて非常に高価なものとなり、廉価に供給することは困
難であるという問題があった。
【００１１】本発明は上記の課題に鑑み、複数の光源か
ら出射された波長の異なる複数の励起光と、その励起光
の照射により励起されて標本より発光した波長の異なる
複数の蛍光とが所定波長を境に、入射した光を反射光と
透過光とに分離するような単純な分光特性の波長分離器
のみで分離可能で、明るい蛍光画像が容易に取得可能な
蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
ら出射された波長の異なる複数の励起光と、その励起光
の照射により励起されて標本より発光した波長の異なる
複数の蛍光とが所定波長を境に、入射した光を反射光と
透過光とに分離するような単純な分光特性の波長分離器
のみで分離可能で、明るい蛍光画像が容易に取得可能な
蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、第１の波長の
励起光を発生し、標本を照射することにより前記第１の
波長よりも長い第２の波長の蛍光を発生させる第１の光
源と、前記第２の波長よりも長い第３の波長の励起光を
発生し、前記標本を照射することにより前記第３の波長
よりも長い第４の波長の蛍光を発生させる第２の光源
と、前記第１の波長と前記第２の波長との間に設定した
波長を境に光を分離する分光特性を有した第１の光分離
手段と、前記第３の波長と前記第４の波長との間に設定
した波長を境に光を分離する分光特性を有した第２の光
分離手段と、前記第２の波長と前記第３の波長との間に
設定した波長を境に光を分離する分光特性を有し、前記
第１の光源からの励起光と前記第２の光源からの励起光
とを前記標本への同一光路に導くと共に、その分光特性
に従って前記標本からの光を分離する第３の光分離手段
と、前記第３の光分離手段で分離した、前記標本からの
光の一方を前記第１の光分離手段を介して検出する第１
の光検出手段と、前記第３の光分離手段で分離した、前
記標本からの光の他方を前記第２の光分離手段を介して
検出する第２の光検出手段とを具備するものである。
励起光を発生し、標本を照射することにより前記第１の
波長よりも長い第２の波長の蛍光を発生させる第１の光
源と、前記第２の波長よりも長い第３の波長の励起光を
発生し、前記標本を照射することにより前記第３の波長
よりも長い第４の波長の蛍光を発生させる第２の光源
と、前記第１の波長と前記第２の波長との間に設定した
波長を境に光を分離する分光特性を有した第１の光分離
手段と、前記第３の波長と前記第４の波長との間に設定
した波長を境に光を分離する分光特性を有した第２の光
分離手段と、前記第２の波長と前記第３の波長との間に
設定した波長を境に光を分離する分光特性を有し、前記
第１の光源からの励起光と前記第２の光源からの励起光
とを前記標本への同一光路に導くと共に、その分光特性
に従って前記標本からの光を分離する第３の光分離手段
と、前記第３の光分離手段で分離した、前記標本からの
光の一方を前記第１の光分離手段を介して検出する第１
の光検出手段と、前記第３の光分離手段で分離した、前
記標本からの光の他方を前記第２の光分離手段を介して
検出する第２の光検出手段とを具備するものである。
【００１３】
【作用】第１の光源からの第１の波長の励起光は、第１
の光分離手段により分離され、第２の光源からの第２の
波長の励起光は、第２の光分離手段により分離されてか
ら、第３の光分離手段で同一光路に導かれて標本を照射
する。標本からの第２の波長の蛍光と第４の波長の蛍光
とは、第３の光分離手段で分離される。第２の波長の蛍
光は、第１の光分離手段により分離されて、第１の光検
出手段により検出され、第４の波長の蛍光は、第２の光
分離手段により分離されて、第２の光検出手段により検
出される。
の光分離手段により分離され、第２の光源からの第２の
波長の励起光は、第２の光分離手段により分離されてか
ら、第３の光分離手段で同一光路に導かれて標本を照射
する。標本からの第２の波長の蛍光と第４の波長の蛍光
とは、第３の光分離手段で分離される。第２の波長の蛍
光は、第１の光分離手段により分離されて、第１の光検
出手段により検出され、第４の波長の蛍光は、第２の光
分離手段により分離されて、第２の光検出手段により検
出される。
【００１４】
【実施例】本発明の一実施例を図１により説明する。図
