DE10150542A1 - Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzmikroskop - Google Patents

Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzmikroskop

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Abstract

Die Erfindung offenbart ein Scanmikroskop (1) mit einem Laser, der einen Lichtstrahl einer ersten Wellenlänge emittiert und der auf ein optisches Element gerichtet ist, das die Wellenlänge des Lichtstrahles zumindest zum Teil verändert. Es sind Mittel zur Unterdrückung des Lichtes der ersten Wellenlänge in dem in der Wellenlänge veränderten Lichtstrahl vorgesehen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie, wobei eine Probe mit Anregungslicht beleuchtet wird, von der Probe ausgehendes Detektionslicht detektiert wird und ein Abbild zumindest eines Teils der Probe erzeugt wird.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Lichtquelle, die Anregungslicht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, mit mindestens einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht detektiert und mit einem Display zur Darstellung eines Abbildes zumindest eines Teils der Probe.
  • In der Fluoreszenzauflichtmikroskopie wird aus dem Licht einer Lichtquelle, beispielsweise einer Bogenlampe, mit Hilfe eines Farbfilters, dem sog. Anregungsfilter, der Anteil in den mikroskopischen Strahlengang eingekoppelt, der den gewünschten Wellenlängenbereich zur Fluoreszenzanregung aufweist. Die Einkopplung in den Strahlengang des Mikroskops erfolgt mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers, der das Anregungslicht zur Probe reflektiert, während er das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht weitgehend ungehindert passieren lässt. Das von der Probe rückgestreute Anregungslicht wird mit einem Sperrfilter zurückgehalten, der für die Fluoreszenzstrahlung jedoch durchlässig ist. Die optimale Kombination aufeinander abgestimmter Filter und Strahlteiler zu einem leicht austauschbaren modularen Filterblock ist seit langem üblich. Meist sind die Filterblöcke in einem Revolver innerhalb des Mikroskops, als Teil sog. Fluoreszenz-Auflichtilluminatoren, angeordnet, so dass ein schneller und einfacher Austausch ermöglicht ist.
  • Aus der Deutschen Offenlegungsschrift 199 06 757 A1 ist eine optische Anordnung im Strahlengang einer zur Fluoreszenzanregung geeigneten Lichtquelle, vorzugsweise im Strahlengang eines konfokalen Laser-Scanning- Mikroskops, mit mindestens einem spektral selektiven Element zum Einkoppeln des Anregungslichts mindestens einer Lichtquelle in das Mikroskop und zum Ausblenden des am Objekt gestreuten und reflektierten Anregungslichts bzw. der Anregungswellenlänge aus dem über den Detektionsstrahlengang vom Objekt kommenden Lichtes, bekannt. Die optische Anordnung ist zur variablen Ausgestaltung bei einfachster Konstruktion dadurch gekennzeichnet, dass durch das spektral selektive Element Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlänge ausblendbar ist. Alternativ ist eine solche optische Anordnung dadurch gekennzeichnet, dass das spektral selektive Element auf die auszublendende Anregungswellenlänge einstellbar ist. Das selektive Element ist vorzugsweise als akustooptisches Element ausgestaltet. Anordnungen dieser Art werden oft als Acousto-Optical-Beam-Splitter (AOBS) bezeichnet.
  • In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl abgerastert. Hierzu werden oft Laser als Lichtquelle eingesetzt. Aus der EP 0 495 930: "Konfokales Mikroskopsystem für Mehrfarbenfluoreszenz" ist beispielsweise ein Anordnung mit einem einzelnen mehrere Laserlinien emittierenden Laser bekannt. Derzeit werden hierfür meist Mischgaslaser, insbesondere ArKr- Laser, eingesetzt.
  • Auch Festkörperlaser und Farbstofflaser, sowie Faserlaser und Optisch- Parametrische-Oszillatoren (OPO), denen ein Pumplaser vorgeordnet ist, werden häufig verwendet.
  • Aus der Offenlegungsschrift DE 198 53 669 A1 ist eine Ultrakurzpulsquelle mit steuerbarer Mehrfachwellenlängenausgabe offenbart, die insbesondere in einem Multiphotonenmikroskop Anwendung findet. Das System weist einen Ultrakurzimpulslaser zur Erzeugung ultrakurzer optischer Impulse einer festen Wellenlänge und zumindest einen Wellenlängenumwandlungskanal auf.
