DE10339311B4

DE10339311B4 - System und Verfahren zur Einstellung eines Fluoreszenzspektralmesssystems zur Mikroskopie

Info

Publication number: DE10339311B4
Application number: DE10339311A
Authority: DE
Inventors: Frank Olschewski
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-08-27
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2023-08-28
Also published as: DE10339311A1; US7319520B2; US20050046836A1

Abstract

Verfahren zur Einstellung eines Spektralscanmikroskops, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Erzeugen eines Beleuchtungslichts (3) durch ein Beleuchtungssystem (1), das mindestens einen Laser besitzt, der Licht einer Wellenlänge aussendet, wobei das Beleuchtungssystem (1) Beleuchtungslicht (3) erzeugt, das einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich von 300 nm bis 1600 nm besitzt,
b) Übermitteln des mindestens einen im Objekt vorhandenen Farbstoffs an ein Rechnersystem (23) und Auslesen der in einer Datenbank abgelegten zugehörigen Anregungs- und Emissionsspektren,
c) Eingabe (87) von Optimierungszielen, wie die Intensität des Beleuchtungslichts (3), das Signal-Rausch-Verhältnis, das Übersprechverhältnis und/oder das Fehldetektionsrisiko, die der Benutzer über ein Peripheriegerät (27) des Spektralmikroskops (100) ausführt,
d) Berechnen für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff eines Bandes Beleuchtungslichts (3) und Berechnen für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff eines Bandes des Detektionslichts (17), wobei die aus der Datenbank ausgelesenen Anregungs- und Emissionsspektren herangezogen werden und das Berechnen des Bandes des Beleuchtungslichts...

Description

Die Erfindung betrifft ein System zur Beleuchtung und Detektion von Fluoreszenzsignalen. Ferner betrifft die Erfindung ein Spektralmikroskop.
Desweiteren offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Beleuchtungs- und Detektionsparameter bei der Erfassung von Fluoreszenzverfahren. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop.

Die Patentschrift US 6,097,870 offenbart eine Anordnung zur Generierung eines Breitbandspektrums im sichtbaren und infraroten Spektralbereich. Die Anordnung basiert auf einer mikrostrukturierten Faser, in die das Licht eines Pumplasers eingekoppelt wird. Das Pumplicht wird in der mikrostrukturierten Faser durch nichtlineare Effekte verbreitert. Als mikrostrukturierte Faser findet auch sog. Photonic-Band-Gap-Material oder "photon crystal fibres", „holey fibers" oder „micrpstructured fibers" Verwendung. Es sind auch Ausgestaltungen als sog. „Hollow fiber" bekannt.

Bogenlampen sind als breitbandige Lichtquellen bekannt und werden in vielen Bereichen verwendet. Exemplarisch sei hier die US-Patentschrift 3,720,822 "XENON PHOTOGRAPHY LIGHT" genannt, die eine Xenon-Bogenlampe zur Befeuchtung in der Photografie offenbart.

Die deutsche Patentanmeldung DE 100 06 800 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Selektion und Detektion mindestens eines Spektralbereichs eines spektral aufgefächerten Lichtstrahls (SP-Modul). Im aufgefächerten des von dem zu untersuchenden Objekt kommenden Lichts sind Selektionsmittel vorgesehen, die als Schieber ausgebildet sind, um somit Teile des aufgefächerten Lichtstrahls auf verschiedene Detektoren zu lenken. Die Signale der Detektoren werden dann zu Bilderzeugung verwendet. Die DE 100 06 800 A1 offenbart nicht die Betätigung der Schieber in der Art und Weise, dass eine schnelle und zuverlässige Detektion eines speziellen Spektrums möglich ist.

Aus der Anmeldung US-5,791,024 ist ein Verfahren zur Klassifizierung von Chromosomen bekannt. Bei der Detektion von Chromosomdefekten werden die Chromosomen mit fünf verschiedenen, fluoreszierenden Farbstoffen versehen. Aus der Anlagerung der Farbstoffe an die Chromosomen können diese eindeutig klassifiziert werden. Aus dem Vergleich mit einer Referenz kann auf die vorhandenen Gendefekte geschlossen werden. Da durch die am Chromosom angelagerten Farbstoffe, dieses Chromosom ein charakteristisches Spektrum aussendet, ist somit eine eindeutige Bestimmung möglich. Das hier vorgestellte Verfahren ist besonders für die Bestimmung der Spektren der einzelnen Chromosomen geeignet, lässt sich aber nicht auf die Fluoreszenzmessungen mit einen Scanmikroskop anwenden.

Aus der DE 102 27 111 A1 ist ein Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop bekannt. Es werden Verfahren und Systeme zur Erfassung maximaler Information von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt erfasst. Eine optimale Informationsakquisition ist mit diesem Verfahren jedoch noch nicht möglich.