１はレーザ走査顕微鏡の光学配置を示している。レーザ
ヘッド２１及びレーザヘッド２２はそれぞれ波長４８８
ｎｍのレーザ光Ｌ４及び波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５
を放射する光源である。光検出器２３はレーザ光Ｌ４の
照射により標本１１から発光した蛍光Ｆ４を検出する光
電素子、及び光検出器２４はレーザ光Ｌ５の照射により
標本１１から発光した蛍光Ｆ５を検出する光電素子であ
る。ダイクロイックミラー２５はレーザ光Ｌ４を反射
し、蛍光Ｆ４を透過し、ダイクロイックミラー２６はレ
ーザ光Ｌ５を反射し、蛍光Ｆ５を透過する波長分離器で
ある。レーザヘッド２１、光検出器２３及びダイクロイ
ックミラー２５と、レーザヘッド２２、光検出器２４及
びダイクロイックミラー２６とはそれぞれ組となってい
る。
１はレーザ走査顕微鏡の光学配置を示している。レーザ
ヘッド２１及びレーザヘッド２２はそれぞれ波長４８８
ｎｍのレーザ光Ｌ４及び波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５
を放射する光源である。光検出器２３はレーザ光Ｌ４の
照射により標本１１から発光した蛍光Ｆ４を検出する光
電素子、及び光検出器２４はレーザ光Ｌ５の照射により
標本１１から発光した蛍光Ｆ５を検出する光電素子であ
る。ダイクロイックミラー２５はレーザ光Ｌ４を反射
し、蛍光Ｆ４を透過し、ダイクロイックミラー２６はレ
ーザ光Ｌ５を反射し、蛍光Ｆ５を透過する波長分離器で
ある。レーザヘッド２１、光検出器２３及びダイクロイ
ックミラー２５と、レーザヘッド２２、光検出器２４及
びダイクロイックミラー２６とはそれぞれ組となってい
る。
【００１５】走査ユニット７、リレーレンズ８、９、対
物レンズ１０は、レーザ光Ｌ４及びレーザ光Ｌ５を標本
１１に集光して照射するための対物レンズ光学系を形成
し、レーザヘッド２１、レーザヘッド２２、光検出器２
３及び光検出器２４は対物レンズ光学系による標本１１
の結像面に配置されている。
物レンズ１０は、レーザ光Ｌ４及びレーザ光Ｌ５を標本
１１に集光して照射するための対物レンズ光学系を形成
し、レーザヘッド２１、レーザヘッド２２、光検出器２
３及び光検出器２４は対物レンズ光学系による標本１１
の結像面に配置されている。
【００１６】ダイクロイックミラー２７はレーザ光Ｌ４
及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５及び蛍光Ｆ５を透
過する波長分離器であり、又ダイクロイックミラー２７
を介してダイクロイックミラー２５及びダイクロイック
ミラー２６からの光路と対物レンズ光学系の光路が結合
されている。
及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５及び蛍光Ｆ５を透
過する波長分離器であり、又ダイクロイックミラー２７
を介してダイクロイックミラー２５及びダイクロイック
ミラー２６からの光路と対物レンズ光学系の光路が結合
されている。
【００１７】次に蛍光物質により標識された標本１１を
照射するレーザ光Ｌ４と励起されて発光する蛍光Ｆ４、
レーザ光Ｌ５と励起されて発光する蛍光Ｆ５の分光分布
について、蛍光物質フルオレッセイン及び蛍光物質ロー
ダミンで標識された標本１１を例として、図２により説
明する。図２は横軸に波長、縦軸に強度率を示してい
る。
照射するレーザ光Ｌ４と励起されて発光する蛍光Ｆ４、
レーザ光Ｌ５と励起されて発光する蛍光Ｆ５の分光分布
について、蛍光物質フルオレッセイン及び蛍光物質ロー
ダミンで標識された標本１１を例として、図２により説
明する。図２は横軸に波長、縦軸に強度率を示してい
る。
【００１８】蛍光物質フルオレッセインは波長４８８ｎ
ｍのレーザ光Ｌ４により励起され、波長５２０ｎｍ付近
に極大値を有する蛍光Ｆ４を発光し、蛍光物質ローダミ
ンは波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５により励起され、波
長５８０ｎｍ付近に極大値を有する蛍光Ｆ５を発光す
る。レーザ光Ｌ４及びレーザ光Ｌ５の半値幅は小さい
が、蛍光Ｆ４及び蛍光Ｆ５はブロードであって、半値幅
は大きい。
ｍのレーザ光Ｌ４により励起され、波長５２０ｎｍ付近
に極大値を有する蛍光Ｆ４を発光し、蛍光物質ローダミ