  • Aus der Patentschrift US 6.097.870 ist eine Anordnung zur Generierung eines Breitbandspektrum im sichtbaren Spektralbereich bekannt. Die Anordnung basiert auf einer mikrostrukturierten Faser, in die das Licht eines Pumplasers eingekoppelt wird. Die Wellenlänge des Pumplichtes wird in der mikrostrukturierten Faser derart verändert, dass das resultierende Spektrum sowohl Wellenlängen oberhalb-, als auch Wellenlängen unterhalb der Wellenlänge des Pumplichtes aufweist.
  • Als mikrostrukturiertes Material findet auch sog. Photonic-band-gap-Material oder "photon crystal fibres", "holey fibers" oder "microstrutured fibers" Verwendung. Es sind auch Ausgestaltungen als sog. "Hollow fiber" bekannt.
  • Als Probe werden beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen präparierte, biologische Gewebe oder Schnitte untersucht. Als Detektoren werden meist Photomultiplier oder Halbleiterdetektoren eingesetzt. Zur simultanen Detektion von Detektionslicht mehrerer Detektionswellenlängen wird das Detektionslicht mit Farbstrahlteilern räumlich auf mehrere Detektoren verteilt.
  • Aus der Deutschen Offenlegungsschrift 199 02 625 A1 ist eine Vorrichtung zur gleichzeitigen Detektion mehrerer Spektralbereiche eines Lichtstrahls, insbesondere zur Detektion des Lichtstrahls eines Laserscanners im Detektionsstrahlengang eines Konfokalmikroskops bekannt. Die Vorrichtung ist zur Realisierung eines einfachen Aufbaus bei geringer Baugröße und unter Vermeidung des Defokussiereffektes gekennzeichnet durch eine Anordnung zum spektralen Auffächern des Lichtstrahls und durch eine Anordnung zur Aufspaltung des aufgefächerten Strahls aus der Dispersionsebene heraus in Spektralbereiche und anschließenden Detektion der ausgespaltenen Spektralbereiche. Vorrichtungen dieser Art gehören zur Gattung der Multibanddetektoren.
  • Eine besondere Schwierigkeit der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, für eine mit Fluoreszenzfarbstoffen präparierte Probe unter gegebenen Randbedingungen die geeignete Anregungswellenlänge und die geeignete Detektionswellenlänge herauszufinden. Derzeit werden die Anregungswellenlängen unter den zur Verfügung stehenden, meiste wenigen Anregungswellenlängen, empirisch ermittelt. Das ausgewählte Anregungslicht ist daher und durch die Beschaffenheit der Lichtquellen auf wenige einzelne Linien beschränkt. Genauso werden geeignete Detektionswellenlängen, in denen die Detektoren detektieren, durch iteratives Ausprobieren in Kombination mit verschiedenen Anregungswellenlängen ermittelt. Eine optimale Anregungs-Detektionslicht-Kombination wird auf diese Weise nicht gefunden. Als Folge kommt es zu unnötig schnellem Ausbleichen der Probe und zu einer schlechten Qualität der Abbildung.
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, das eine effiziente und probenschonende Fluoreszenzuntersuchung einer Probe bei optimierter Abbildungsqualität ermöglicht.
  • Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, dass durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
    • - Definieren eines zweidimensionalen Suchbereichs für Anregungs- und Detektionswellenlänge,
    • - Ermitteln von Qualitätsmerkmalen aus dem Abbild der Probe für Unterbereiche aus dem Suchbereich,
    • - Auswählen eines Unterbereichs aufgrund der ermittelten Qualitätsmerkmale,
    • - Beleuchten der Probe mit Anregungslicht der Anregungswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs und
    • - Detektieren des Detektionslichtes der Detektionswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs.
  • Es ist außerdem eine Aufgabe der Erfindung, ein Fluoreszenzmikroskop anzugeben, das eine effiziente und probenschonende Fluoreszenzabbildung einer Probe bei optimierter Abbildungsqualität ermöglicht.
  • Die Aufgabe wird durch ein Fluoreszenzmikroskop gelöst, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass Mittel zur Vorgabe eines zweidimensionalen Suchbereichs für Anregungs- und Detektionswellenlänge und Mittel zur Auswahl eines Unterbereichs aus dem Suchbereich vorgesehen sind.
