JP4339746B2 - 蛍光検出装置の励起光照射タイミングの決定方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光標識された標本に対し２ヶ以上の異なる励起光を当て、標本からの蛍光を分光観察する際に、不必要な励起光の照射を避ける蛍光検出装置に関する。

従来生命科学の分野において、蛍光標識された標本からの蛍光を検出する方法として、光検出器の前段で光学フィルタを用いて所望の波長域の蛍光を取得する方法が行われていた。また、近年では、多様な蛍光スペクトルを持つ蛍光色素や蛍光蛋白が次々に開発、改良されているため、従来のように光学フィルタを用いて特定の波長域の蛍光を取得するだけではなく、蛍光をグレーティング（回折格子）等の分光機を用いて分光検出し、蛍光の波長特性データを取得する試みも行われてきている。

例えば特許文献１の発明を利用すれば、単一励起光のみではなく、２波長以上の励起光により励起した標本の蛍光を、蛍光検出器にロスなく導き、分光観察することが可能である。
特開平8-43739

しかしながら、特許文献１の発明を用いて、二波長以上の励起光により標本を励起し、その蛍光を分光観察する場合には次のような問題点がある。
図５は、二つの蛍光色素Ａ、Ｂの蛍光スペクトルとその励起波長を図示したものである。図５が示す励起光Ａ、蛍光スペクトルＡとは、蛍光色素Ａの励起波長と蛍光スペクトルである。また、励起光Ｂ、蛍光スペクトルＢとは、蛍光色素Ｂの励起波長と蛍光スペクトルである。

従来分光分析を行う場合、Ａ１〜Ａ３、Ｂ１、Ｂ２のどの波長範囲の蛍光を検出している場合にも励起光Ａおよび励起光Ｂで標本を励起している。
これは、励起光Ａの蛍光スペクトルの分布が図５に示すようにＢ１、Ｂ２にまでのびているような場合、励起光Ｂを照射したときに蛍光スペクトルの観察結果に蛍光スペクトルＡが影響するため、観察条件を変えないために全ての励起光を照射していた。

しかし、蛍光は励起波長よりも長波長側の波長で現れるため、励起光Ａによる蛍光スペクトルＡ１〜Ａ３は、蛍光色素Ａの蛍光を検出している時には、励起光Ａで標本を励起すれば十分であり、励起光Ｂで標本を励起している意味がない。
そして、不必要な励起光で標本を励起することで蛍光の褪色の原因となってしまうことや、また、図５に示した例のような場合、蛍光色素Ａ、Ｂが近接していると、Ａの蛍光検出時にＢ用励起波長が障害になり励起光Ｂの部分だけが観測できなかった。

本発明は、上記従来技術の欠点に鑑みてなされたもので、二波長以上の励起光で励起した標本を分光観察する際に、不必要な励起光の照射を避ける方法を用いる蛍光検出装置を提供することを目的とする。

請求項１の発明によると、異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出装置において、前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較する比較手段と、前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止する、前記励起光の照射タイミングを決定する決定手段と、を具備することを特徴とする。本発明によれば、上記照射タイミングを制御することで標本に不必要な励起光を照射することがなくなる。

請求項２の発明によると、前記蛍光スペクトルの検出領域の幅と検出ステップ量と検出する蛍光スペクトル範囲を設定する設定手段を備え、前記決定手段は、前記設定手段で設定した前記蛍光スペクトルの検出領域と前記蛍光スペクトル範囲に基づき前記励起光の照射タイミングを制御することを特徴とする。本発明によれば、上記照射タイミングと波長検出を制御することで、標本に不必要な励起光を照射することだけでなく、観察に応じて適切な照射タイミングを決定できる。

請求項３の発明によると、前記決定手段は、前記励起波長が前記検出領域の開始波長より短波長側の所定のオフセット範囲にある場合にも前記励起光の照射を停止することを特徴とする。本発明によれば、励起光を取り込むことを防ぐことができる。
請求項４の発明によると、異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出の方法において、前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較し、前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止し、前記励起光の照射タイミングを決定する、ことを特徴とする。本発明によれば、上記照射タイミングを制御することで標本に不必要な励起光を照射することがなくなる。

請求項５の発明によると、異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出装置に使用するプログラムであって、前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較する比較機能と、前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止する、前記励起光の照射タイミングを決定する決定機能と、をコンピュータで実行可能なプログラム。本発明によれば、上記照射タイミングを制御することで標本に不必要な励起光を照射することがなくなる。