Aus der DE 198 29 944 A1 ist ein Verfahren zur Gerätekonfiguration von konfokalen Mikroskopen, vorzugsweise von Laser-Scan-Mikroskopen bekannt, bei denen Laserlicht mit einer oder mehreren Spektrallinien erzeugt und auf eine Probe gerichtet wird, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält oder auf die ein Fluoreszenzfarbstoff aufgebracht ist. Dabei werden die Excitationswellenlängen und die Emissionswellenlängen verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in getrennten Datensätzen erfasst und diese in einem Datenspeicher abgelegt. Ebenso werden die mit dem Mikroskop einstellbaren Laserspektren, die auf die Probe zu richten sind, und die mit den vorhandenen Filtern erzielbaren Transmissionsspektren in Datensätzen erfasst und diese Datensätze gespeichert. Aus einer rechnerischen Verknüpfung dieser Datensätze werden Vorgaben für die Konfiguration des Mikroskops ermittelt.

Aus der DE 102 06 979 A1 ist ein Verfahren zum Benutzertraining für ein Scanmikroskop bekannt, das die schnelle und probenschonende Einstellung eines Scanmikroskops ermöglicht. Es ist möglich, dass ein gesamtes Spektrum einer Probe aufgenommen wird. Dieses Spektrum kann dann zum Training aus dem Speicher des Rechnersystems abgerufen werden. Der Benutzer kann dann in dem ihm auf dem Userinterface dargestellten Einstellmöglichkeiten Änderungen vornehmen und das Ergebnis hieraus ebenfalls auf dem Userinterface begutachten. Ohne Zeitdruck kann dies solange durchgeführt werden, bis der Benutzer mit dem auf dem Userinterface dargestellten Ergebnis zufrieden ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Erfassung der optimalen Farbinformation von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt oder mit fluoreszierenden Markern versehenen Objekt zu schaffen.

Die objektive Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es ein System zu schaffen, mit dem die Erfassung der optimalen Farbinformation von einem fluoreszierenden mikroskopischen Objekt ermöglicht ist.

Die objektive Aufgabe wird durch ein System gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs 12 aufweist.

Das Verfahren hat den Vorteil, dass zunächst ein Beleuchtungslicht aus mindestens einem Laser erzeugt wird, der Licht einer Wellenlänge aussendet, wobei das erzeugte Beleuchtungslicht einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich umfasst. Die im Objekt vorhandenen Farbstoffe werden an ein Rechnersystem übermittelt und die in einer Datenbank abgelegten zugehörigen Anregungs- und Emissionsspektren werden für weitere Berechnungen aus der Datenbank ausgelesen. Für jeden im Objekt vorhandenen Farbstoff wird ein Band des Beleuchtungslichts berechnet. Ebenso wird für jeden im Objekt vorhandenen Farbstoff ein Band des Detektionslichts berechnet. Die aus der Datenbank ausgelesenen Anregungs- und Emissionsspektren werden zur Berechnung herangezogen.

Das System zur Einstellung eines Fluoreszenz-Spektralmesssystem bei der Mikroskopie umfasst ein Beleuchtungssystem, das aus dem Licht eines Lasers einen kontinuierlichen Wellenbereich erzeugt und ein Beleuchtungslicht definiert. Ferner ist ein SP Modul vorgesehen, das ein von einem Objekt ausgehendes Detektionslicht empfängt. Ferner ist ein optisches Umlenkmittel vorgesehen, das sowohl im Beleuchtungslicht als auch im Detektionslicht vorgesehen ist. Ein Rechnersystem umfasst eine Datenbank, in der mehrere Anregungs- und Emissionsspektren von Farbstoffen abgelegt sind. Das Rechnersystem besitzt ein Mittel zum Berechen eines Bandes des Beleuchtungslichts für jeden im Objekt vorhandenen Farbstoff und zum Berechnen eines Bandes des Detektionslichts für jeden im Objekt vorhandenen Farbstoff, wobei die Berechnung unter dem Gesichtspunkt durchgeführt wird, dass eine optimale Informationsausbeute erzielt wird. Es sind Mittel zum Einstellen des berechneten Bandes im Beleuchtungslicht und Mittel zum Einstellen des berechneten Bandes im Detektionslicht vorhanden.

Das Einstellen kann automatisch erfolgen. Das Berechen des Bandes des Beleuchtungslichts und des Detektionsbands erfolgt durch Modellierung und Optimierung der optischen Konfiguration des Spektralmikroskops, wobei mindestens eine von Benutzer festzulegende Randbedingung herangezogen wird. Das Band des Beleuchtungslichts wird über einen AOBS eingestellt. Das Band des Detektionslichts wird mittels eines SP-Moduls eingestellt.

Bei der Detektion wird pro Pixel ein spektraler Intensitätsvektor I^Det detektiert, der sich als Linearkombination der Emmissions-Spektren

der im Objekt eingebrachten Farbstoffe zusammensetzt. Ebenso wird für die Anregung pro Pixel ein spektraler Intensitätsvektor I^Ex erzeugt, der sich als Linearkombination der Anregungs-Spektre