  • Die Erfindung hat den Vorteil, dass eine optimierte Fluoreszenzanregung und Detektion ermöglicht wird, wobei ein unnötig schnelles Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe der Probe vermieden ist. Dieser Vorteil wird auch dadurch erreicht, dass nicht nur geeignete diskrete Anregungslinien und geeignete diskrete Detektionslichtlinien, sondern auch geeignete optimale Bereiche von Anregungswellenlängen und Detektionswellenlängen Farbstoffspezifisch ermittelt werden.
  • In einer bevorzugen Ausgestaltung beinhaltet das Verfahren den weiteren Schritt des Abspeicherns der den Unterbereich kennzeichnenden Parameter, um diese bei späteren Untersuchungen und Bildbearbeitungsschritten berücksichtigen zu können.
  • In einer Ausführungsvariante weist das Verfahren die weiteren vorausgehenden Schritte des Aufnehmens eines Übersichtsbildes und des Auswählens eines Bildbereichs aus dem Übersichtsbild auf. Dies hat den Vorteil, dass die Anregungswellenlänge bzw. die Detektionswellenlänge für bestimmte für den Benutzer besonders interessante oder besonders präparierte Bereiche der Probe ermittelbar ist.
  • In einer bevorzugen Ausgestaltung wird der Suchbereich während des Ermittelns von Qualitätsmerkmalen variiert. Die Qualitätsmerkmale können insbesondere die Helligkeit, den Kontrast, die Auflösung, die Schärfe oder die Lebensdauer des Abbildes oder Kombinationen aus diesen Größen sein.
  • In dem Fluoreszenzmikroskop sind Mittel zur Bestimmung von Qualitätsmerkmalen aus dem Abbild der Probe vorgesehen. Hier sind bei einen Scanmikroskop u. a. die Scangeschwindigkeit, die Scanrate, die Pixelgröße des Bildes in Bezug auf Probenausschittsgröße, Over- oder Undersampling und die Pinholegröße (bei einem konfokalen Mikroskop) zu berücksichtigen.
  • Zur Ermittlung der anzuzeigenden Größen werden die Intensitätsdaten des Detektionslichtes mindestens zweier nacheinander aufgenommener Bilder ausgewertet. Ein Verfahren zur Ermittlung der Bleichrate beruht darauf, die Häufigkeiten H des Auftretens verschiedener Intensitäten I, sowohl für das erste (I1), als auch für das zweite (I2) in je einem Intensitätshistogramm aufzutragen und jeweils die Histogrammschwerpunkte, die gleich der mittleren Pixelintensität des jeweiligen Bildes ist, zu errechnen.

  • Aus einer Verschiebung des Histogrammschwerpunktes läßt sich der Bleichfaktor B = 1 - I1/I2 berechnen und dem Benutzer anzeigen. Hierzu sind Balkendiagramme, die auf einem Display angezeigt werden vorteilhaft.
  • Die Ermittlung des Sättigungsgrades der Fluoreszenzfarbstoffe ist nur durch Änderung der Systemparameter, beispielsweise der Beleuchtungslichtleistung, möglich. Eine Erhöhung der Beleuchtungslichtleistung, vorzugsweise um wenige Prozent, führt, falls die Fluoreszenzfarbstoffe nicht schon vollständig in der Sättigung sind, zu einer steileren (I1, I2)-Geraden. Liegt die gewählte Beleuchtungslichtleistung innerhalb des linearen Bereiches der Quantenausbeuteverteilung, so ist das Verhältnis der Steigungen der Korrelationsgeraden gleich dem Verhältnis der Beleuchtungslichtleistungen bei der Abrasterung von Bild 1 zu der bei der Abrasterung von Bild 2. Eine Abweichung von dieser Gleichheit kann als Maß für den Sättigungsgrad verwendet und angezeigt werden.
  • Die vorzugsweise vorgesehene Anzeigevorrichtung zum Anzeigen der Qualitätsmerkmale beinhaltet auf einem Display dargestellte grafische Elemente, wie Graphen oder Balkendiagramme. Die Anzeige kann auch zahlenmäßig erfolgen. Der Suchbereich wird ebenfalls vorzugsweise graphisch auf einem Display, beispielsweise als Fläche in einem kartesischen Koordinatensystem dargestellt, wobei Änderungen des Suchbereichs durch den Benutzer durch Änderung der Fläche mit einem Zeigegerät, beispielsweise einer PC-Maus, vorgenommen werden.
  • Das Ermitteln der Unterbereiche erfolgt vorzugsweise automatisch. Hierzu ist eine Vorrichtung zum automatischen Ermitteln geeigneter Unterbereiche vorgesehen, die insbesondere das Bleichverhalten und den Sättigungsgrad berücksichtigt.