本発明によれば、標本に不必要な励起光を照射することが防げる。また、上記のことから標本を染色している蛍光色素、あるいは標本に組み込まれている蛍光蛋白の褪色を低減することができる。

（実施形態１）
以下図面に基づいて、本発明の実施形態について詳細を説明する。なお以下の実施形態では、蛍光検出装置の一例である共焦点走査型レーザ顕微鏡に本発明を適応した例を示すが、本発明は共焦点走査型レーザ顕微鏡に限定するものではなく、他の蛍光検出装置についても同様に利用することができる。

図１は、本発明を共焦点走査型レーザ顕微鏡で実施したときの構成例である。レーザ光源１はレーザ光を試料に照射する。レーザ光は光源制御器２を通り共焦点用スキャナ３によってＸ−Ｙ平面方向に振られ、対物レンズ４を通り、ステージ５上の試料面を走査する。

光源１の光量は、ＰＣ９が有する光源制御部９２より光源制御器２を制御することで光源１からの光量を制御可能である。
共焦点用スキャナ３は、光源１からのレーザ光を試料上に二次元走査するためのもので、例えばＸ軸方向走査用のガルバノミラーまたはレゾナントスキャナとＹ軸方向走査用のガルバノミラーを有し、これらＸスキャナとＹスキャナをＸ軸方向およびＹ軸方向に振ることでスポット光を試料上でＸＹ方向に振らせるようになっている。また、共焦点用スキャナ３も、ＰＣ９が有するＣＰＵ９１により制御可能である。

対物レンズ４は、共焦点用スキャナ３を通り二次元走査されたレーザ光をステージ５上の試料に照射する。そして、試料からの蛍光を対物レンズ４を通して共焦点用スキャナ３に戻し、この共焦点用スキャナ３からの蛍光を分光光学系６に導くようにしている。
試料面からの蛍光は、検出波長が可変できる分光光学系６により所望の分光をし、光検出器７によって電気信号に変換される。

光変換された電気信号は、Ａ／Ｄ変換器８によってデジタルデータに変換され一時的にＡ／Ｄ変換器８に蓄えられる。
Ａ／Ｄ変換器８に一時的に蓄えられたデジタルデータは、ある一定のデータ量になるとＣＰＵ９1を介してフレームメモリ９３にデータが記録される。フレームメモリ９３に記録されたデータは、フレームメモリ９３に接続されている出力装置１１に出力される。例えばモニタ等の表示装置上に表示される。

また、ＣＰＵ９１に接続されている入力装置１０は、使用者が画像を取得するための条件（以降画像取得条件と記載する）をスキャン画像領域、スキャン開始波長（λｓ）、スキャン終了波長（λｅ）、波長ステップ幅（λｓｔ）、波長分解能（λｒｅｓｏ）、使用するレーザの波長（ＥｘＷＬｌ、ＥｘＷＬ２、・・・）を入力するために用いる。使用するレーザが複数ある場合は複数のレーザの波長を入力する。上記画像取得条件の各制御パラメータは限定されるものではない。

そして、メモリ９４は、光検出器７より検出される試料からの光強度検出値、入力装置１０の指示で生成される画像取得条件などを記憶している。
ここで、ＣＰＵ９１、フレームメモリ９３、記憶装置９４等は一般的なパーソナルコンピュータを利用してもかまわない。

また、後述するコンピュータプログラムにより処理可能な処理プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ等記録媒体やハードディスク等記憶装置９４に記録されている。そして、必要に応じて前記パーソナルコンピュータのメモリ上に前記処理プログラムを読み出し、ＣＰＵにより実行しパーソナルコンピュータに接続されている各装置を制御している。

なお、記録媒体は通信回線を介してコンピュータと接続されている、プログラムサーバとして機能するコンピュータが備えている記憶装置であってもよい。
この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータヘ伝送するようにし、コンピュータでは受信した伝送信号を復調して処理プログラムを再生することでこの処理プログラムをＣＰＵで実行できるようになる。

以上のように構成した共焦点走査型レーザ顕微鏡で、画像を取得するための条件である制御パラメータを入力すると、蛍光スペクトルの検出領域と蛍光スペクトル範囲を設定し、その設定に基づき励起光を試料に照射し、試料に沿ってスキャンする。そして試料からの蛍光を蛍光スペクトルの検出領域毎に分光検出し、画像を取得することができる。

