JP3568626B2

JP3568626B2 - 走査型光学顕微鏡

Info

Publication number: JP3568626B2
Application number: JP12515095A
Authority: JP
Inventors: 隆相方; 佳弘島田; 政李; 浩佐々木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 2004-09-22
Anticipated expiration: 2019-09-22
Also published as: JPH0843739A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は単一以上の蛍光検出光学系と蛍光観察光学系を具備した走査型光学顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
＜第１従来例＞
従来、蛍光観察が可能な走査型光学顕微鏡として、米国特許４９９７２４２号明細書に開示されており、これは単一波長のレーザ光源を用いて単一、あるいは二つの蛍光観察を行うもので、図７はその第１従来例を説明するための図である。図７に示すように、レーザ発振器２４から射出されたレーザビームは、以下に述べる光学走査部材２５により走査される。
【０００３】
すなわち、ビームスプリッタ２３により反射され、第１ガルバノメータスキャナを構成するガルバノメータ４６ａと平面鏡３５ａ、および凹面鏡４２ａ，４２ｂならびにガルバノメータスキャナを構成するガルバノメータ４６ｂと平面鏡３５ｂにより２次元走査したのち顕微鏡を通して標本上に照射される。これによって標本に発した蛍光は逆の光路をたどり、ビームスプリッタ３２を通過したのち、単一蛍光時はフォトマルチプライヤ３０へ、また二つの蛍光時はビームスプリッタ３２により分光され、各々フォトマルチプライヤ３０、フォトマルチプライヤ３４によって検出される。なお、以上述べた構成以外に、接眼レンズ２７、アイリス用ダイヤフラム３１，３３を備えている。
【０００４】
このような構成のものにおいて、図示しない標本からの蛍光は、接眼レンズ２７、平面鏡３５ｂ、凹面鏡４２ａ，４２ｂを反射した後、平行光線となり、平面鏡３５ａで反射され、アイリス用ダイヤフラム３１，３３を通過してフォトマルチプライヤ３０，３４で検出される。
【０００５】
以上述べた第１従来例の結像光学系は、ダイヤフラム３１，３３から凹面鏡４２ａまでの光路を大きくとることによって、共焦点効果が得られる。対物レンズが焦点位置の時に標本からの蛍光は、凹面鏡４２ａからフォトマルチプライヤ３４までの間で平行光線になるので、フォトマルチプライヤ３４に導かれる光ビーム直径は、ダイヤフラム３１，３３の直径で決定される。
【０００６】
＜第２従来例＞
図８に示すように、レーザ光源１からのレーザビームは、適宜なるビーム直径に拡大するための光学系であるビームエキスパンダ２を通り、ビーム直径を拡大した後、レーザ波長を選択するためのレーザラインフィルタ３でレーザ波長を選択してダイクロイックミラー４で反射され、ガルバノミラー等のＸーＹ走査光学系５でＸＹ偏光され、瞳レンズ６、顕微鏡７を介してレーザビームは標本１９上に照射され、標本１９をビーム走査することになる。
【０００７】
これにより励起された標本１９からの蛍光は、顕微鏡７からのダイクロイックミラー４に至る経路を戻り、ダイクロイックミラー４を通過した光は、ダイクロイックミラー６４で分光され、一方は結像レンズ７１を通り、共焦点絞り７４を通って光検出器１５で検出される。
【０００８】
同様に、他方はダイクロイックミラー６５で分光され、結像レンズ７２を通り、共焦点絞り７５を通って光検出器１４で検出され、またダイクロイックミラー６５を通過した蛍光は、ミラー６６で反射され、結像レンズ７３を通り、共焦点絞り７６を通って光検出器１３で検出される。
【０００９】