  • Die Vorrichtung zum automatischen Auswählen des Unterbereichs beinhaltet einen Computer, der anhand eines vorgebbaren Algorithmus eine vorgebbare Suchstrategie verfolgt. Der ausgewählte Unterbereich definiert die Anregungswellenlängen des Anregungslichts. Vorzugsweise handelt es sich um ein Wellenlängenband.
  • Zur Erzeugung breitbandigen Anregungslichtes wird In einer bevorzugen Ausgestaltung eine Lichtquelle eingesetzt, die ein mikrostrukturiertes optisches Element, beispielsweise aus photonic-band-gap-Material, beinhaltet. Das mikrostrukturierte optische Element ist in einer bevorzugten Ausgestaltung des Scanmikroskops aus einer Vielzahl von mikrooptischen Strukturelementen aufgebaut, die zumindest zwei unterschiedliche optische Dichten aufweisen. Ganz besonders bevorzugt ist eine Ausgestaltung, bei der das optische Element einen ersten Bereich und einen zweiten Bereich beinhaltet, wobei der erste Bereich eine homogene Struktur aufweist und in dem zweiten Bereich eine mikroskopische Struktur aus mikrooptischen Strukturelementen gebildet ist. Von Vorteil ist es außerdem, wenn der erste Bereich den zweiten Bereich umschließt. Die mikrooptischen Strukturelemente sind vorzugsweise Kanülen, Stege, Waben, Röhren oder Hohlräume. Das mikrostrukturierte optische Element besteht in einer anderen Ausgestaltung aus nebeneinander angeordnetem Glas- oder Kunststoffmaterial und Hohlräumen. Besonders zu bevorzugen ist die Ausführungsvariante, bei der das mikrostrukturierte optische Element aus Photonic-Band-Gap-Material besteht und als Lichtleitfaser ausgestaltet ist. Vorzugsweise ist zwischen dem Laser und der Lichtleitfaser eine optische Diode vorgesehen, die Rückreflexionen des Lichtstrahles die von, den Enden der Lichtleitfaser herrühren, unterdrückt. Eine ganz besonders bevorzugte und einfach zu realisierende Ausführungsvariante beinhaltet als mikrostrukturiertes optisches Element eine herkömmliche Lichtleitfaser mit einem Faserkerndurchmesser von ca. 9 µm, die zumindest entlang eines Teilstücks eine Verjüngung aufweist. Lichtleitfasern dieser Art sind als sog. "tapered fibers" bekannt. Vorzugsweise ist die Lichtleitfaser insgesamt 1 m lang und weist eine Verjüngung auf einer Länge von 30 mm bis 90 mm auf. Der Durchmesser der Lichtleitfaser beträgt in einer bevorzugten Ausgestaltung im Bereich der Verjüngung ca. 2 □m. Der Faserkerndurchmesser liegt entsprechend im Nanometerbereich. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform insbesondere mit einer Lichtquelle, die mikrostrukturiertes optisches Material beinhaltet, ist ein Pulslaser vorgesehen, der vorzugsweise Lichtpulse einer Pulsenergie, die größer als 1 nJ ist, emittiert.
  • In einer anderen Ausführungsvariante beinhaltet die Lichtquelle einen Mischgaslaser, der in der Lage ist Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen zu emittieren. Der Laser kann auch als Festkörper-, Gas oder Farbstofflaser oder als Optisch-Parametrischer-Oszillator (OPO) ausgeführt sein.
  • In einer bevorzugen Ausgestaltung des Fluoreszenzmikroskops beinhaltet die Lichtquelle ein Selektionsmittel zum Selektieren der Anregungswellenlängen. Das Selektionsmittel ist vorzugsweise ein akustooptisches Element, beispielsweise ein AOTF (acousto optical tunable filter), ein AOD (acousto optical deflector) oder ein AOBS (acousto optical tunable filter). Das Selektionsmittel kann auch einen Interferenzfilter, ein Prisma, einen Flüssigkristallfilter, einen Polarisationsfilter, einen Fabry-Perot-Filter, einen Sagnac-Filter oder ein Farbstrahlteiler umfassen.