der im Objekt eingebrachten Farbstoffe zusammensetzt.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Scanmikroskops, wobei dem Detektor ein SP Modul vorgeschaltet ist;
2 eine schematische Darstellung des SP-Moduls im Detail,
3 ein Beleuchtungssystem für eine Scanmikroskop gemäß der gegenwärtigen Erfindung;
4 ein Ausführungsform eines optischen Elements, das zur Lenkung des Beleuchtungslichtstrahls und des Detektionslichtstrahls vorgesehen ist;
5 ein graphische Darstellung der Prozesse im Spektralmikroskop und dem Objekt;
6 eine graphische Darstellung des Verfahrens
7 die Elemente eines User Interface zur Einstellung des Systems.
In 1 ist das Ausführungsbeispiel eines konfokalen Scanmikroskops 100 schematisch gezeigt. Dies soll jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefasst werden und dem Fachmann ist hinreichend bekannt das die gleichen erfindungsrelevanten Komponenten auch in Fluorometern, Cytometern und Mikroskopsystem anderer Bauart verbaut sind. Das von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende Beleuchtungslicht 3 wird von einem Strahlteiler oder einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Bevor das Beleuchtungslicht 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft, passiert dieses ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 9, der das Beleuchtungslicht 3 durch eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw. durch ein Objekt 15 führt. Das Beleuchtungssystem 1 kann derart ausgestaltet sein, dass es aus dem Licht eines Lasers, Weisslicht erzeugt und ein Teilband bzw. einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich aus dem Weisslichtspektrum separiert und weiter geleitet wird. Hierzu ist ein mikrostrukturiertes Element 8 oder eine tapered Glasfaser vorgesehen. (Der Aufbau zur Erzeugung von Weislicht ist in 3 genauer beschrieben) Das Beleuchtungslicht 3 wird bei nicht transparenten Objekten 15 über die Objektoberfläche geführt. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten) oder transparenten Objekten kann das Beleuchtungslicht 3 auch durch das Objekt 15 geführt werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf. mit einem geeigneten Farbstoff präpariert (nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe werden durch das Beleuchtungslicht 3 angeregt und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des Spektrums aus. Dieses vom Objekt 15 ausgehende Licht ist ein Detektionslicht 17. Dieses gelangt durch die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses und gelangt über ein Detektionspinhole 18 auf mindestens einen Detektor 36, 37, der als Photomultiplier ausgeführt ist. Es ist dem Fachmann klar, dass auch andere Detektionskomponenten, wie z.B. Dioden, Diodenarrays, Photomultiplierarrays, CCD Chips oder CMOS Bildsensoren eingesetzt werden können. Das vom Objekt 15 ausgehende bzw. definierte Detektionslicht 17 ist in 1 als gestrichelte Linie dargestellt. In den Detektoren 36, 37 werden elektrische, zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom Objekt 15 Licht mit einem charackteristischen Spektrum ausgesandt wird, ist es sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 36, 37 ein SP-Modul 20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor 36, 37 erzeugten Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet. Das Peripheriegerät kann z.B. ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung des Scanmikroskops 100 erhält oder den aktuellen Setup und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner ist mit dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel zugeordnet, das z.B. aus einer Tastatur 28, einer Einstellvorrichtung 29 für die Komponenten des Mikroskopsystems und einer Maus 30 besteht.
Das SP Modul 20 (2) ist derart ausgebildet, dass es einen kompletten Lambda Scan aufnehmen kann, d.h., das alle vom Objekt 15 ausgehenden Wellenlängen aufgezeichnet werden. Die Daten werden an das Rechnersystem 23 übertragen und können dann in einer von Benutzer bestimmbaren Weise auf dem Display 27 dargestellt werden. Das Detektionslicht 17 wird mit einem Prisma 31 räumlich spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters. Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35, die Mittel zur spektralen, räumlichen Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
Wie aus 2 ersichtlich ist, kann mittels der Spiegelblendenanordnung 34, 35 ein gewünschter Teil des Spektrums des Detektionslichts 17 ausgewählt bzw. systematisch selektiert werden. In dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel ist die Spaltblendenanordnung 34, 35 mit einem ersten und einem zweiten Schieber 40 und 41 ausgestattet. Es ist selbstverständlich, dass für die Selektion von mehr als zwei spektralen Bereichen eine entsprechende Anzahl von Schiebern vorgesehen sein muss. Eine entsrpechende Erhöhung der Spiegelschieber ergibt direkt eine Erhöhung der parallel zu erfassenden spektralen Bändern. Dem ersten Schieber 40 ist ein erster Motor 44 und dem zweiten Schieber 41 ist ein zweiter Motor 45 zugeordnet. Die Motore 44 und 45 veranlassen eine gemäß den nachstehenden Verfahren beschriebene Verstellung der Schieber 40 und 41. Durch die Verstellung der Schieber 40 und 41 passiert nur ein Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 des Detektionslichts 17, der nur Licht des vorgewählten Spektralbereichs die Spiegelblendenanordnung 34, 35 und wird von dem Detektor 36, der als Photomultiplier ausgeführt ist detektiert. Ein anderer Teil des aufgespaltenen Lichtfächers 32 wird an der Spiegelblendenanordnung 35 reflektiert und gelangt zu Detektor 37, der ebenfalls als Photomultiplier ausgeführt ist.