以上述べた第２従来例は、結像レンズ７１の焦点距離ｆと共焦点絞り７４へ光検出器１５までの距離ｌを適当に設定することにより、光検出器１５の受光領域に標本１９からの蛍光を導くことができる。同様に、結像レンズ７２，７３の焦点距離ｆと共焦点絞り７５，７６へ光検出器１４，１３までの距離ｌを適当に設定することにより、光検出器１４，１３の受光領域に標本１９からの蛍光を導くことができる。
【００１０】
＜第３従来例＞
図９は図８を以下のように構成したものである。すなわち、図８のダイクロイックミラー６４，６５と光検出器１５，１４の間にそれぞれ配設されている結像レンズ７１，７２と共焦点絞り７４，７５ならびにミラー６６と光検出器１３の間に配設されている結像レンズ７３と共焦点絞り７６を設けず、ダイクロイックミラー４と６４の間に結像レンズ７７と共焦点絞り７８を設けたものである。
【００１１】
このように第３従来例のように構成にすると、図８と同様な機能が得られると共に、図８の従来例に比べて装置が簡単になり、コストダウンとなる。
＜第４従来例＞
また、従来、蛍光検出が可能な走査型光学顕微鏡として、米国特許５１２７７３０号明細書に開示されており、これは複数の波長のレーザ光源を用いて、２つの蛍光を検出するもので、図１０はその第４従来例を説明するための図である。レーザ光源５０として、４８８ｎｍ，５６８ｎｍ，６４７ｎｍのレーザ光を同時発振するＫｒ−Ａｒレーザ光源５０を用いている。
【００１２】
レーザ光源５０より発振された３つの波長のレーザ光５１は、励起フィルタ５２のデュアルバンドパスフィルタ５２ａで４８８ｎｍと５６８ｎｍの２つとなり、デュアルダイクロイックミラー５４により図の下方の対物レンズ（図示せず）を介して蛍光標本５５に導かれる。標本５５から蛍光として発光された２種類の波長は、前記対物レンズ、デュアルダイクロイックミラー５４を透過し反射鏡５６で反射され、フィルタブロック５７に導かれる。そして、フィルタブロック５７に有する測光用ダイクロイックミラー５７ａにより、１つ１つの波長に分光されフィルタ５７ｂおよび５７ｃをそれぞれ介してフォトマルチプライヤ（ＰＭＴ）５８及び５９により検出される。
【００１３】
このように、図１０に示す走査型光学顕微鏡によれば、複数の波長を発振するマルチラインレーザ光源を組み合わせて、２重励起観察を行うことができる。
＜第５従来例＞
一方、第５従来例には、３つの蛍光を検出する走査型光学顕微鏡が開示され、図１１はこれを説明するための図である。レーザ光源１６０より発振された４８８ｎｍと５１４ｎｍのレーザビーム１６１は、エクスターナルフィルタ１６２により、どちらか１つの波長のみが透過される。
【００１４】
そして、ビームスプリッタ１６３により、図示下方に反射されＸＹスキャニングユニット１６４を通り、光学顕微鏡内の接眼レンズ１６６および対物レンズ１６７を通り標本１６５に集光される。この場合、標本１６５面はスキャニングユニット１６４で、標本１６５面を２次元に走査される。すると、標本１６５より発光した蛍光は、対物レンズ１６７、接眼レンズ１６６、スキャニングユニット１６４を通る。
【００１５】
そして、ビームスプリッタ１６３を透過し、２波長測光の場合はビームスプリッタ１６８により分光され、この一方はフォトマルチプライヤ１７４に導かれ、ビームスプリッタ１６８の他方の分光はビームスプリッタ１６９により分光され、この一方はフィルタ１７２を介してフォトマルチプライヤ１７３により検出され、ビームスプリッタ１６９の分光の他方はフィルタ１７０を介してフォトマルチプライヤ１７１により検出される。
【００１６】
このようにして標本１６５に適宜、照射されたレーザ光１６１からの蛍光はビームスプリッタ１６３を通過し、ビームスプリッタ１６８及び１６９により分光され、各々、フォトマルチプライヤ１７１，１７３，１７４によって検出される。
【００１７】
近年、蛍光観察においては、単染色のみならず、多重染色が多用されている。もとより蛍光染色は細胞、組織内の特定対象を可視化（特異性）する為に行う。故に多重染色時は各々の染色部位が明確な色の差、即ち蛍光波長の違いとして標識されなければならない。
