DE10213187A1

DE10213187A1 - Verfahren zur Spektralanlanalyse und Scanmikroskop

Info

Publication number: DE10213187A1
Application number: DE10213187A
Authority: DE
Inventors: Werner Knebel
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-03-23
Filing date: 2002-03-23
Publication date: 2003-10-09
Also published as: US6977724B2; US20030179372A1

Abstract

Ein Verfahren zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes mit einem Multibanddetektor ist offenbart. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch die Schritte des Festlegens eines Spektralgesamtbereiches, des Festlegens eines ersten Spektralteilbereiches und Festlegen mindestens eines zweiten Spektralteilbereiches aus dem Spektralgesamtbereich, des simultanen Detektierens des von der Probe ausgehenden Lichtes im ersten und im zweiten Spektralbereich und Erzeugen von Detektionswerten, des Verschiebens des ersten Spektralteilbereiches und Verschieben des zweiten Spektralbereiches innerhalb des Spektralgesamtbereiches und des Wiederholens der Schritte c und d, bis das Licht über den gesamten Spektralgesamtbereich detektiert ist. Weiterhin ist ein Scanmikroskop mit einem Multibanddetektor, der von einer Probe ausgehendes Licht in mindestens einem ersten und einem zweiten Spektralbereich detektiert, offenbart. Das Scanmikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass die Spektralbereiche simultan verschiebbar sind.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes mit einem Multibanddetektor.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Scanmikroskop mit einem Multibanddetektor, der von einer Probe ausgehendes Licht in mindestens einem ersten und einem zweiten Spektralteilbereich detektiert.

In vielen Bereichen der Probenuntersuchungen, insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie und in der konfokalen Scanmikroskopie, spielt die spektrale Analyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes eine sehr Wichtige Rolle.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y- Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u. s. w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.

Aus der deutschen Offenlegungsschrift DE 43 30 347 ist eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens zweier Spektralbereiche eines Lichtstrahls und die Verwendung dieser Vorrichtung insbesondere in einem konfokalen Scanmikroskop bekannt. Die Vorrichtung weist eine Selektionseinrichtung und eine Detektionseinrichtung auf und ist zur zuverlässigen gleichzeitigen Selektion und Detektion unterschiedlicher Spektralbereiche bei hoher Ausbeute und bei einfachster Konstruktion derart ausgestaltet, dass die Selektionseinrichtung Mittel zur spektralen Zerlegung des Lichtstrahls und Mittel einerseits zum Ausblenden eines ersten Spektralbereichs und andererseits zur Reflexion zumindest eines Teils des nicht ausgeblendeten Spektralbereichs und die Detektionseinrichtung einen im Strahlengang des ausgeblendeten ersten Spektralbereichs angeordneten ersten Detektor und einen im Strahlengang des reflektierten Spektralbereichs angeordneten zweiten Detektor umfasst.

Aus der Deutschen Patentschrift DE 195 10 102 C2 ist eine Anordnung zur konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bekannt, bei der in einem Bildstrahlengang hintereinander eine Objektivanordnung zum Erfassen eines Bildes einer zu untersuchenden Probe, mindestens ein der Objektivanordnung nachgeordneter Scannerspiegel, eine Tubuslinse, eine konfokale Streifenblende, eine erste Spektrometeranordnung, eine Wellenlängen- Selektionsblende zur Selektion der Emissionswellenlänge, eine zu der ersten Spektrometeranordnung identische zweite Spektrometeranordnung, und ein Detektor zum Erfassen der Helligkeitsverteilung angeordnet sind, wobei über die Wellenlängen-Selektionsblende rückwärts eine Einkopplung von Anregungslicht über einen Anregungsstrahlengang erfolgt, der von einer Quelle für monochromatisches Anregungslicht über eine der konfokalen Streifenblende entsprechende Streifenblende und eine zu der ersten Spektrometeranordnung identische dritte Spektrometeranordnung zu der Wellenlängen-Selektionsblende führt, wobei der Bildstrahlengang und der Anregungsstrahlengang so beschaffen und derart aufeinander abgestimmt sind, dass von der Probe emittiertes Licht über die Wellenlängen- Selektionsblende zu dem Detektor gelangt, Anregungslicht jedoch von der Wellenlängen-Selektionsblende am Auftreffen auf den Detektor gehindert wird, jedoch die konfokale Streifenblende durchquert.

Aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 198 42 288 A1 ist eine Vorrichtung zur einstellbaren Detektion von von einem beleuchteten Objekt kommenden Objektlicht, vorzugsweise in einem mikroskopischen Strahlengang, bestehend aus mindestens einem dispersiven Element zur Wellenlängenseparation des Objektlichtes sowie im wellenlängenseparierten Teil des Objektlichtes angeordneten Mitteln zur einstellbaren Ausblendung mindestens eines Wellenlängenbereiches und Ablenkung in Richtung mindestens eines Detektors, bekannt.

Die vorbekannten Verfahren und Vorrichtungen sind zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes und zur Aufnahme ganzer Spektren von beispielsweise mehreren zehn oder mehreren hundert Nanometern Breite nur bedingt geeignet und weisen für diese Anwendungen entscheidende Nachteile auf. Die Vorrichtungen in denen Spektrometer, insbesondere Gitterspektrometer, vorgesehen sind haben oft eine insbesondere für Fluoreszenzmikroskopische Anwendungen zu kleine spektrale Auflösung. Dies ist meist auf unvermeidbare Streuungen des Lichtes an den Gitterstrukturen zurückzuführen. Vorrichtungen die Prismenspektrometer mit nachgeordneten Zeilendetektoren, wie beispielsweise Photodiodenarrays, beinhalten, weisen eine zu geringe Dynamik hinsichtlich der Detektionsempfindlichkeit auf. Die Vorrichtungen, wie beispielsweise die aus der bereits genannten Deutschen Patentschrift DE 195 10 102 C2 bekannte Vorrichtung, die sowohl eine gute spektrale Auflösung, als auch eine große Dynamik der Detektionsempfindlichkeit aufweisen, sind jedoch nur in der Lage eine begrenzte Anzahl von vom Benutzer anzugebenden spektralen Bereichen simultan zu detektieren.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes vorzuschlagen, das einerseits die Möglichkeit einer großen spektralen Auflösung und eine große Empfindlichkeitsdynamik bietet und andererseits eine schnelle und effiziente spektrale Analyse über einen festlegbaren spektralen Bereich ermöglicht.

Diese Aufgebe wird durch ein Verfahren zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes mit einem Multibanddetektor gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Festlegen eines Spektralgesamtbereiches,
b) Festlegen eines ersten Spektralteilbereichs und Festlegen mindestens eines zweiten Spektralteilbereichs, aus dem Spektralgesamtbereich.
c) Simultanes Detektieren des von der Probe ausgehenden Lichtes im ersten und im zweiten Spektralteilbereich und Erzeugen von Detektionswerten,
d) Verschieben des ersten Spektralteilbereichs und Verschieben des zweiten Spektralteilbereichs innerhalb des Spektralgesamtbereichs und
e) wiederholen der Schritte c und d bis das Licht über gesamten Spektralgesamtbereich detektiert ist.

Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, ein Scanmikroskop anzugeben, das einerseits die Möglichkeit einer großen spektralen Auflösung und eine große Empfindlichkeitsdynamik bietet und andererseits eine schnelle und effiziente spektrale Analyse über einen festlegbaren spektralen Bereich ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop mit einem Multibanddetektor gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Spektralbereiche simultan verschiebbar sind.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass das von einer Probe ausgehende Licht derart analysierbar ist, dass die schnelle und effiziente Aufnahme ganzer Spektren ermöglicht ist, ohne dass der Benutzer die Nachteile, die Spektrometer aufweisen, in Kauf nehmen muss.