  • Die Lichtquelle beinhaltet vorzugsweise eine Vorrichtung zur Variierung der Leistung des Anregungslichtes beinhaltet. Ganz besonders vorteilhaft ist es hierbei, die Lichtquelle derart auszugestalten, dass die Leistung des Anregungslichtes bezüglich mindestens einer auswählbaren Wellenlänge oder mindestens eines auswählbaren Wellenlängenbereichs variierbar oder vollständig ausblendbar ist. Ganz besonders vorteilhaft ist eine Ausgestaltung, bei der das Anregungslicht des ausgewählten Unterbereichs durch räumlich spektrale Aufspaltung von Primärlicht der Lichtquelle und mit einer geeigneten variablen Blenden- oder Filteranordnung, die spektrale Anteile unterdrückt oder ganz auszublendet erzeugt wird, wobei anschließend die verbliebenen Spektralanteile wieder zu einem Anregungslichtstrahl vereinigt sind. Zur räumlich spektralen Aufspaltung ist beispielsweise ein Prisma oder ein Gitter verwendbar.
  • Besonders vorteilhaft ist eine Ausführungsform, die ein Bedienelement zur Einstellung der Lichtleistung und der spektralen Zusammensetzung des Anregungslichtes des ausgewählten Unterbereichs aufweist. Dies kann ein Bedienpult oder ein PC sein. Die Einstelldaten werden vorzugsweise in Form von elektrischen Signalen an die Vorrichtung zur Beleuchtung bzw. an die Vorrichtung zur Variierung der Leistung des spektral verbreiterten Lichtes übertragen. Besonders anschaulich ist die Einstellung über Schieber (Slider), die auf einem Display eines PCs angezeigt sind und beispielsweise mit einer Computermaus bedient werden.
  • In einer bevorzugen Ausgestaltung ist ein Speicher vorgesehen, in dem Daten bezüglich des Unterbereichs und der Qualitätsmerkmale speicherbar sind. Das Detektionslicht beinhaltet die Detektionswellenlängen des Unterbereichs. Vorzugsweise weist das Detektionslicht zumindest ein Wellenlängenband auf. Der Detektor ist in einer bevorzugen Ausgestaltung als Multibanddetektor ausgeführt, der vorzugsweise durch räumlich spektrales Aufspalten des Detektionslichtes eine Mehrkanaldetektion ermöglicht. Der Detektor beinhaltet zumindest einen Photomultiplier oder einen Halbleiterdetektor.
  • In einer besonderen Ausführungsvariante ist beinhaltet der Detektor ein Selektionsmittel zum Selektieren der Detektionswellenlängen, das als ein akustooptisches Element oder einen Interferenzfilter oder ein Prisma oder ein Flüssigkristallfilter oder ein Polarisationsfilter oder ein Fabry-Perot-Filter oder ein Sagnac-Filter oder ein Farbstrahlteiler ausgeführt sein kann.
  • In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltung ist das Fluoreszenzmikroskop ein Konfokalmikroskop.
  • In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
  • Fig. 1 eine erfindungsgemäßes konfokales Scanmikroskop,
  • Fig. 2 eine Ausgestaltung der Bildschirmanzeige der Qualitätsparameter und
  • Fig. 3 eine Darstellung des Suchbereichs und verschiedener Unterbereiche.
  • Fig. 1 eine erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop, das als konfokales Scanmikroskop ausgeführt ist. Das Fluoreszenzmikroskop weist eine Lichtquelle 1 auf, die einen Laser 3 beinhaltet, der als diodenlasergepumpter, modengekoppelter Ti:Saphir-Laser ausgeführt ist und der einen gepulsten Lichtstrahl 5, der gestrichelt gezeichnet ist, emittiert. Die Dauer der Lichtpulse beträgt ca. 100 fs bei einer Repetitionsrate von ca. 80 MHz. Der Lichtstrahl 5 wird mit der Fokussieroptik 7 auf ein mikrostrukturiertes optisches Element 9, das aus einer Lichtleitfaser aus Photonic-band-Gap-Material besteht, fokussiert. In dem mikrostrukturierten optischen Element wird das Licht des Lasers spektral verbreitert. Das aus der Lichtleitfaser 9 austretende, spektral verbreiterte Licht, wird mit Hilfe der Optik 11 zu einem kollimierten, spektral verbreiterten Lichtstrahl 13 geformt. Das Spektrum des spektral verbreiterten Lichts reicht von ca. 300 nm bis 1600 nm, wobei die Lichtleistung über das gesamte Spektrum weitgehend konstant ist. Ein Computer 15 steuert entsprechend der dem ausgewählten Unterbereich ein Selektionsmittel 17, das als AOTF 19 (acousto optical tunable filter) ausgeführt ist. Der aus der Lichtquelle 1 austretende Anregungslichtstrahl 21 weist die Anregungswellenlängen der ausgewählten Unterbereichs auf.