ンは波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５により励起され、波
長５８０ｎｍ付近に極大値を有する蛍光Ｆ５を発光す
る。レーザ光Ｌ４及びレーザ光Ｌ５の半値幅は小さい
が、蛍光Ｆ４及び蛍光Ｆ５はブロードであって、半値幅
は大きい。
【００１９】次にダイクロイックミラー２５、ダイクロ
イックミラー２６及びダイクロイックミラー２７の分光
特性について説明する。図３は横軸に波長、縦軸に透過
率を示し、透過しない光は全部反射する。ダイクロイッ
クミラー２５及びダイクロイックミラー２６はそれぞれ
波長４８８ｎｍ及び５６８ｎｍ以下の光を透過し、それ
を超える光を反射する分光特性を有している。ダイクロ
イックミラー２５の分光透過率曲線の立ち上がりは４８
８ｎｍの直近の長波長側に設定される。これはレーザ光
Ｌ４を反射し、蛍光Ｆ４を透過するためには、その分光
透過率曲線の立ち上がりは４８８ｎｍと５２０ｎｍの間
に設定する必要があり、更に、レーザ光Ｌ４の半値幅は
小さいが、蛍光Ｆ４はブロードであって半値幅は大きい
からである。ダイクロイックミラー２６の分光透過率曲
線の立ち上がりは同様の理由により、５６８ｎｍの直近
の長波長側に設定されている。
イックミラー２６及びダイクロイックミラー２７の分光
特性について説明する。図３は横軸に波長、縦軸に透過
率を示し、透過しない光は全部反射する。ダイクロイッ
クミラー２５及びダイクロイックミラー２６はそれぞれ
波長４８８ｎｍ及び５６８ｎｍ以下の光を透過し、それ
を超える光を反射する分光特性を有している。ダイクロ
イックミラー２５の分光透過率曲線の立ち上がりは４８
８ｎｍの直近の長波長側に設定される。これはレーザ光
Ｌ４を反射し、蛍光Ｆ４を透過するためには、その分光
透過率曲線の立ち上がりは４８８ｎｍと５２０ｎｍの間
に設定する必要があり、更に、レーザ光Ｌ４の半値幅は
小さいが、蛍光Ｆ４はブロードであって半値幅は大きい
からである。ダイクロイックミラー２６の分光透過率曲
線の立ち上がりは同様の理由により、５６８ｎｍの直近
の長波長側に設定されている。
【００２０】ダイクロイックミラー２７の分光透過率曲
線の立ち上がりは５６０ｎｍ付近に設定されている。こ
れはレーザ光Ｌ４及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５
及び蛍光Ｆ５を透過するためには、その分光透過率曲線
の立ち上がりは５２０ｎｍと５６８ｎｍの間に設定する
必要があり、更に、レーザ光Ｌ５の半値幅は小さいが、
蛍光Ｆ４はブロードであって半値幅は大きいからであ
る。ダイクロイックミラー２７はこのように、単に立ち
上がりが５６０ｎｍ付近に設定されればよい。従って立
ち上がり以下の帯域の光は全て反射し、それ以上の帯域
の光は全て透過する極めて単純な分光特性を有するもの
で良いから、ダイクロイックミラー２７は容易に、廉価
に製造することができる。
線の立ち上がりは５６０ｎｍ付近に設定されている。こ
れはレーザ光Ｌ４及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５
及び蛍光Ｆ５を透過するためには、その分光透過率曲線
の立ち上がりは５２０ｎｍと５６８ｎｍの間に設定する
必要があり、更に、レーザ光Ｌ５の半値幅は小さいが、
蛍光Ｆ４はブロードであって半値幅は大きいからであ
る。ダイクロイックミラー２７はこのように、単に立ち
上がりが５６０ｎｍ付近に設定されればよい。従って立
ち上がり以下の帯域の光は全て反射し、それ以上の帯域
の光は全て透過する極めて単純な分光特性を有するもの
で良いから、ダイクロイックミラー２７は容易に、廉価
に製造することができる。
【００２１】次に動作について説明する。レーザヘッド
２１から出射するレーザ光Ｌ４は、ダイクロイックミラ
ー２５で反射した後ダイクロイックミラー２７で反射
し、対物レンズ光学系に導入され、他方レーザヘッド２
２から出射するレーザ光Ｌ５は、ダイクロイックミラー
２６で反射した後ダイクロイックミラー２７を透過して
対物レンズ光学系に導入される。レーザ光Ｌ４及びレー
ザ光Ｌ５は走査ユニット７、リレーレンズ８、９を介し
て、対物レンズ１０により集光され、標本１１を照射す
る。
２１から出射するレーザ光Ｌ４は、ダイクロイックミラ
ー２５で反射した後ダイクロイックミラー２７で反射