【００１８】
ところで蛍光染色には極めて多種の方法があり、多重染色を行うと蛍光波長に部分的な重なり部分（クロスオーバ部分）が生じることがあり、図１２はそれを示している。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
前述した第１従来例では、凹面鏡４２ａ，４２ｂからダイアフラム３１，３３までの光路長を、共焦点効果を得るために、大きく取らねばならないので、装置が大型化する。さらに第１従来例を小型化するために、図７のミラー１００ａ，１００ｂ，１００ｃのように反射させねばならないが、これは光量をロスする原因になる。
【００２０】図８の第２従来例では、各チャンネルに共焦点絞り７４〜７６および結像レンズ７１，７２，７３を必要とするので、装置が複雑になり、コスト高となる。図９の第３従来例では、ダイクロイックミラー６４，６５を配置し、３チャンネル構成となっているので、光検出器１４は１５よりも光路長が大きくなり、また光検出器１３は１４よりも光路長が大きくなる。従って、光検出器１３，１４の受光領域に光ビームが完全に導かれなくなる。
【００２１】
図９の第３従来例では、光検出器１５，１４，１３の受光領域にロスなく標本１９からの蛍光を導くには、結像レンズ７７の焦点距離ｆを大きくしなければならない。しかし、焦点距離ｆを大きくすると、装置が大型化するという欠点がある。
【００２２】
また図１０の第４従来例または図１１の第５従来例では、これら多重染色による複数の蛍光波長を分割する手段として、ビームスプリッタ（ダイクロイックミラー）５４または１６３を使用し、更に検出する蛍光波長を限定する為に、様々な種類のシャープカットフィルタやバンドパスフィルタ５２ａ，５２ｂ，５２ｃ、５７ａ，５７ｂ，５７ｃまたは１６８，１６９，１７０，１７２を使用する必要がある。これらは使用するレーザ波長や蛍光染色に合わせ、その都度準備する必要もある。
【００２３】
一般的に、これらの波長依存性のあるフィルタ類５２ａ〜５２ｃ、５７ａ〜５７ｃ、１６８〜１７０，１７２は非線形性であり、蛍光波長のクロスオーバを取り除こうとすると、蛍光量のかなりの部分を検出する前に捨て去ることとなる。このことにより、検出のＳ／Ｎが落ちる。また染色の種類によっては蛍光波長のクロスオーバが大きいものも存在する。従って、前述した第４従来例または第５従来例では該検出そのものが不可能となる。
【００２４】
本発明の第１の目的は前記不具合を解消し、多重染色時の各々の蛍光波長を検出するための波長依存性のあるフィルタ類を使用することなく、Ｓ／Ｎの良い検出を行うことができる走査型光学顕微鏡を提供することにある。
【００２５】
本発明の第２の目的は前記不具合を解消し、標本を反射して得られる蛍光を光検出器にロスなく導くことができ、しかも小型で安価となる走査型光学顕微鏡を提供することにある。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、請求項１に対応する発明は、少なくとも単一波長のレーザビームを射出するレーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザビームを標本に対して走査する走査手段と、前記レーザ光源と走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からのレーザビームと前記標本からの光とを分離する分離光学系と、前記分離光学系で分離された前記標本からの光が集光する位置に配置された共焦点絞りと、前記共焦点絞りを通過した標本からの光を複数の波長に分けるグレーティングと、前記グレーティングにより分光された前記標本からの光を検出する光検出器と、この光検出器と前記グレーティングの間に配置され、幅を変化させることにより当該光検出器で検出される光の波長範囲を変更可能なスリットと、を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡である。