3 zeigt das Beleuchtungssystem 1, das einen Laser 10 beinhaltet, der als diodenlasergepumpter, modengekoppelter Ti:Saphir-Laser ausgeführt ist und der einen gepulsten Lichtstrahl 50 (entspricht dem Beleuchtungslichtstrahl aus 1), der gestrichelt gezeichnet ist, emittiert. Die Dauer der Lichtpulse beträgt ca. 100 fs bei einer Repetitionsrate von ca. 80 MHz. Der Lichtstrahl 50 wird mit der Fokussieroptik 51, die als Zoomoptik ausgestaltet und entlang der Fortpflanzungsrichtung des Lichtstrahles verschiebbar angeordnet ist, auf ein mikrostrukturiertes optisches Element 8, das aus einem Kristall aus Photonic-band-Gap-Material besteht, fokussiert. In dem mikrostrukturierten optischen Element 8 wird das Licht des Lasers 10 spektral verbreitert. Alle Komponenten befinden sich in einen Gehäuse 54 mit einer Lichtaustrittsöffnung 55, durch die das spektral verbreiterte Licht 56, als divergent verlaufender Strahl, das Gehäuse verlässt. Das Spektrum des spektral verbreiterten Lichts 56 reicht von ca. 300 nm bis 1600 nm, wobei die Lichtleistung über das gesamte Spektrum weitgehend konstant ist. Das mikrostrukturierte optische Element 8 kann in einem Ausführungsbeispiel ebenfalls aus einem Lichtleiter bestehen, der mit einer Querschnittsverjüngung versehen. In dem Lichtleiter wird das Emissionslicht des Lasers 10 spektral verbreitert Das Beleuchtungslicht 3 (siehe 1) gelangt zu dem Umlenkmittel 5, der aus einem akustooptischen Element ausgebildet ist. Das akustooptische Element ist als AOTF (Acustooptical Tunable Filter) ausgeführt, der das Beleuchtungslicht 3 gemäß eines vom Benutzer ausgewählten Bandes, das von λ – Δλ/2 bis λ + Δλ/2 reicht, zur Untersuchung des Objekts reduziert.
4 zeigt das optische Umlenkmittel 5 im Detail, das dem SP-Modul 20 vorgeschaltet ist. Das optische Umlenkmittel 5 weist einen ersten Port 60, einen zweiten Port 61, und einen dritten Port 62 auf, wobei in den ersten Port 60 das Beleuchtungslicht 3 einkoppelt ist. An dem zweiten Port 61 wird das Beleuchtungslicht 3 auskoppelt ist und das Detektionslicht 17 einkoppelt. An dem dritten Port 62 wird der Detektionslichtstrahl auskoppelt und dem SP-Modul 20 zugeführt. Das optische Umlenkmittel 5 beinhaltet ein erstes akustooptisches Bauteil 63 und ist als austauschbares Modul mit einem Gehäuse 64 ausgestaltet. Das einfallende Beleuchtungslicht 3 wird von einem Umlenkspiegel 65 auf das erste akustooptische Bauteil 63 gelenkt. Das akustooptische Bauteil 63 ist als AOTF ausgestaltet, der von einer akustischen Welle durchlaufen ist. Die akustische Welle wird von einem der elektrisch angesteuerten Piezo-Schallerzeuger generiert. Die Frequenz der akustischen Welle wird so gewählt, dass nur die Anteile der gewünschten Wellenlänge des Beleuchtungslichts 3 in Richtung des zweiten Ports 61 gelenkt werden. Die übrigen, von der akustischen Anregung nicht beeinflussten Anteile des Beleuchtungslichts 3 werden in eine Strahlfalle 66 gelenkt. Durch Variation der Amplitude der akustischen Welle ist die Leistung des aus dem zweiten Port 61 austretenden Beleuchtungslichts 3 auswählbar, was insbesondere bei reflexionsmikroskopischen Anwendungen von besonderem Vorteil ist. Kristallschnitt und Orientierung des akustooptischen Bauteils 63 sind dabei so gewählt, dass bei gleicher Einkoppelrichtung verschiedene Wellenlängen in die gleiche Richtung abgelenkt werden.
Mit dem optischen Element 5 ist die Variierung der Leistung des Beleuchtungslichts 3, die Variierung der Leistung mindestens einer auswählbaren Wellenlänge oder mindestens eines auswählbaren Wellenlängenbandes des Beleuchtungslichts 3 und auch die vollständige Ausblendung auswählbarer Wellenlängen oder auswählbarer Wellenlängenbänder ermöglicht. Das Detektionslicht 17, das in 2 und in 4 gestrichelt dargestellt ist, trifft mit entgegengesetzter Ausbreitungsrichtung zum Beleuchtungslicht 3 auf das erste akustooptische Bauteil 63. Die Anteile des Detektionslichts 17 mit gleicher Wellenlänge und Polarisation wie die des Beleuchtungslichts 3 werden je nach Amplitude der akustischen Welle vollständig oder teilweise auf den Umlenkspiegel 65 und anschließend zum ersten Port 60 gelenkt; bei verminderter Amplitude gelangt der unbeeinflusste Anteil an dem Umlenkspiegel 65 vorbei. Handelt es sich bei dem Detektionslicht 17 beispielsweise um Reflexionslicht, so wirkt das optische Element 5 wie ein variabler Neutralstrahlteiler, dessen Teilungsverhältnis durch die Amplitude der akustischen Welle bestimmt ist. Handelt es sich bei dem Detektionslicht 17 um Fluoreszenzlicht, das z.B. aufgrund