In einer bevorzugten Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren die weiteren Schritte des Erzeugens eines Detektionsspektrums aus den Detektionswerten und des Darstellen des Detektionsspektrums. Das Detektionsspektrum wird vorzugsweise auf dem Monitor oder auf dem Display eines PCs angezeigt. Besonders illustrativ ist hierbei eine Falschfarbendarstellung.

In ganz besonders vorteilhafter Weise wird das Verfahren mit einem Scanmikroskop, insbesondere mit einem konfokalen Scanmikroskop, ausgeführt wird. Gerade in der Scanmikroskopie kommen die geschilderten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Scanmikroskops voll zum Tragen.

In einer bevorzugen Ausgestaltung beinhaltet das Scanmikroskop eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 der DE 43 30 347 A1. Wie bereits im allgemeinen Beschreibungsteil ausgeführt, umfasst eine solche Vorrichtung ein Mittel zum spektralen Aufspalten des von der Probe ausgehenden Lichtes und nachfolgende eine Spiegel-Blendenanordnung, die unterschiedliche Anteile des spektral aufgespalteten Lichtes verschiedenen Detektoren zuleitet. Die einzelnen Spiegelblenden sind in der erfindungsgemäßen Ausführung simultan verschiebbar. Vorzugsweise sind Stellmotoren vorgesehen, die die Verschiebung der Spiegelblenden bewirken. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung erfolgen die Verschiebungen computergesteuert.

Da die Dispersion des Mittels zum spektralen Aufspalten, das beispielsweise als Prisma ausgeführt sein kann, nicht linear ist, ist in einer bevorzugen Ausgestaltung vorgesehen, den Multibanddetektor zu kalibrieren und die Kalibrationsdaten in dem Speicher eines PCs oder eines Computers abzulegen, um sie beim Verschieben Spektralbereiche zu berücksichtigen. Auf diese Weise kann beispielsweise die Breite der Spektralbereiche konstant gehalten werden.

Da die Detektoren in der Regel nicht exakt dieselbe Charakteristik haben, könnten beim Zusammenfügen der in der verschiedenen Spektralbereichen gemessenen Daten Unstetigkeiten auftreten. Diese werden vorzugsweise durch Kalibrierung der Empfindlichkeit der Detektoren, beispielsweise der Hochspannung von Photomultiplieren, vermieden. Eine Anpassung kann mit Hilfe von Messungen am Rand der Probe vorgenommen werden. Dabei werden der Spektralgesamtbereich zunächst mit nur in einem der festgelegten Spektralbereiche abgetastet, um zu schauen, in welchem Wellenlängenbereich das größte Signal zu erwarten ist. Dort wird ein bestimmter Grauwert (innerhalb von 0-255) festgelegt. Danach werden die anderen Spektralbereiche sequentiell auf dieselbe spektrale Position verschoben und die Empfindlichkeiten der Detektors (PMT-Hochspannung) einander angeglichen. Vor dem Darstellen des Spektralgesamtbereichs ist vorzugsweise eine Glättung der erzeugten Daten vorgesehen. Diese erfolgt im PC.

Das Licht kann einem einzigen Rasterpunkt oder einer Zeile oder einer Fläche oder einem definierten Volumen der Probe entstammen.

In einer Ausgestaltung wird die Probe mit Beleuchtungslicht mindestens einer Wellenlänge beleuchtet. Vorzugsweise handelt es sich um Beleuchtungslicht mehrerer Wellenlängen. Als Lichtquelle kann ein Mehrlinienlaser oder mehrere Einzellaser, deren Emissionslicht zu einem Beleuchtungslichtstrahl vereinigt ist, vorgesehen sein. Auch Weißlichquellen oder Lichtquellen mit einem Kammgenerator, beispielsweise aus Photonic-Band-Gab-Material, sind einsetzbar.