【００２７】
前記目的を達成するため、請求項２に対応する発明は、次のようにしたものである。すなわち、前記レーザ光源は、少なくとも二波長以上のレーザビームを出射することを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡である。
前記目的を達成するため、請求項３に対応する発明は、次のようにしたものである。すなわち、前記走査型光学顕微鏡は、さらに、前記共焦点絞りを通過した光を平行光にする平行光変換光学系を備えていることを特徴とする請求項１又は２記載の走査型光学顕微鏡である。
前記目的を達成するため、請求項４に対応する発明は、次のようにしたものである。すなわち、前記平行光変換光学系は凹レンズと凸レンズの組合せで構成したことを特徴とする請求項３記載の走査型光学顕微鏡である。
【００２９】
【作用】
請求項１に対応する発明によれば、少なくとも単一波長のレーザビームを標本に照射し標本からの光が少なくとも１個のグレーティングにより分光され、かつ分光された標本からの光を光検出器によって検出できるので、Ｓ／Ｎが良い検出ができる。
【００３０】
請求項２に対応する発明によれば、二波長以上のレーザビームを標本に照射し、標本からくる蛍光が測光分離手段により分離され、光検出器によって検出されるので、請求項１に対応する発明に比べて更に多様な蛍光波長の分離ができる。さらに、請求項３に対応する発明によれば、平行光変換光学系によって共焦点絞りを通過した光を平行光に変換しているので、全光量がロスなく、光検出器に入射でき、かつ光検出器を光学上の制約を受けることなく自由に配置できる。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。
＜第１実施例＞
図１は本発明の走査型光学顕微鏡の第１実施例の光学系を示す図である。本実施例は、レーザ光源１は単一波長例えば４８８ｎｍのレーザビームを出射し、標本１９に照射する。レーザ光源１からのレーザ光は、後述するレーザ光源手段および測光分離手段に導かれる。レーザ光源手段はビームエクスパンダ２、ダイクロイックミラー４、Ｘ−Ｙ走査光学系５、瞳投影レンズ６、顕微鏡７を順次介して標本１９に導くように構成されている。
【００３３】
また測光分離手段は、標本１９からの蛍光をダイクロイックミラー４にて分離したのち、共焦点光学系８、グレーティング９、幅を変更可能なスリット１０，１１，１２、集光レンズ１６，１７，１８、光検出器１３，１４，１５からなっている。
【００３４】
このような構成のものにおいて、標本１９から発した蛍光は、顕微鏡７から共焦点光学系８を通過したのち、グレーティング９に至る。勿論この時、共焦点光学系８をバイパスさせることも可能である。グレーティング９に至った蛍光はその波長に合わせ、０次〜ｎ次光に分けられる。これらの各次光には各々スリット１０，１１，１２、集光レンズ１６，１７，１８、光検出器１３，１４，１５が対応する。各々、スリット１０，１１，１２の幅を変化させることで、検出する各々の蛍光波長範囲が変更可能となる。
【００３５】
以上述べた第１実施例によれば、測光分離手段としてダイクロイックミラー、シャープカットフィルタ、パンドパスフィルタ等の波長依存性のあるフィルタ類を使用することがないので、多重染色時の蛍光クロスオーバのないＳ／Ｎのよい検出が可能になる。
【００３６】
＜第２実施例＞
図２は、本発明の第２実施例の光学系を示す図であり、前述の第１実施例のビームエクスパンダ２とダイクロイックミラー４の間の光路上に、新たにダイクロイックミラー２２およびレーザラインフィルタ３を設け、さらにダイクロイックミラー２２には、単一あるいは複数波長同時発振レーザ光源２０からのレーザ光をビームエクスパンダ２に拡大して照射する構成ように構成されている。これ以外のダイクロイックミラー４で反射された後、検出器１３，１４，１５に至るまでの構成は第１実施例と同一である。