der Stokes- oder Ramanverschiebung in der Wellenlänge verändert ist, wird dieses von der akustischen Welle nicht beeinflusst und gelangt am Umlenkspiegel 65 vorbei. Aufgrund der Doppelbrechung des ersten akustooptischen Bauteils 63 ist das Detektionslicht 17 in einen ordentlich und einen außerordentlich polarisierten Strahl aufgespalten. Außerdem sind jeweils der ordentlich und der außerordentlich polarisierte Strahl aufgrund der Prismenwirkung des akustooptischen Bauteils 63 auch spektral aufgefächert. Zur Kompensation ist ein optisches Kompensationselement 67, das aus einem weiteren akustooptischen Bauteil 68 besteht, vorgesehen. Das weitere akustooptische Bauteil 68 entspricht im Aufbau dem ersten akustooptischen Bauteil 63. Es ist um 180 Grad um die Strahlachse bezüglich dem ersten akustooptischen Bauteils 63 gedreht angeordnet. Dadurch werden die aufgefächerten Teilstrahlen unterschiedlicher Polarisationsrichtung wieder vereinigt. Gleichzeitig wird die spektrale Auffächerung des ersten akustooptischen Bauteils 63 rückgängig gemacht. Es verbleibt allenfalls ein geringer Parallelversatz für Detektionslicht unterschiedlicher Wellenlängen. Nach Durchlaufen des weiteren akustooptischen Bauteils 67 trifft das Detektionslicht 17 auf ein Spiegelpaar, das aus einem ersten Spiegel 69 und einem zweiten Spiegel 70 aufgebaut ist. Das Spiegelpaar dient dazu, das Detektionslicht 17 auf die gewünschte Strahlachse, nämlich die Strahlachse, die das durch den zweiten Port 61 eintretende Detektionslicht 17 aufweist, zu bringen. Dies vereinfacht die Austauschbarkeit des optischen Umlenkmittels 5 gegen ein Element mit einem konventionellen Strahlteiler. Ebenso, wie das Beleuchtungslicht 3 kann das Detektionslicht 17 mit dem ersten akustooptischen Bauteil 63 oder auch mit dem weiteren akustooptischen Bauteil 68 spektral selektiv in der Leistung variiert werden. Im folgenden werden die akustisch eingespeisten Wellen als Steuersignal genutzt.
In der weiteren Beschreibung sind die Spektren mathematisch als Vektoren kodiert, wobei die Komponente des Vektors jeweils den Wert in einem spezifischen Spektralband entspricht. Auf dieser Weise entspricht ein Element des Vektors einer Einzelmessung eines Kanals mit dem SP Modul 20. Wenn man ein spektrales Scanmikroskop oder Mikroskopsystem, wie zum Beispiel in 1 beschrieben, zur Farbabbildung nutzt, dann detektiert es pro Pixel einen spektralen Intensitätsvektor I^Det der sich als Linearkombination bekannter Emmissions-Spektren
über
darstellt. Ein Pixel ergibt sich z.B. aus der punktweisen Beleuchtung durch den scannenden Laserstrahl. Verwendet man z.B. zur Detektion des vom Objekt ausgehenden Lichts einen CCD-Detektor so sind die Zellen des Detektors die einzelnen Pixel. Die Komponenten des Intensitätsvektors entsprechen der in den Detektoren des Mikroskops detektieren Intensität oder einem der Anzahl Photonen proportionalen zeitgegateten Zählsignal, die evtl. durch individuelle Verstärker individuell verstärkt sind (ein Detail das im folgenden aus Gründen der Einfachheit ignoriert wird und sich als Korrekturkomponente in die Matrix durch den mathematischen Fachmann jederzeit einbetten lässt). Die Emmissionspektren
der in das Objekt eingebrachten fluoreszenten Farbstoffe sind in der Regel a priori bekannt, bzw. können vorab in einer Referenzmessung bestimmt werden. Hier werden sie – aus Gründen der Einfachheit – zu einer Mischmatrix M_Det zusammengefasst. Die im Objekt bei der Messung angeregten einzelnen Farbstoffkonzentrationen c_i sind die eigentlich vom Benutzer gesuchten – aber nicht direkt messbaren – Größen. Die einzelnen Farbstoffkonzentrationen c_i können ebenfalls mathematisch zu einem Konzentrationsvektor c zusammengefasst werden. Soweit kann die Detektionsseite mathematisch modelliert werden, welche die energetischen Zustände innerhalb des Farbstoffes mit den Detektionssignalen verknüpft. Betrachtet man den Anregungspfad dann sieht man, dass die vom Farbstoff erzeugte Fluoreszenz und damit der Anteil angeregten einzelnen Farbstoffkonzentration c_i wiederum von spezifischen Spektren
abhängen welche die Anregung der Farbstoffpopulation bestimmt. Diese sind wiederum a priori bekannt, oder per Referenzmessung bestimmbar. Hier gilt
d.h. das die Anregung einer Einzelkonzentration ist dierekt propotional zum Anteil des Anregungsspektrums an der Wellenlänge im Beleuchtungslicht, bei welcher Licht eingespeist wird.
Dieses Modell der Fluoreszenzbildgebung ist in 5 visualisiert und kann mit der Technologie der Numerik im Rechnersystem 23 virtualisiert werden. Mathematisch ist es eine Modellierung in linearer Algebra. Sie ist unterbestimmt, d.h. es gibt mehrere Lösungen die sich als lineare Manigfaltigkeit im Gesamtraum manifestieren. Dies korrespondiert mit der allgemeingültigen Tatsache, das es mehrere unterschiedliche Systemeinstellungen gibt, die Bilder liefern. Im Stand der Technik wird diese Modellierung aus diesem Grund auch nicht stringent genutzt.
Das durch die Gleichungen (1) und (2) definierte System lässt sich aber für den Systemkonfigurationsprozess nutzen. Hierzu wird:

1. das steuernde Rechnersystem 23 um eine Datenbank mit Spektraldaten der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe ausgestattet;
2. jedes Spektrum in der Datenbank mindestens per Name, Emissionspektrum und Absorbtionsspektrum abgelegt;
3. diese Spektraldatenbank durch den Benutzer editierbar und ergänzbar gemacht;
4. im User Interface des Spektralmikroskops (genauer auf dem steuernden Rechnersystem 23, embedded oder beigestellt) ein Selektionsmittel für mindestens einen Farbstoff bereitgestellt;
5. Im Speicher des Rechnersystems 23 das oben genannte Modell gebildet, indem die Matrizen M_Ex und M_Det berechnet werden; und
6. Auf diesem Datenmaterial einer der folgenden Arten zugegriffen wird.

Die Art und Weise wie dies geschieht ist der Kerngedanke der Erfindung, wobei sich mehrere Alternativen ergeben. Man kann eine Reihe trivialer Varianten gestalten. Die Matrizen M_Ex und M_Det kann man zu einer Matrix M = M_ExM_Det verknüpfen und mit dieser weitere Berechnungen ausführen. Diese Variante beschreibt das Komglettsystem wie eine Art Übertragungsfunktion von Beleuchtung zur Detektion. Wenn man für eine gegebene Beleuchtung Modelieren will, dann ergeben sich direkt durch Vorwärtsmodellierung die resultierenden Spektren. In der Einfarbstoffvariante bei einer Beleuchtung erhält man sofort das resultierende Spektrum als Ergebniss und kann durch einfache Suche die Konfiguration bzw. Einstellung der Spiegelschieber des SP Moduls 20 bestimmen. Werden zwei Farbstoffe bei einer Beleuchtung genutzt (z.B. GFP-CFP) wird es etwas schwieriger. Hier werden beide Spektralanteile individuell durch die Matrizen propagiert und man erhält Spektren, die miteinander zu vergleichen sind, um die Einstellung der Spiegelblendenanordnung 34, 35 des SP-Moduls 20 bestimmen zu können. Es gilt die Schieber 40 und 41 an den Ort grösster Unterschiedlichkeit zu schieben.
Auch der Umgekehrte Weg ist denkbar. Man hat eine gegebene Einstellung der Spiegelblendenanordnung 34, 35 und fragt nach der optimalen Beleuchtung, um eine dann optimale Signale von den im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe auf den Detektoren 36, 37 zu erhalten. Dies erfolgt durch Berechnung der Pseudoinversen
und Projektion der Bereiche der Schieber 40 und 41 der Spiegelblendenanordnung 34, 35 (in Vektordarstellung) zurück in den Beleuchtungsraum. Dann kann man dort die nächstliegende Beleuchtung wählen.
Aber allen diesen Ausführungsformen ist gemeinsam, dass sie sich am Einzelfall festhalten, um eine grobe Lösung zu erarbeiten. Desweiteren lassen sie die Effekte im Farbstoff ausser acht. Das hier durch die Erfindung offenbarte Verfahren organisiert das Modell in beide Richtungen. Die Matrizen M_Ex und M_Det modellieren den Vorwärtsweg (die Beleuchtung ist bekannt, und unter Berücksichtigung der im Objekt 15 vorhandenen Farbstoffe erfolgt einer Einstellung der Spiegelblendenanordnung 34, 35) und die entsprechend zugeordneten Pseudoinversen
und
den Rückwärtsweg (die Einstellung der Spiegelblendenanordnung 34, 35 ist bekannt und es wird eines geeignete Beleuchtung gewählt, um eine optimale Detektion zu erreichen), wobei die notwendigen Daten aus der Datenbank stammen. Auf diese Art und weise lassen sich direkt alle relevanten Daten der Konfiguration im Objekt 15 (I^Det, c, I^Ex) miteinander Verknüpfen und auf die niedrigdimensionalen Raum von Freiheitsgraden (I^Ex) reduzieren. Ausgehend von diesem Möglichkeitsraum wird eine optimale Lösung bzw. Einstellung des Systems gesucht. Der Konfigurationsraum muss allerdings minimal um die Detektionscharakteristic des SP Moduls 20 in Form einer Projektionsmatrix P erweitert werden, um die Zusammenfassung spektraler Bänder im SP Modul 20 zu modellieren. Hinzu kommt, dass man eine Unmischmatrix U einführen muss, die im Anschluss an die Datenaufnahme im Rechnersystem 23 zur Datenkorrektur genutzt wird. Das Resultat ist ein abzusuchender Konfigurationsraum, der von (U, P, I^Ex) aufgespannt wird, wobei der gesamte überbestimmte Konfigurationsraum eigentlich von (U, P, I^Ex, c, I^Ex) aufgespannt wird, die Freiheitsgerade durch die oben gegebene Modellierung aber minimiert sind. Die Bewertung und Auswahl einer geeigneten Konfiguration geschieht in der Regel durch ein Optimierverfahren und eine Bewertungsfunktion. Die Darstellungen von Optimierverfahren kann der mathematisch-technischen Literatur entnommen werden (siehe z.B. Michaelewicz, Fogel: How to Solve It: Modern Heuristic. Berlin: Springer, 2000). Es sei aber darauf hingewiesen, das es unzählige Varianten von Optimierverfahren gibt, die alle in geeigneter Anpassung für dieses Verfahren anwendbar sind.
Eine Bewertung der Konfiguration könnte beispielsweise unter den folgenden Bedingungen erfolgen, wobei z.B.