し、対物レンズ光学系に導入され、他方レーザヘッド２
２から出射するレーザ光Ｌ５は、ダイクロイックミラー
２６で反射した後ダイクロイックミラー２７を透過して
対物レンズ光学系に導入される。レーザ光Ｌ４及びレー
ザ光Ｌ５は走査ユニット７、リレーレンズ８、９を介し
て、対物レンズ１０により集光され、標本１１を照射す
る。
【００２２】標本１１からは蛍光Ｆ４及び蛍光Ｆ５が出
射し、対物レンズ１０により集光された後、リレーレン
ズ８、９、走査ユニット７を介して逆進する。蛍光Ｆ４
はダイクロイックミラー２７で反射されて、ダイクロイ
ックミラー２５を透過し、光検出器２３に入射し、蛍光
Ｆ５はダイクロイックミラー２７及びダイクロイックミ
ラー２６を透過し、光検出器２４に入射し、それぞれ蛍
光画像が得られる。
射し、対物レンズ１０により集光された後、リレーレン
ズ８、９、走査ユニット７を介して逆進する。蛍光Ｆ４
はダイクロイックミラー２７で反射されて、ダイクロイ
ックミラー２５を透過し、光検出器２３に入射し、蛍光
Ｆ５はダイクロイックミラー２７及びダイクロイックミ
ラー２６を透過し、光検出器２４に入射し、それぞれ蛍
光画像が得られる。
【００２３】本発明の第２の実施例を図４により説明す
る。上述した一実施例と同一又は類似の点の説明の詳述
は省略する。レーザヘッド２１、レーザヘッド２２及び
レーザヘッド２９はそれぞれ波長４８８ｎｍのレーザ光
Ｌ４、波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５及び波長６４７ｎ
ｍのレーザ光Ｌ６を放射する光源である。光検出器２３
はレーザ光Ｌ４の照射により標本１１から発光した蛍光
Ｆ４を検出する光電素子、光検出器２４はレーザ光Ｌ５
の照射により標本１１から発光した蛍光Ｆ５を検出する
光電素子、及び光検出器３０はレーザ光Ｌ６の照射によ
り標本１１から発光した蛍光Ｆ６を検出する光電素子で
ある。ダイクロイックミラー２５はレーザ光Ｌ４を反射
し、蛍光Ｆ４を透過し、ダイクロイックミラー２６はレ
ーザ光Ｌ５を反射し、蛍光Ｆ５を透過し、ダイクロイッ
クミラー３１はレーザ光Ｌ６を反射し、蛍光Ｆ６を透過
する波長分離器である。
る。上述した一実施例と同一又は類似の点の説明の詳述
は省略する。レーザヘッド２１、レーザヘッド２２及び
レーザヘッド２９はそれぞれ波長４８８ｎｍのレーザ光
Ｌ４、波長５６８ｎｍのレーザ光Ｌ５及び波長６４７ｎ
ｍのレーザ光Ｌ６を放射する光源である。光検出器２３
はレーザ光Ｌ４の照射により標本１１から発光した蛍光
Ｆ４を検出する光電素子、光検出器２４はレーザ光Ｌ５
の照射により標本１１から発光した蛍光Ｆ５を検出する
光電素子、及び光検出器３０はレーザ光Ｌ６の照射によ
り標本１１から発光した蛍光Ｆ６を検出する光電素子で
ある。ダイクロイックミラー２５はレーザ光Ｌ４を反射
し、蛍光Ｆ４を透過し、ダイクロイックミラー２６はレ
ーザ光Ｌ５を反射し、蛍光Ｆ５を透過し、ダイクロイッ
クミラー３１はレーザ光Ｌ６を反射し、蛍光Ｆ６を透過
する波長分離器である。
【００２４】走査ユニット７、リレーレンズ８、９、対
物レンズ１０は、レーザ光Ｌ４、Ｌ５及びレーザ光Ｌ６
を標本１１に集光して照射するための対物レンズ光学系
を形成し、レーザヘッド２１、レーザヘッド２２、、レ
ーザヘッド２９、光検出器２３、光検出器２４及び光検
出器３０は対物レンズ光学系による標本１１の結像面に
配置されている。
物レンズ１０は、レーザ光Ｌ４、Ｌ５及びレーザ光Ｌ６
を標本１１に集光して照射するための対物レンズ光学系
を形成し、レーザヘッド２１、レーザヘッド２２、、レ
ーザヘッド２９、光検出器２３、光検出器２４及び光検
出器３０は対物レンズ光学系による標本１１の結像面に
配置されている。
【００２５】ダイクロイックミラー２７はレーザ光Ｌ４
及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５、Ｌ６及び蛍光Ｆ
５、Ｆ６を透過する波長分離器であり、ダイクロイック
ミラー３２はレーザ光Ｌ５及び蛍光Ｆ５を反射し、レー
ザ光Ｌ６及び蛍光Ｆ６を透過する波長分離器である。又
ダイクロイックミラー２７及びダイクロイックミラー３
２を介してダイクロイックミラー２５、ダイクロイック
ミラー２６及びダイクロイックミラー３１からの光源の
光路と対物レンズ光学系の光路が結合されている。