Durch linienweises oder ebenenweises Umschalten und simultaner Detektion können dynamische Prozesse mit spektraler Auflösung untersucht werden. Wird eine Ebene der Probe mäanderförmig abgerastert, so ist es beispielsweise möglich, die erste, vierte, siebte. . . Zeile mit Beleuchtungslicht einer Wellenlänge von 488 nm, die zweite, fünfte, achte. . . Zeile mit Beleuchtungslicht einer Wellenlänge 568 nm und die dritte, sechste, neunte. . . Zeile mit Beleuchtungslicht einer Wellenlänge von 633 nm zu beleuchten und die Verschiebung der Spektralbereiche jeweils nach dem vollständigen Abrastern einer Probenebene vorzunehmen.

Insbesondere, wenn es sich bei dem von der Probe ausgehenden Licht um Fluoreszenzlicht handelt und das Beleuchtungslicht mehrere unterschiedliche Wellenlängen beinhaltet um beispielsweise mehrere unterschiedliche Farbstoffe in der Probe anzuregen ist es von besonderem Vorteil, dass spektrale Anteile des Beleuchtungslichts während des Detektierens ausgeblendet werden können, um zu vermeiden, dass an der Probe reflektiertes Beleuchtungslicht zusätzlich zum Fluoreszenzlicht detektiert wird. Dies ist immer dann notwendig, wenn ein verschobener Spektralteilbereich eine der Beleuchtungswellenlängen umfasst. Die durch das kurzfristige Ausblenden in einem anderen Spektralteilbereich entstehende Lücke an Detektionsinformation kann zeitlich nach dem Ausblenden geschlossen werden.

In diesem Zusammenhang ist ein Scanmikroskop, in dem zur Separierung von Anregungs- und Detektionsstrahlengang ein akustooptisches Bauteil vorgesehen ist, von ganz besonderem Vorteil. Eine optische Anordnung, die vorteilhafter Weise mit dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop kombinierbar ist, ist aus der Deutschen Offenlegungsschrift DE 199 06 757 A1 bekannt. Diese optische Anordnung beinhaltet mindestens ein akustooptisches Bauteil zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Lichts. Die optische Anordnung ist zur variablen Ausgestaltung bei einfachster Konstruktion dadurch gekennzeichnet, dass durch das akustooptisches Bauteil Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen ausblendbar ist. Alternativ ist eine solche optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar ist.

im Gegensatz zu einem dielektrischen Hauptstrahlteiler zur Separierung von von Anregungs- und Detektionsstrahlengang, der immer eine ganz besondere Transmissions-Charakteristik für das Detektionslicht ausweist und damit zu einer Verfälschung des Emissionsspektrums führt, kann ein akustooptisches Bauteil nahezu ideal auf die Anregungs- und Emissionswellenlänge angepasst werden. Für alle Emissionswellenlängen ist das akustooptische Bauteil fast vollständig transparent. Lediglich für die Anregungswellenlängen wird ein spektrales Fenster von nur ca. 2 nm herausgeschnitten. Die Anregungswellenlänge kann im Detektionsstrahlengang so gut unterdrückt werden, dass Spektralbereiche nahezu in die unmittelbare spektrale Nähe der Anregungswellenlänge gesetzt werden können, ohne, dass Anregungslicht in die Detektoren gelangt.

In einer bevorzugen Ausgestaltung erfolgt das Festlegen der Spektralbereiche automatisch. Sinnvolle Spektralteilbereich und sinnvolle Verschiebeschritte ermittelt der PC aus den Daten einer Probemessung.