• I^Det ziemlich hell sein soll;
• c möglichst hoch sein soll;
• I^Exc möglichst gering sein soll;
• die Information in einzelnen Kanälen möglichst unterschiedlich sein soll;
• die Gesamtmenge an Photonen maximiert werden soll;
• das Risiko der Verwechselung minimiert werden soll; oder
• die Detektion und die innere Anregung möglichst identisch sein soll.

Dies kann matematisch durchaus unterschiedlich realisiert sein. In der Regel wird es in einer Bewertungsfunktion ala
resultieren, wobei die einzelnen Gewichtungen ξ_i eine Vergleichbarkeit der Skalen hervorrufen. Jedem der einzelnen Terme lässt sich eine Bedeutung zuordnen, hier Stärke der Beleuchtungsintensität, Gefundene Konzentration, Stärke der Detektionsintensität, Informationsdifferenz zwischen Kanälen, Abweichung Konzentration von Detektionsbild... Eine derartige Bewertungsfunktion lässt sich entsprechend Vereinfachen zu
was nur noch von der Beleuchtung abhängt und sich durch einen Optimierungsalgorithmus maximieren lässt.
5 verdeutlicht die mathematisch, physikalischen Zusammenhänge bei der Beleuchtung und der Detektion eines Objekts 15, das mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen ist. Wie bereits oben erwähnt, aus dem Beleuchtungslichtstrahl 4 wird ein spezifisches spektrales Band 80 benutzt, um das Objekt 15 damit zu beleuchten. Wie und unter welchen Voraussetzungen die Auswahl erfolgt ist oben eingehend beschrieben worden. Zusammen mit dem Anregungsspektrum 83 wird eine Gewichtung 81 des spektralen Bandes 80 vorgenommen. Energiezustände im Objekt 15 und das Emissionsspektrum 84 werden ebenfalls einer Gewichtung 82 unterzogen. Schließlich erhält man ein Fluoreszenzspektrum 85 des Objekts 15.
6. zeigt eine schematische Übersicht des erfindungsgemäßen Verfahrens. Zunächst erfolgt die Eingabe 86 von den Farbstoffen, mit denen das Objekt 15 gefärbt ist. Die zugehörigen Anregungs- und Emissionsspektren kann das Scanmikroskop der Datenbank des Rechnersystems 23 entnehmen. Der Benutzter kann z.B. auch eine Eingabe 87 von Optimierungsvorgaben über das Peripheriegerät 27 des Spektralmikroskops 100 machen. Aufgrund der aus der Datenbank 23a des Rechnersystems 23 abgerufenen Anregungs- und Emissionsspektren erfolgt eine Modellierung 88 des Beleuchtungspfades anhand der Anregungsspektren. Ebenso erfolgt eine Modellierung 89 des Detektionspfades anhand der Emissionsspektren. Weiterhin erfolgt eine Modellierung 90 der Geräteeigenschaften des Scanmikroskops 100, das als Spektralmikroskop ausgebildet ist. Aufgrund der vorgenommenen Modellierung 88, 89, 90 erfolgt eine Bestimmung 91 des gesamten Konfigurationsraumes zur Optimierung. Anschließend erfolgt eine Optimierung 92, bei der die Eingabe 87 der Optimierungsvorgaben herangezogen wird. Die Optimierung 92 führt zu einer Einstellung 93 der Beleuchtung bzw. des Lichts für die Anregung der Fluoreszenz. Ebenso führt die Optimierung 92 zu einer Einstellung 94 des SP-Moduls 20, um eine optimale Detektion zu erzielen.
7 zeigt eine Ausführung eine User-Interfaces mit mindestens einem Selektionsmittel für Farbstoffe und einer Auswahlmöglichkeit der Optimierungsziele. Es ist selbstverständlich, dass die Bezeichnung der einzelnen Optimierungsziele an den Wunsch des Marktes angepasst sind und in keinster Weise als Beschränkung aufgefasst werden können. Alle anderen handelsüblich vorhandenen Einstellmöglichkeiten eines konfokalen Mikroskop wurden der Übersichtlichkeit halber weggelassen. In einer ersten und einer zweiten Auswahlbox 95₁ und 95₂ kann der Benutzer aus einer Reihe von Farbstoffen wählen die im Objekt 15 vorgesehen sind. Es ist selbstverständlich, dass auch mehr als zwei Auswahlboxen dem Benutzer angeboten werden. Die Zahl der Auswahlboxen ist von der Anzahl der verschiedenen Farbstoffe abhängig, die im Objekt 15 vorgesehen sind. Hinzu kommt, dass dem Benutzer eine Vielzahl von Checkboxen 96₁ , 96₂ , 96₃ und 96₄ zur Aktivierung von Optimierungszielen angeboten werden. Aktiviert der Benutzer z.B. die erste Checkbox 96₁ , die mit „Do not care" bezeichnet ist, dann will er keine Optimierung vornehmen. Aktiviert der Benutzer z.B. die zweite Checkbox 96₂ , die mit „Do not spend to much light" bezeichnet ist, dann will er das Objekt 15 mit einem Minimum an Beleuchtungslicht belasten. Aktiviert der Benutzer z.B. die dritte Checkbox 96₃ , die mit „Provide good SNR" bezeichnet ist, dann soll die Einstellung des gesamten Systems derart vorgenommen werden, dass ein gutes Signal zu Rausch Verhältnis erzielt wird. Aktiviert der Benutzer z.B. die vierte Checkbox 96₄ , die mit „Exite as much as possible" bezeichnet ist, dann soll die Einstellung des gesamten Systems derart erfolgen, dass das zu untersuchende Objekt 15 so viel wie möglich angeregt wird.
Die Erfindung wurde in bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