及び蛍光Ｆ４を反射し、レーザ光Ｌ５、Ｌ６及び蛍光Ｆ
５、Ｆ６を透過する波長分離器であり、ダイクロイック
ミラー３２はレーザ光Ｌ５及び蛍光Ｆ５を反射し、レー
ザ光Ｌ６及び蛍光Ｆ６を透過する波長分離器である。又
ダイクロイックミラー２７及びダイクロイックミラー３
２を介してダイクロイックミラー２５、ダイクロイック
ミラー２６及びダイクロイックミラー３１からの光源の
光路と対物レンズ光学系の光路が結合されている。
【００２６】次にダイクロイックミラー２５、ダイクロ
イックミラー２６、ダイクロイックミラー３１、ダイク
ロイックミラー２７及びダイクロイックミラー３２の分
光特性について、図５により説明する。ダイクロイック
ミラー２５、ダイクロイックミラー２６及びダイクロイ
ックミラー３１はそれぞれ波長４８８ｎｍ、５６８ｎｍ
及び６４７ｎｍの直近の長波長側に分光透過率曲線の立
ち上がりが設定されている。ダイクロイックミラー２７
及びダイクロイックミラー３２の分光透過率曲線の立ち
上がりはそれぞれ５６０ｎｍ付近及び６４０ｎｍ付近に
設定されている。ダイクロイックミラー２７及びダイク
ロイックミラー３２はこのように極めて単純な分光特性
を有し廉価に製造することができる。
イックミラー２６、ダイクロイックミラー３１、ダイク
ロイックミラー２７及びダイクロイックミラー３２の分
光特性について、図５により説明する。ダイクロイック
ミラー２５、ダイクロイックミラー２６及びダイクロイ
ックミラー３１はそれぞれ波長４８８ｎｍ、５６８ｎｍ
及び６４７ｎｍの直近の長波長側に分光透過率曲線の立
ち上がりが設定されている。ダイクロイックミラー２７
及びダイクロイックミラー３２の分光透過率曲線の立ち
上がりはそれぞれ５６０ｎｍ付近及び６４０ｎｍ付近に
設定されている。ダイクロイックミラー２７及びダイク
ロイックミラー３２はこのように極めて単純な分光特性
を有し廉価に製造することができる。
【００２７】次に動作について説明する。レーザヘッド
２１から出射するレーザ光Ｌ４は、ダイクロイックミラ
ー２５で反射した後ダイクロイックミラー２７で反射
し、対物レンズ光学系に導入され、レーザヘッド２２か
ら出射するレーザ光Ｌ５は、ダイクロイックミラー２６
で反射した後ダイクロイックミラー２７を透過して対物
レンズ光学系に導入され、レーザヘッド２９から出射す
るレーザ光Ｌ６は、ダイクロイックミラー３１で反射し
た後ダイクロイックミラー３２を透過して対物レンズ光
学系に導入される。レーザ光Ｌ４、レーザ光Ｌ５及びレ
ーザ光Ｌ６は走査ユニット７、リレーレンズ８、９を介
して、対物レンズ１０により集光され、標本１１を照射
する。
２１から出射するレーザ光Ｌ４は、ダイクロイックミラ
ー２５で反射した後ダイクロイックミラー２７で反射
し、対物レンズ光学系に導入され、レーザヘッド２２か
ら出射するレーザ光Ｌ５は、ダイクロイックミラー２６
で反射した後ダイクロイックミラー２７を透過して対物
レンズ光学系に導入され、レーザヘッド２９から出射す
るレーザ光Ｌ６は、ダイクロイックミラー３１で反射し
た後ダイクロイックミラー３２を透過して対物レンズ光
学系に導入される。レーザ光Ｌ４、レーザ光Ｌ５及びレ
ーザ光Ｌ６は走査ユニット７、リレーレンズ８、９を介
して、対物レンズ１０により集光され、標本１１を照射
する。
【００２８】標本１１からは蛍光Ｆ４、蛍光Ｆ５及び蛍
光Ｆ６が出射し、対物レンズ１０により集光された後、
リレーレンズ８、９、走査ユニット７を介して逆進す
る。蛍光Ｆ４はダイクロイックミラー２７で反射され
て、ダイクロイックミラー２５を透過し、光検出器２３
に入射する。蛍光Ｆ５はダイクロイックミラー２７を透
過し、ダイクロイックミラー３２で反射され、ダイクロ
イックミラー２６を透過し、光検出器２４に入射する。
蛍光Ｆ６はダイクロイックミラー２７、ダイクロイック
ミラー３２及びダイクロイックミラー３１を透過し、光
検出器３０に入射する。そしてそれぞれ蛍光画像が得ら
れる。
光Ｆ６が出射し、対物レンズ１０により集光された後、
リレーレンズ８、９、走査ユニット７を介して逆進す
る。蛍光Ｆ４はダイクロイックミラー２７で反射され
て、ダイクロイックミラー２５を透過し、光検出器２３
に入射する。蛍光Ｆ５はダイクロイックミラー２７を透
過し、ダイクロイックミラー３２で反射され、ダイクロ
イックミラー２６を透過し、光検出器２４に入射する。