Als Mittel zum Festlegen eines Spektralgesamtbereichs und als Mittel zum Festlegen des ersten und zweiten Spektralbereichs können verschiedene Eingabegeräte vorgesehen sein. Vorzugsweise werden die Bereiche über auf dem Monitor eines PCs dargestellte Slider mit der Computermaus eingegeben. Das Festlegen der Spektralbereiche und des Spektralgesamtbereichs umfasst das Festlegen der spektralen Breite und das Festlegen der spektralen Lage. Durch Verschieben des ersten und zweiten Spektralbereichs ist der Spektralgesamtbereich sukzessive abdeckbar und die Wellenlängeninformationen über den gesamten Spektralgesamtbereich erfassbar. In einer bevorzugen Ausgestaltung sind die Spektralbereiche kontinuierlich verschiebbar.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop,
Fig. 2 eine Ausgestaltung des Multibanddetektors des Scanmikroskops,
Fig. 3 ein weiteres Scanmikroskop,
Fig. 4 eine Ausführungsvariante des Verfahrens,
Fig. 5 eine andere Ausführungsvariante des Verfahrens.
Fig. 1 zeigt schematisch ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop, das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Der von einem Beleuchtungssystem 1, das aus einem ersten Laser 3 und einem zweiten Laser 5 besteht, Beleuchtungslichtstrahl 7 beinhaltet 4 Wellenlängen. Der Beleuchtungslichtstrahl 7 wird mit Hilfe der Optik 9 auf die Beleuchtungslochblende fokussiert. Über einen Strahlteiler 13 gelangt der Beleuchtungslichtstrahl 7 zum kardanisch aufgehängten Scanspiegel 15, der den Beleuchtungslichtstrahl 7 durch die Scanoptik 17, die Tubusoptik 19 und das Objektiv 21 hindurch über bzw. durch die Probe 23 führt. Der Beleuchtungslichtstrahl 7 wird bei nicht transparenten Proben 23 über die Probenoberfläche geführt. Bei biologischen Proben 23 (Präparaten) oder transparenten Proben kann der Beleuchtungslichtstrahl 7 auch durch die Probe 23 geführt werden. Dies bedeutet, dass verschiedene Fokusebenen des Objekts nacheinander durch den Beleuchtungslichtstrahl 7 abgetastet werden können. Die nachträgliche Zusammensetzung ergibt dann ein dreidimensionales Bild der Probe 23. Das von der Probe 23 ausgehende Licht 25 gelangt durch das Objektiv 21, die Tubusoptik 19 und die Scanoptik 17 hindurch und über den Scanspiegel 15 zum Strahlteiler 13, passiert diesen und trifft nach Passieren der Detektionslochblende 27 auf einen Multibanddetektor 29. Der Multibanddetektor 29 detektiert das von Probe ausgehende Licht 25 in vier zuvor festgelegten Spektralbereichen, die simultan verschiebbar sind, so dass durch das Verschieben der Spektralbereiche sukzessive ein Spektralgesamtbereich des Lichtes 25 spektral analysierbar ist. Der Multibanddetektor 29 erzeugt elektrische, zur Leistung des Lichts in den jeweiligen Spektralbereichen proportionale elektrische Detektionssignale und übergibt diese an eine Verarbeitungseinheit 31 weitergegeben. In der Verarbeitungseinheit 19 erfolgt das Auswerten der Detektionssignale. Dies beinhaltet unter anderem das Erzeugen von Detektionswerten, die anschließend an einen PC 33 übergeben werden. Der PC 33 erzeugt aus den Detektionswerten ein vollständiges Detektionsspektrum des zuvor vom Benutzer festgelegten Spektralgesamtbereichs und stellt dieses in einem Koordinatensystem auf einem Monitor 35 dar. Der PC 33 steuert außerdem den Multibanddetektor 29. Wegen der besseren Anschaulichkeit sind in der Figur einige optische Elemente zur Führung und Formung der Lichtstrahlen weggelassen. Diese sind einem auf diesem Gebiet tätigen Fachmann hinlänglich bekannt.