次に、使用者が入力装置１０を用いて入力する入力値である制御パラメータと、検出領域のスキャン後に得られる画像との関係を説明する。以後、本文中で使用する〔Ａ，Ｂ）はＡ以上Ｂ未満を示している。
始めに、スキャン開始波長λｓからλｓ＋λｒｅｓｏまでの検出領域で標本をスキャンし、得られる蛍光から波長域〔λｓ，λｓ＋λｒｅｓｏ）の蛍光を分光光学系６により取り出し画像化する。次に検出領域をλｓ＋λｓｔからλｓ＋λｓｔ＋λｒｅｓｏまでの領域に、移動し２度目の標本スキャンを行う。

この時スキャンで得られる波長域〔λｓ＋λｓｔ，λｓ＋λｓｔ＋λｒｅｓｏ）の蛍光を分光光学系６により取り出したデータに基づき画像化する。ｉ回目のスキャンが終了したときには波長域〔λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ＋λｒｅｓｏ）とあらわすことができる。そして同じように分光光学系６により取り出したデータに基づき蛍光を画像化する。

なお、すべてのスキャンが終了するのは、式１で示す不等式のようになるスキャン時である。
λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ＋λｒｅｓｏ≧λｅ ・・・ （１）
次に、具体例として図２のような細胞Ａを４８８ｎｍの励起波長のレーザ光で励起し、分光した蛍光画像を取得することを考える。

使用者が入力した画像取得条件の制御パラメータは次のとおりとする。本例では、励起光の励起波長は４８８ｎｍ、５４３ｎｍとした。スキャン開始波長λｓとスキャン終了波長λｅは、蛍光スペクトルが励起光より長波長側にあらわれる性質に基づき励起光より長波長側に設定し、蛍光スペクトル範囲をλｓ＝４９０ｎｍ、λｅ＝５９０ｎｍ、とした。尚、励起光と蛍光スペクトルの関係より算出して決めてもかまわない。

波長ステップ幅λｓｔと波長分解能λｒｅｓｏは、何枚画像を取得するかによって決めることもできるし、最大可能な限り取れる画像枚数を設定してもかまわない。また、波長ステップ幅λｓｔと波長分解能λｒｅｓｏの設定方法はこれに限定されるものではない。
本例では、λｓｔ＝２０ｎｍ、λｒｅｓｏ＝２０ｎｍとした。
この画像取得条件で細胞Ａをスキャンすると、図３のように合計５枚の画像が取得できる。

図４のフローチャートを用いて蛍光画像の取得の詳細について説明すると、ステップＳ１で、入力装置１０を用いて画像取得条件である制御パラメータを入力する。
上記の制御パラメータ、λｓ＝４９０ｎｍ、λe＝５９０ｎｍ、λｓｔ＝２０ｎｍ、λｒｅｓｏ=２０ｎｍ、ＥｘＷＬ１＝４８８ｎｍ、ＥｘＷＬ２＝５４３ｎｍを入力する。

ステップＳ２において、スキャン回数ｉに１を初期値として代入する。スキャン回数は取得する画像枚数と等しく、１回目のスキャンであるので１を代入する。
ステップＳ３において、式１の条件が成立するかどうかをチェックし、その結果に基づいてスキャンを終了するかどうかを判断する。もし、式１が成立している場合は終了する。
成立しない場合はＳ４に進む。

そして、ステップＳ４において、式２を満たす励起光をＯＦＦにし、満たさない励起光はＯＮにする。
λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ＜ＥｘＷＬｍ（ｍ＝１，２，・・・） ・・・ （２）
なお、励起光のＯＮ／ＯＦＦは、光源制御部９２からの命令により光源制御機２が行い、ステップＳ１の入力例でいえば、スキャン回数がｉ≦３までは、ＥｘＷＬ１がＯＮになり、ＥｘＷＬ２がＯＦＦになる。具体的には、４９０ｎｍ＋４０ｎｍ＞４８８ｎｍであるのでＥｘＷＬ１がＯＮになり、ＥｘＷＬ２がＯＦＦになる。

また、スキャン回数ｉ≧４の場合は、ＥｘＷＬ１、ＥｘＷＬ２ともにＯＮになる。具体的には、４９０ｎｍ＋６０ｎｍ＞４８８ｎｍであり、４９０ｎｍ＋６０ｎｍ＞５４３ｎｍであるのでＥｘＷＬ１とＥｘＷＬ２がともにＯＮになる。
なおこのステップＳ４における不等式は、蛍光は励起光の波長よりも長波長側にしか出てこないという原理に基づいている。