蛍光Ｆ６はダイクロイックミラー２７、ダイクロイック
ミラー３２及びダイクロイックミラー３１を透過し、光
検出器３０に入射する。そしてそれぞれ蛍光画像が得ら
れる。
【００２９】両実施例において、複数の光源からの複数
のレーザ光で標本を励起する場合であっても、複数の反
射帯域を有するダイクロイックミラーを使用する必要が
ない。従ってダイクロイックミラーによる励起光と蛍光
の損失が少なくなり、特に蛍光の取得率が著しく改善さ
れるから、明るい蛍光画像が容易に取得可能となる。尚
光源はレーザに限定されるものではなく、連続光源でも
よく、任意の波長による励起が効率良く行うことができ
る。
のレーザ光で標本を励起する場合であっても、複数の反
射帯域を有するダイクロイックミラーを使用する必要が
ない。従ってダイクロイックミラーによる励起光と蛍光
の損失が少なくなり、特に蛍光の取得率が著しく改善さ
れるから、明るい蛍光画像が容易に取得可能となる。尚
光源はレーザに限定されるものではなく、連続光源でも
よく、任意の波長による励起が効率良く行うことができ
る。
【００３０】両実施例において、各光源と対応して光検
出器及び波長分離器が設けられているから、光源の交換
が光検出器及び波長分離器と一体に行うことが容易であ
り、蛍光物質の選択の幅が拡がる。
出器及び波長分離器が設けられているから、光源の交換
が光検出器及び波長分離器と一体に行うことが容易であ
り、蛍光物質の選択の幅が拡がる。
【００３１】
【発明の効果】第１の光源からの第１の波長の励起光
は、第１の光分離手段により分離され、第２の光源から
の第２の波長の励起光は、第２の光分離手段により分離
されてから、第３の光分離手段で同一光路に導かれて標
本を照射する。標本からの第２の波長の蛍光と第４の波
長の蛍光とは、第３の光分離手段で分離される。第２の
波長の蛍光は、第１の光分離手段により分離されて、第
１の光検出手段により検出され、第４の波長の蛍光は、
第２の光分離手段により分離されて、第２の光検出手段
により検出されるから、各励起光又は蛍光の分離が廉価
な波長分離器で光の損失を少なく抑えて分離可能であ
り、明るい蛍光画像が容易に取得できる。
は、第１の光分離手段により分離され、第２の光源から
の第２の波長の励起光は、第２の光分離手段により分離
されてから、第３の光分離手段で同一光路に導かれて標
本を照射する。標本からの第２の波長の蛍光と第４の波
長の蛍光とは、第３の光分離手段で分離される。第２の
波長の蛍光は、第１の光分離手段により分離されて、第
１の光検出手段により検出され、第４の波長の蛍光は、
第２の光分離手段により分離されて、第２の光検出手段
により検出されるから、各励起光又は蛍光の分離が廉価
な波長分離器で光の損失を少なく抑えて分離可能であ
り、明るい蛍光画像が容易に取得できる。
【図１】本発明の一実施例の光学配置を示す図。
【図２】本発明の一実施例にかかる励起光と蛍光の分光
強度分布を示す図。
強度分布を示す図。
【図３】本発明の一実施例にかかるダイクロイックミラ
ーの分光特性を示す図。
ーの分光特性を示す図。
【図４】本発明の第２の実施例の光学配置を示す図。
【図５】本発明の第２の実施例にかかるダイクロイック
ミラーの分光特性を示す図。
ミラーの分光特性を示す図。
【図６】従来のレーザ走査蛍光顕微鏡の光学配置を示す
図。
図。
【図７】従来のレーザ走査蛍光顕微鏡にかかるダイクロ
イックミラーの分光特性を示す図。
イックミラーの分光特性を示す図。
１、２、３、２１、２２、２９・・・・レーザヘッド ４、５、６、１５、１６、２５、２６、２７、３１・・
・・ダイクロイックミラー １０・・・・対物レンズ １１・・・・標本 １２、１３、１４、２３、２４、３０・・・・光検出器 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６・・・・レーザ光 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６・・・・蛍光
・・ダイクロイックミラー １０・・・・対物レンズ １１・・・・標本 １２、１３、１４、２３、２４、３０・・・・光検出器 Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６・・・・レーザ光 Ｆ１、Ｆ２、Ｆ、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６・・・・蛍光