【００３７】
レーザ光源２０としては、４８８ｎｍ、５６８ｎｍのＡｒーＫｒレーザ光源、３５１ｎｍのＡｒレーザ光源を組合わせたものを用いる。
以上述べた第２実施例も、前述の第１実施例と同様な作用効果が得られる。すなわち、レーザ光源１，２０からの二波長以上のレーザビームを標本１９に照射し、標本１９からくる蛍光がグレーティング９により分離され、光検出器１３，１４，１５によって検出されるので、Ｓ／Ｎが良く、第１実施例に比べて更に多様な蛍光波長の分離ができる。
【００３８】
＜第３実施例＞
図３は、本発明の第３実施例の光学系を示す図であり、前述の第１実施例のレーザ光源１を、例えば３５１ｎｍ，４５８ｎｍ，４８８ｎｍ，５１４．５ｎｍのマルチラインＡｒレーザ光源からなる複数波長同時発振レーザ光源２１に変更し、ビームエクスパンダ２とダイクロイックミラー４の間に、レーザラインフィルタ３を設けたものであり、これ以外の構成は前述の第１実施例と同一である。
【００３９】
第３実施例によれば、レーザ光源２１からの二波長以上のレーザビームを標本１９に照射し、標本１９からくる蛍光がグレーティング９により分離され、光検出器１３，１４，１５によって検出されるので、Ｓ／Ｎが良く、第１実施例に比べて更に多様な蛍光波長の分離ができる。
【００４０】
＜第４実施例＞
図４は、本発明の第４実施例の光学系を示す図であり、図１の実施例と異なる点は、以下のように構成したものである。すなわち、標本１９からの反射光を集光する結像レンズ６１と、結像レンズ６１の結像位置に配置された共焦点絞り６２と、この共焦点絞り６２を通過する発散光（拡がり角をもつビーム）を平行光線にするコリメート光学系６３と、このコリメート光学系６３の後方に配置され、所定の分光特性で標本１９からの蛍光を分光する２個のダイクロイックミラー６４，６５と、ダイクロイックミラー６５の後方に配置され、ダイクロイックミラー６５から得られる分光を反射して光検出器１３に導くミラー６６を設けたものである。
【００４１】
このような構成のものにおいて、コリメート光学系６３により、共焦点絞り６２を通過した光（拡散光）は平行光に変換される。従って、共焦点絞り６２を通過した後の光を所定の波長毎に分光して異なる複数の波長の光をそれぞれの光検出器１５，１４ならびに１３によって測光することができる。
【００４２】
この場合、共焦点絞り６２からどのような距離に光検出器１５，１４，１３を配置しても、測定光束はコリメート光学系６３により平行光に変換されることから、全光量がロスなく、ダイクロイックミラー６４，６５、ミラー６６を介して光検出器１５，１４ならびに１３に入射する。従って、ダイクロイックミラー６４，６５、光検出器１５，１４ならびに１３は、光学上の制約を受けることなく、自由に配置できる。
【００４３】
＜第５実施例＞
図５は、本発明の第４実施例の光学系を示す図であり、図４のコリメート光学系６３を、以下のようなコリメート光学系６７としたものである。すなわち、コリメート光学系６７は、片面が平面の凸レンズ、片面が球面上の凸レンズとし、かつこの凸レンズの平面側の面に図示しない蒸着膜にピンホールを形成したものである。
【００４４】
このように構成することにより、コリメート光学系６７を通過した光ビームは平行光線になり、ダイクロイックミラー６４，６５で分光され、光検出器１５，１４ならびに１３に受光領域から外れることなく導かれる。
【００４５】
コリメート光学系６７は、共焦点絞りを兼ねているので、小型でかつ安価にできる。
＜第６実施例＞
図６（ａ）は、本発明の第６実施例の光学系を示す図であり、図５の実施例のコリメート光学系６７を、凸レンズ６７ａと凹レンズ６７ｂの組み合わせたものとし、測光分離手段はグレーティング９で構成し、さらに光の幅を変更可能なスリット１０，１１，１２、集光レンズ１６，１７，１８、光検出器１３，１４，１５から構成したものである。