次に、ステップＳ５において、スキャン領域をスキャンして得られた蛍光のデータから、〔λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ，λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ＋λｒｅｓｏ）の波長域の蛍光データを画像化する。尚、ここで画像化は毎回のスキャン毎に行っているが全てのスキャン処理を終了してから画像化を行ってもかまわない。

ステップＳ６において、スキャン回数をインクリメントし、ステップＳ３に戻り、式１の条件が成立しているかを再度チェックし成立していれば終了する。本例では５枚の画像を取得したことになる。
本実施の形態によれば、複数の励起光で標本を励起しその蛍光を分光観察する場合において、不必要な励起光を標本に照射することで、蛍光の褪色の進みを遅らせ、標本の試料を傷めないようにすることができる。

（変形例）
次に、図４のステップＳ４において、式２を満たさない励起光のうち、全てをＯＮにするのではなく、その中からＯＮにする励起光を選べるようにしてもよい。
本実施の形態によれば、複数の励起光で標本を励起しその蛍光を分光観察する場合において、他の励起によって発生した蛍光スペクトルの影響を観察できる。

（変形例２）
図５のステップＳ４において、式２を式３のように修正したものを用いてもよい。
λｓ＋（ｉ−１）λｓｔ＜ＥｘＷＬｍ＋λｏｆｆｓｅｔ ・・・ （３）
λｏｆｆｓｅｔ≧０
このようにすることで、励起光の出力される波長に幅があった場合でも励起光を取り込むことがなくなる。例えば、励起光の出力の最大値となる波長は４８８ｎｍであるが、４８８ｎｍの前後５ｎｍでも若干レーザが出力されるようなレーザを励起光として使用した場合、制御パラメータにオフセット範囲λｏｆｆｓｅｔを用意し、λｏｆｆｓｅｔ＝５ｎｍと設定する。

この制御パラメータλｏｆｆｓｅｔを用いた式３により、図４のステップＳ４を実施するとで、励起光の波長幅の蛍光スペクトルを取り込むことを防ぐことができる。尚、このλｏｆｆｓｅｔの値は励起レーザ毎に個別の値を用いてもよいし、同じ値を用いてもよい。

本発明の実施の形態１を適用した走査型レーザ顕微鏡の構成例を説明する図である。 標本とスキャン範囲との関係を説明する図である。 取り込まれる画像の例を説明する図である。 本発明の実施の形態1の励起光のＯＮ／ＯＦＦを決定するための処理の流れを示した図である。 従来技術の問題点を説明する図である。

符号の説明

１ ・・・ 光源
２ ・・・ 光源制御器
３ ・・・ 共焦点用スキャナ
４ ・・・ 対物レンズ
５ ・・・ ステージ
６ ・・・ 分光光学系
７ ・・・ 光検出器
８ ・・・ Ａ／Ｄ変換器
９ ・・・ ＰＣ
９１ ・・・ ＣＰＵ
９２ ・・・ 光源制御部
９３ ・・・ フレームメモリ
９４ ・・・ 記憶装置
１０ ・・・ 入力装置
１１ ・・・ 出力装置

Claims (5)

1. 異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出装置において、
   前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較する比較手段と、
   前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止する、前記励起光の照射タイミングを決定する決定手段と、
   を具備することを特徴とする蛍光検出装置。
2. 前記蛍光スペクトルの検出領域の幅と検出ステップ量と検出する蛍光スペクトル範囲を設定する設定手段を備え、
   前記決定手段は、
   前記設定手段で設定した前記蛍光スペクトルの検出領域と前記蛍光スペクトル範囲に基づき前記励起光の照射タイミングを制御することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
3. 前記決定手段は、前記励起波長が前記検出領域の開始波長より短波長側の所定のオフセット範囲にある場合にも前記励起光の照射を停止することを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出装置。
4. 異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出の方法において、
   前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較し、
   前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止し、前記励起光の照射タイミングを決定する、
   ことを特徴とする蛍光検出装置の励起光照射タイミング決定方法。
5. 異なる波長の励起光を標本に照射し、前記標本からの蛍光を分光検出する蛍光検出装置に使用するプログラムであって、
   前記励起光の励起波長と、前記蛍光検出装置の蛍光スペクトルの検出領域の開始波長を比較する比較機能と、
   前記励起光の励起波長が、前記開始波長よりも長波長側であれば照射を停止する、前記励起光の照射タイミングを決定する決定機能と、
   をコンピュータで実行可能なプログラム。
   
   

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