Claims (1)
- 【請求項１】 第１の波長の励起光を発生し、標本を照
射することにより前記第１の波長よりも長い第２の波長
の蛍光を発生させる第１の光源と、前記第２の波長より
も長い第３の波長の励起光を発生し、前記標本を照射す
ることにより前記第３の波長よりも長い第４の波長の蛍
光を発生させる第２の光源と、前記第１の波長と前記第
２の波長との間に設定した波長を境に光を分離する分光
特性を有した第１の光分離手段と、前記第３の波長と前
記第４の波長との間に設定した波長を境に光を分離する
分光特性を有した第２の光分離手段と、前記第２の波長
と前記第３の波長との間に設定した波長を境に光を分離
する分光特性を有し、前記第１の光源からの励起光と前
記第２の光源からの励起光とを前記標本への同一光路に
導くと共に、その分光特性に従って前記標本からの光を
分離する第３の光分離手段と、前記第３の光分離手段で
分離した、前記標本からの光の一方を前記第１の光分離
手段を介して検出する第１の光検出手段と、前記第３の
光分離手段で分離した、前記標本からの光の他方を前記
第２の光分離手段を介して検出する第２の光検出手段と
を具備することを特徴とする蛍光顕微鏡。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14872294A JP3413967B2 (ja) | 1994-06-08 | 1994-06-08 | 蛍光顕微鏡 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14872294A JP3413967B2 (ja) | 1994-06-08 | 1994-06-08 | 蛍光顕微鏡 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07333516A true JPH07333516A (ja) | 1995-12-22 |
| JP3413967B2 JP3413967B2 (ja) | 2003-06-09 |
Family
ID=15459148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14872294A Expired - Lifetime JP3413967B2 (ja) | 1994-06-08 | 1994-06-08 | 蛍光顕微鏡 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3413967B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002148557A (ja) * | 2000-08-28 | 2002-05-22 | Leica Microsystems Wetzler Gmbh | 複数のスペクトル範囲に対する照明・結像装置およびこの照明・結像装置を備えた座標測定機 |
| WO2004001402A1 (ja) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Olympus Corporation | 生体分子解析装置 |
| JP2006189640A (ja) * | 2005-01-06 | 2006-07-20 | Olympus Corp | レーザ走査型顕微鏡 |
| DE102007007798A1 (de) | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluoreszenz-Beleuchtungseinrichtung |
| DE102007007797A1 (de) | 2007-02-16 | 2008-08-28 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluoreszenzmikroskop mit Beleuchtungseinrichtung |
| JP2009109748A (ja) * | 2007-10-30 | 2009-05-21 | Olympus Corp | 光学顕微鏡 |
| JP2013007791A (ja) * | 2011-06-22 | 2013-01-10 | Olympus Corp | 光源装置、光源ユニットおよび顕微鏡システム |