【００４６】
このような構成のものにおいて、図示しない標本から発した蛍光は、図示しない顕微鏡、瞳投影レンズ、ＸーＹ走査光学系、ダイクロイックミラーを通過し、結合レンズ６１、共焦点絞り６２、コリメート光学系６７を通ってグレーティング９に至る。蛍光は、その波長に合わせ、０次〜ｎ次光に分けられる。これらの各次元には、各々スリット１０〜１２、集光レンズ１６〜１８、光検出器１３〜１５が対応する。各々、スリット１０〜１２の幅を変化させることで、検出する各々の蛍光波長範囲が変更可能となる。
【００４７】
第６実施例では、コリメート光学系６７を、凸レンズ６７ａと凹レンズ６７ｂの組み合わせたものとすることにより、目的のビーム直径にするのに小型化ができる。これは、図６（ｂ）に示すように、コリメート光学系６７として凸レンズのみで構成した場合に比べてである。
なお、ビーム直径は、グレーティング９の格子間隔に対して十分に大きくする必要がある。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、測光分離手段として波長依存性のあるフィルタ類を使用することなく、多重染色時の蛍光クロスオーバのないＳ／Ｎのよい蛍光検出の可能な走査型光学顕微鏡を提供できる。
また、本発明によれば、標本を反射して得られる蛍光を光検出器にロスなく導くことができ、しかも小型で安価となる走査型光学顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の走査型光学顕微鏡の第１実施例を示す図。
【図２】本発明の走査型光学顕微鏡の第２実施例を示す図。
【図３】本発明の走査型光学顕微鏡の第３実施例を示す図。
【図４】本発明の走査型光学顕微鏡の第４実施例を示す図。
【図５】本発明の走査型光学顕微鏡の第５実施例を示す図。
【図６】本発明の走査型光学顕微鏡の第６実施例を示す図。
【図７】第１従来例を示す図。
【図８】第２従来例を示す図。
【図９】第３従来例を示す図。
【図１０】第４従来例を示す図。
【図１１】第５従来例を示す図。
【図１２】蛍光のクロスオーバを示す図。
【符号の説明】
１…単一波長発振レーザ光源、２…ビームエクスパンダ、４…ダイクロイックミラー、５…ＸＹ走査光学系、６…瞳上投影レンズ、７…顕微鏡、８…共焦点光学系、９…グレーティング、１０，１１，１２…可変スリット、１３，１４，１５…光検出器、１６，１７，１８…集光レンズ、１９…標本、２１，２９…レーザ光源、６１…結像レンズ、６２…共焦点絞り、６３，６７…コリメータ光学系、６４，６５…ダイクロイックミラー、６６…ミラー。

Claims

少なくとも単一波長のレーザビームを射出するレーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザビームを標本に対して走査する走査手段と、
前記レーザ光源と走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からのレーザビームと前記標本からの光とを分離する分離光学系と、
前記分離光学系で分離された前記標本からの光が集光する位置に配置された共焦点絞りと、
前記共焦点絞りを通過した標本からの光を複数の波長に分けるグレーティングと、
前記グレーティングにより分光された前記標本からの光を検出する光検出器と、
この光検出器と前記グレーティングの間に配置され、幅を変化させることにより当該光検出器で検出される光の波長範囲を変更可能なスリットと、
を具備したことを特徴とする走査型光学顕微鏡。
前記レーザ光源は、少なくとも二波長以上のレーザビームを射出することを特徴とする請求項１記載の走査型光学顕微鏡。
前記走査型光学顕微鏡は、さらに、前記共焦点絞りを通過した光を平行光にする平行光変換光学系を備えていることを特徴とする請求項１又は２記載の走査型光学顕微鏡。
前記平行光変換光学系は凹レンズと凸レンズの組み合わせで構成したことを特徴とする請求項３記載の走査型光学顕微鏡。