Fig. 2 zeigt einen Multibanddetektor, der von einer Probe ausgehendes Licht 25 in drei Spektralbeeichen detektiert, wobei die Spektralbereiche simultan verschiebbar sind. Das von einer Probe ausgehende Licht 25 wird von einem Prisma 37 spektral aufgefächert und anschließend von einer Linse fokussiert.
Ein erster Teil 39 des Lichtfächers 41 passiert die von der ersten Spiegelblende 43 und von der zweiten Spiegelblende 45 gebildete erste Spaltöffnung 47 und gelangt zum ersten Detektor 49. Der Rest des Spektralfächers wird von den Spiegelblenden 43, 45 reflektiert und gelangt zu der dritten und vierten Spiegelblende 51, 53, die die zweite Spaltöffnung 55 bilden. Durch die zweite Spaltöffnung 55 gelangt ein zweiter Teil 57 des Spektralfächers 41 zu einem zweiten Detektor 59, das übrige Licht wird zu einer fünften und einer sechsten Spiegelblende 61, 63 reflektiert, die eine dritte Spaltöffnung 65 bildet, durch die ein dritter Teil 69 des Spektralfächers 41 zu einem dritten Detektor 67 gelangt. Die Spiegelblenden 43, 45, 51, 53, 61, 63 sind entlang der Schnittlinie zwischen der Spiegelebene und der Auffächerungsebene motorisch angetrieben verschiebbar. Durch die Lage und die Breite der Spaltöffnungen 47, 55, 65 sind ein erster, ein zweiter und ein dritter Spektralteilbereich festgelegt, die durch simultanes Verschieben der Spiegelblenden 43, 45, 51, 53, 61, 63 sind diese Spektralbereiche verschiebbar und insgesamt der gesamte Spektralfächer sukzessive detektierbar. Die Verschiebung erfolgt computergesteuert.
Fig. 3 zeigt ein erfindungsgemäßes Scanmikroskop bei dem der in Fig. 1 gezeigte Strahlteiler 13 durch ein akustooptisches Bauteil 71 ersetzt ist, das als AOTF ausgeführt ist. Der Beleuchtungslichtstrahl 7 wird von einem Umlenkspiegel 75 zum akustooptischen Bauteil 71 reflektiert. Vom akustooptischen Bauteil 71 gelangt der Beleuchtungslichtstrahl 7 über die Strahlablenkeinrichtung 77, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 15 beinhaltet, und den Beleuchtungslichtstrahl 7 durch die Scanoptik 17, die Tubusoptik 19 und das Objektiv 21 über bzw. durch die Probe 23 führt. Das von der Probe Licht 25 durchläuft in umgekehrter Richtung die Scanoptik 17, die Tubusoptik 19 und das Objektiv 21 und gelangt über den Scanspiegel 15 zum akustooptischen Bauteil 71, das das Licht 25 einem Kompensationselement 77, das als weiteres akustooptisches Bauteil 73 ausgeführt ist, zuführt. Nach Durchlaufen des Kompensationselements 77 trifft Licht 25 auf ein Spiegelpaar, das das Licht 25 nach passieren der Detektionslochblende 27 dem Multibanddetektor 29 zuleitet. Das akustooptische Bauteil 71, das zum Selektieren der Anteile des Beleuchtungslichtstrahles 7 der ausgewählten Wellenlängen dient, ist als AOTF ausgestaltet, der von einer akustischen Welle durchlaufen ist. Die akustische Welle wird von einem elektrisch angesteuerten Piezo- Schallerzeuger 79 generiert. Die Ansteuerung erfolgt von einer Hochfrequenzquelle 81 aus, die eine elektromagnetische Hochfrequenzwelle, die mehrere einstellbare HF-Frequenzen aufweist, erzeugt. Die HF- Frequenzen sind so gewählt, dass nur die Anteile der gewünschten Wellenlängen des Beleuchtungslichtstrahls 7 zur Strahlablenkeinrichtung 77 gelangen. Die übrigen, von der akustischen Anregung nicht beeinflussten Anteile des Beleuchtungslichtstrahls 11 werden in eine Strahlfalle 83 gelenkt. Das weitere akustooptische Bauteil 73 ist ebenfalls als AOTF ausgeführt und wird von einer weiteren Hochfrequenzquelle 85 mit einer weiteren elektromagnetischen Hochfrequenzwelle angesteuert. Die HF-Frequenz der weiteren elektromagnetischen