| DE102020119702A1 (de) | 2020-07-27 | 2022-01-27 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Vorrichtung und Verfahren zur Abtastung einer Zielebene mit mehreren Laserstrahlen, insbesondere zur Lasermaterialbearbeitung |
-
1994
- 1994-06-08 JP JP14872294A patent/JP3413967B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002148557A (ja) * | 2000-08-28 | 2002-05-22 | Leica Microsystems Wetzler Gmbh | 複数のスペクトル範囲に対する照明・結像装置およびこの照明・結像装置を備えた座標測定機 |
| WO2004001402A1 (ja) * | 2002-06-21 | 2003-12-31 | Olympus Corporation | 生体分子解析装置 |
| US6980294B2 (en) | 2002-06-21 | 2005-12-27 | Olympus Corporation | Biomolecule analyzer |
| JP2006189640A (ja) * | 2005-01-06 | 2006-07-20 | Olympus Corp | レーザ走査型顕微鏡 |
| DE102007007798A1 (de) | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluoreszenz-Beleuchtungseinrichtung |
| DE102007007797A1 (de) | 2007-02-16 | 2008-08-28 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluoreszenzmikroskop mit Beleuchtungseinrichtung |
| US8922885B2 (en) | 2007-02-16 | 2014-12-30 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluorescence microscope having an illumination device |
| DE102007007797B4 (de) * | 2007-02-16 | 2017-11-16 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Fluoreszenzmikroskop mit Beleuchtungseinrichtung |
| JP2009109748A (ja) * | 2007-10-30 | 2009-05-21 | Olympus Corp | 光学顕微鏡 |
| JP2013007791A (ja) * | 2011-06-22 | 2013-01-10 | Olympus Corp | 光源装置、光源ユニットおよび顕微鏡システム |
| DE102020119702A1 (de) | 2020-07-27 | 2022-01-27 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Vorrichtung und Verfahren zur Abtastung einer Zielebene mit mehreren Laserstrahlen, insbesondere zur Lasermaterialbearbeitung |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3413967B2 (ja) | 2003-06-09 |
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|---|---|---|---|
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