  • Der Anregungslichtstrahl 21 wird auf eine Beleuchtungsblende 23 fokussiert und gelangt über den Hauptstrahlteiler 25 zum Scanspiegel 27, der den Anregungslichtstrahl 21 durch die Scanoptik 29, die Tubusoptik 31 und das Objektiv 33 hindurch über die Probe 35 führt. Das von der Probe 35 ausgehende Detektionslicht 37, das in der Zeichnung gestrichelt dargestellt ist, gelangt durch das Objektiv 33, die Tubusoptik 31 und die Scanoptik 29 hindurch zurück zum Scanspiegel 27 und dann zum Hauptstrahlteiler 25, passiert diesen und wird nach Durchlaufen der Detektionsblende 39 mit dem Prisma 41 räumlich spektral aufgespalten und von der Feldlinse 43 fokussiert. Das Prisma 41 ist Bestandteil des Multibanddetektors 45, der mit den Spiegelblenden 47, 49 verschiedene spektrale Anteile des Detektionslichtes den Photomultiplieren 51 und 53 zuführt. Die Spektralen Anteile entsprechen den Detektionswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs. Die Spiegelblenden 47, 49 werden mit den Stellmotoren 55, 57 bewegt, die von dem Computer 15 entsprechend dem ausgewählten Unterbereich gesteuert werden. Der Multibanddetektor 45 beinhaltet vorzugsweise wesentlich mehr Kanäle; der besseren Anschaulichkeit halber sind jedoch nur zwei Kanäle gezeigt. Auf dem Monitor 59 sind die Qualitätsparameter des Abbildes 61 in einem ersten Dialogfenster 63 dargestellt. In einem zweiten Dialogfenster 65 ist der Suchbereich 67 in Form eines Koordinatensystems und der ausgewählte Unterbereich 69 dargestellt.
  • Fig. 2 zeigt eine Ausgestaltung der Bildschirmanzeige der Qualitätsparameter, die in einem ersten Dialogfenster 65 auf dem Monitor 59 dargestellt ist. In einem ersten Teilfenster 71 ist das Rauschverhalten der Probe in Form eines Säulendiagramms dargestellt. In einem zweiten Teilfenster 73 ist die Bleichrate des Fluorochroms in Form eines weiteren Säulendiagramms angezeigt. In dem dritten Teilfenster 75 ist die Sättigung des Fluorochroms prozentual angezeigt. In einem vierten Teilfenster 77 ist gezeigt, ob Über- oder Untersampling vorliegt.
  • Fig. 3 zeigt eine Darstellung des Suchbereichs und verschiedener Unterbereiche 79 in Form eines Koordinatensystems 65 auf dessen Abszisse die Anregungswellenlängen 81 des ausgewählten Unterbereichs 69 und auf dessen Ordinate die Detektionswellenlängen 83 des ausgewählten Unterbereichs 69 dargestellt sind. Die Auswahl des Unterbereichs erfolgt vorzugsweise automatisch aufgrund der ermittelten Qualitätsparameter. Die Unterbereiche 79 sind der besseren Anschaulichkeit halber in Form von Rechtecken dargestellt. Im Allgemeinen handelt es sich um wesentlich kompliziertere unzusammenhängende Formen.
  • Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen. Bezugszeichenliste 1 Lichtquelle
    3 Laser
    5 Lichtstrahl
    7 Fokussieroptik
    9 mikrostrukturiertes optisches Element
    11 Optik
    13 Lichtstrahl
    15 Computer
    17 Selektionsmittel
    19 AOTF
    21 Anregungslichtstrahl
    23 Beleuchtungsblende
    25 Hauptstrahlteiler
    27 Scanspiegel
    29 Scanoptik
    31 Tubusoptik
    33 Objektiv
    35 Probe
    37 Detektionslicht
    39 Detektionsblende
    41 Prisma
    43 Feldlinse
    45 Multibanddetektors
    47 Spiegelblende
    49 Spiegelblende
    51 Photomultiplier
    53 Photomultiplier
    55 Stellmotor
    57 Stellmotor
    61 Monitor
    63 erstes Dialogfenster
    65 zweites Dialogfenster
    67 Suchbereich
    69 Unterbereich
    71 erstes Teilfenster
    73 zweites Teilfenster
    75 drittes Teilfenster
    77 viertes Teilfenster
    79 Unterbereiche
    81 Anregungswellenlängen
    83 Detektionswellenlängen

Claims (30)

1. Verfahren zur Fluoreszenzmikroskopie, wobei eine Probe mit Anregungslicht beleuchtet wird und von der Probe ausgehendes Detektionslicht detektiert wird und ein Abbild zumindest eines Teils der Probe erzeugt wird, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- Definieren eines zweidimensionalen Suchbereichs für Anregungs- und Detektionswellenlänge,
- Ermitteln von Qualitätsmerkmalen aus dem Abbild der Probe für Unterbereiche aus dem Suchbereich,
- Auswählen eines Unterbereichs aufgrund der ermittelten Qualitätsmerkmale,
- Beleuchten der Probe mit Anregungslicht der Anregungswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs und
- Detektieren des Detektionslichtes der Detektionswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt:
- Abspeichern der den Unterbereich kennzeichnenden Parameter.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die weiteren vorausgehenden Schritte:
- Aufnehmen eines Übersichtsbildes
- Auswählen eines Bildbereichs aus dem Übersichtsbild.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Suchbereich während des Ermittelns von Qualitätsmerkmalen variiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Qualitätsmerkmale die Helligkeit und/oder der Kontrast und/oder die Auflösung und/oder die Schärfe und/oder die Lebensdauer des Abbildes sind.
6. Fluoreszenzmikroskop mit einer Lichtquelle, die Anregungslicht zur Beleuchtung einer Probe emittiert, mit mindestens einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht detektiert und mit einem Display zur Darstellung eines Abbildes zumindest eines Teils der Probe, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Vorgabe eines zweidimensionalen Suchbereichs für Anregungs- und Detektionswellenlänge und Mittel zur Auswahl eines Unterbereichs aus dem Suchbereich vorgesehen sind.
7. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Bestimmung von Qualitätsmerkmalen aus dem Abbild der Probe vorgesehen sind.
8. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anzeigevorrichtung zum Anzeigen der Qualitätsmerkmale vorgesehen ist.
9. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung zum automatischen Auswählen geeigneter Unterbereiche vorgesehen sind.
10. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zum automatischen Auswählen des Unterbereichs einen Computer beinhaltet, der anhand eines vorgebbaren Algorithmus eine vorgebbare Suchstrategie verfolgt.
11. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht die Anregungswellenlängen des ausgewählten Unterbereichs aufweist.
12. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht ein Wellenlängenband aufweist.
13. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle photonic-band-gap-Material beinhaltet.
14. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine mikrostrukturierte Lichtleitfaser beinhaltet.
15. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine Lichtleitfaser mit einer Verjüngung aufweist.
16. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle einen Laser beinhaltet.
17. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser ein Mischgaslaser ist.
18. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Laser ein Pulslaser ist.
19. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle ein Selektionsmittel zum Selektieren der Anregungswellenlängen beinhaltet.
20. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsmittel ein akustooptisches Element oder einen Interferenzfilter oder ein Prisma oder ein Flüssigkristallfilter oder ein Polarisationsfilter oder ein Fabry-Perot-Filter oder ein Sagnac-Filter oder ein Farbstrahlteiler ist.
21. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Speicher vorgesehen ist, in dem Daten bezüglich des Unterbereichs und der Qualitätsmerkmale speicherbar sind.
22. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionslicht Detektionswellenlängen des Unterbereichs aufweist.
23. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionslicht zumindest ein Wellenlängenband aufweist.
24. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Multibanddetektor ist.
25. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor zumindest einen Photomultiplier beinhaltet.
26. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor zumindest einen Halbleiterdetektor beinhaltet.
27. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Mittel zum räumlichen Aufspalten des Detektionslichtes beinhaltet.
28. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor ein Selektionsmittel zum Selektieren der Detektionswellenlängen beinhaltet.
29. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsmittel ein akustooptisches Element oder einen Interferenzfilter oder ein Prisma oder ein Flüssigkristallfilter oder ein Polarisationsfilter oder ein Fabry-Perot-Filter oder ein Sagnac-Filter oder ein Farbstrahlteiler ist.
30. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 6 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzmikroskop ein Konfokalmikroskop ist.
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