Hochfrequenzwelle ist derart gewählt, dass die Anteile des von der Probe ausgehenden Lichtes 25, die die Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahles 7 aufweisen, ausgeblendet werden. Zum Auswählen der HF-Frequenzen ist ein PC 33 vorgesehen. Der PC 33 steuert entsprechend der Benutzervorgabe die Hochfrequenzquelle 81 und die weitere Hochfrequenzquelle 85 und den Multibanddetektor 29. Der Benutzer nimmt Einstellungen mit Hilfe der Computermaus 87 vor. Auf dem Monitor 35 sind für jede ausgewählte HF-Frequenz ein Slider 89, 91, 93, 95 dargestellt, der zur Einstellung der Amplitude dient. Außerdem ist auf dem Monitor ein weiterer Slider 97 zum Festlegen Der Breite und der Anfangsstellung der Spektralbereiche vorgesehen. Jeder Spektralteilbereich ist innerhalb des Sliders durch einen in der Breite einstellbaren und insgesamt verschiebbaren Block repräsentiert.
Fig. 4 illustriert eine Ausführung des Verfahrens. Es soll das Fluoreszenzlicht einer Probe spektral analysiert werden, die mit Beleuchtungslicht einer Wellenlänge von 488 nm angeregt wird. Zu Beginn erfolgt das Festlegen der vier zur Verfügung stehenden Spektralbereiche 99, 101, 103, 105. Der erste Spektralteilbereich 99, ist 10 nm breit und erstreckt sich von 495 nm bis 505 nm. Der zweite Spektralteilbereich 101 erstreckt sich von 505 nm bis 515 nm, der dritte Spektralteilbereich 103 von 515 nm bis 525 nm und der vierte Spektralteilbereich 105 von 525 bis 535 nm. Nach dem ersten Abscannen der Probe erfolgt ein simultanes Verschieben der Spektralbereiche 99, 101, 103, 105 um 40 nm und es beginnt das zweite Abscannen usw.
Fig. 5 illustriert eine Ausführung des Verfahrens. Es soll das Fluoreszenzlicht einer Probe spektral analysiert werden, die mit Beleuchtungslicht der Wellenlängen 488 nm, 568 nm und 747 nm gleichzeitig angeregt wird. Zu Beginn erfolgt das Festlegen der vier zur Verfügung stehenden Spektralbereiche 99, 101, 103, 105. Der erste Spektralteilbereich 99, ist 5 nm breit und erstreckt sich von 495 nm bis 505 nm. Der zweite Spektralteilbereich 101 erstreckt sich von 530 nm bis 535 nm, der dritte Spektralteilbereich 103 von 570 nm bis 580 nm (10 nm breit) und der vierte Spektralteilbereich 105 von 655 bis 665 nm. Nach dem ersten Abscannen der Probe erfolgt ein simultanes Verschieben der Spektralbereiche 99, 101, 103, 105 um ihre jeweilige Breite. Der erste und der zweite werden um je 5 nm verschoben, der dritte und vierte um je 10 nm und es beginnt das zweite Abscannen usw.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Bezugszeichenliste 1 Beleuchtungssystem
3 erster Laser
5 zweiter Laser
7 Beleuchtungslichtstrahl
9 Optik
11 Beleuchtungslichtstrahls
13 Strahlteiler
15 Scanspiegel
17 Scanoptik
19 Tubusoptik
21 Objektiv
23 Probe
25 Licht
27 Detektionslochblende
29 Multibanddetektor
31 Verarbeitungseinheit
33 PC
35 Monitor
37 Prisma
39 erster Teil
41 Lichtfächer
43 erste Spiegelblende
45 zweite Spiegelblende
47 erste Spaltöffnung
49 erster Detektor
51 dritte Spiegelblende
53 vierte Spiegelblende
55 zweite Spaltöffnung
57 zweiter Teil
61 fünfte Spiegelblende
63 sechste Spiegelblende
65 dritte Spaltöffnung
67 dritter Detektor
69 dritter Teil
71 akustooptisches Bauteil
73 weiteres akustooptisches Bauteil
75 Umlenkspiegel
77 Strahlablenkeinrichtung
79 Schallerzeuger
81 Hochfrequenzquelle
83 Strahlfalle
85 Hochfrequenzquelle
87 Computermaus
89 Slider
91 Slider
93 Slider
95 Slider
97 weiterer Slider
99 erster Spektralteilbereich
101 zweiter Spektralteilbereich
103 dritter Spektralteilbereich
105 vierter Spektralteilbereich

Claims

1. Verfahren zur Spektralanalyse des von einer Probe ausgehenden Lichtes mit einem Multibanddetektor gekennzeichnet durch folgende Schritte:

a) Festlegen eines Spektralgesamtbereiches,

b) Festlegen eines ersten Spektralteilbereichs und Festlegen mindestens eines zweiten Spektralteilbereichs, aus dem Spektralgesamtbereich.

c) Simultanes Detektieren des von der Probe ausgehenden Lichtes im ersten und im zweiten Spektralteilbereich und Erzeugen von Detektionswerten,

d) Verschieben des ersten Spektralteilbereichs und Verschieben des zweiten Spektralteilbereichs innerhalb des Spektralgesamtbereichs und

e) wiederholen der Schritte c und d bis das Licht über gesamten Spektralgesamtbereich detektiert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die weiteren Schritte:

- Erzeugen eines Detektionsspektrums aus den Detektionswerten und

- Darstellen des Detektionsspektrums.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Darstellen des Detektionsspektrums eine Falschfarbendarstellung beinhaltet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mit einem Scanmikroskop ausgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Scanmikroskop eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 der DE 43 30 347 A1 beinhaltet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht einem einzigen Rasterpunkt oder einer Zeile oder einer Fläche der Probe entstammt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit Beleuchtungslicht mindestens einer Wellenlänge beleuchtet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Probe ausgehende Licht Fluoreszenzlicht ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass spektrale Anteile des Beleuchtungslichts während des Detektierens ausgeblendet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Festlegen der Spektralbereiche automatisch erfolgt.

11. Scanmikroskop mit einem Multibanddetektor, der von einer Probe ausgehendes Licht in mindestens einem ersten und einem zweiten Spektralteilbereich detektiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektralbereiche simultan verschiebbar sind.

12. Scanmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel zum Festlegen eines Spektralgesamtbereich vorgesehen ist und dass der Spektralgesamtbereich durch das Verschieben des ersten und zweiten Spektralbereichs sukzessive abdeckbar ist.

13. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Festlegen des ersten und zweiten Spektralteilbereichs aus dem Spektralgesamtbereich vorgesehen sind.

14. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zum Festlegen automatisch arbeiten.

15. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das die Spektralbereiche kontinuierlich verschiebbar sind.

16. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 der DE 43 30 347 A1 vorgesehen ist.

17. Scanmikroskop nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Scanmikroskop einen Anregungsstrahlengang und einen Detektionsstrahlengang aufweist, wobei ein akustooptisches Bauteil zur Separierung von Anregungs- und Detektionsstrahlengang vorgesehen ist.

18. Multibanddetektor, der von einer Probe ausgehendes Licht in mindestens einem ersten und einem zweiten Spektralteilbereich detektiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Spektralbereiche simultan verschiebbar sind.