1: Beleuchtungssystem
3: Beleuchtungslicht
5: Umlenkmittel
6: Beleuchtungspinhole
7: Scanmodul
8: mikrostrukturiertes Element
9: Scanspiegel
10: Laser
12: Scanoptik
13: Mikroskopoptik
15: Objekt
17: Detektionslicht
18: Detektionspinhole
20: SP-Modul
23: Rechnersystem
23a: Datenbank
27: Peripheriegerät
29: Einstellvorrichtung
30: Maus
31: Prisma
32: aufgespaltener Lichtfächer
33: Fokussieroptik
34: Spiegelblendenanordnung
35: Spiegelblendenanordnung
36: Detektor
37: Detektor
40: erster Schieber
41: zweiter Schieber
44: erster Motor
45: zweiter Motor
50: gepulster Lichtstrahl
51: Fokussieroptik
52: Zoomoptik
53: Kristall
54: Gehäuse
55: Lichtaustrittsöffnung
56: spektral verbreitertes Licht
60: erster Port
61: zweiter Port
62: dritter Port
63: erstes akustooptisches Bauteil
64: Gehäuse
65: Umlenkspiegel
66: Strahlfalle
67: optisches Kompensationselement
68: weiteres akustooptisches Bauteil
69: erster Spiegel
70: zweiter Spiegel
80: spektrales Band
81: Gewichtung
82: Gewichtung
83: Anregungsspektrum
84: Emissionsspektrum
85: Fluoreszenzspektrum
86: Eingabe
87: Eingabe
88: Modellierung
89: Modellierung
90: Modellierung
91: Bestimmung
92: Optimierung
93: Einstellung
94: Einstellung
95₁: erste Auswahlbox
95₂: zweite Auswahlbox
96₁: Checkbox
96₂: Checkbox
96₃: Checkbox
96₄: Checkbox
100: Scanmikroskop

Claims

Verfahren zur Einstellung eines Spektralscanmikroskops, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: a) Erzeugen eines Beleuchtungslichts (3) durch ein Beleuchtungssystem (1), das mindestens einen Laser besitzt, der Licht einer Wellenlänge aussendet, wobei das Beleuchtungssystem (1) Beleuchtungslicht (3) erzeugt, das einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich von 300 nm bis 1600 nm besitzt, b) Übermitteln des mindestens einen im Objekt vorhandenen Farbstoffs an ein Rechnersystem (23) und Auslesen der in einer Datenbank abgelegten zugehörigen Anregungs- und Emissionsspektren, c) Eingabe (87) von Optimierungszielen, wie die Intensität des Beleuchtungslichts (3), das Signal-Rausch-Verhältnis, das Übersprechverhältnis und/oder das Fehldetektionsrisiko, die der Benutzer über ein Peripheriegerät (27) des Spektralmikroskops (100) ausführt, d) Berechnen für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff eines Bandes Beleuchtungslichts (3) und Berechnen für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff eines Bandes des Detektionslichts (17), wobei die aus der Datenbank ausgelesenen Anregungs- und Emissionsspektren herangezogen werden und das Berechnen des Bandes des Beleuchtungslichts (3) und des Detektionsbands (17) durch Modellierung und Optimierung der optischen Konfiguration des Spektralmikroskops (100) nach mindestens einem vom Benutzer festgelegten Optimierungsziel erfolgt, e) Einstellen des berechneten Bandes im Beleuchtungslicht und Einstellen des berechneten Detektionsband, und f) Durchführen der Datenaufnahme mit dem Spektralmikroskop (100).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Einstellen automatisch erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt (15) mit mindestens zwei Farbstoffen versehen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet; dass das Band des Beleuchtungslichts (3) über einen AOBS eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Band des Detektionslichts mittels eines SP-Moduls (20) eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Detektion pro Pixel ein spektraler Intensitätsvektor I^Det detektiert wird, der sich als Linearkombination der Emissions-Spektren
der im Objekt eingebrachten Farbstoffe zusammensetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Emissions-Spektren
der im Objekt eingebrachten fluoreszenten Farbstoffe zu einer Detektions-Mischmatrix M_Det zusammengefasst werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass für die Anregung pro Pixel ein spektraler Intensitätsvektor I^Ex erzeugt wird, der sich als Linearkombination der Anregungs-Spektren
der im Objekt eingebrachten Farbstoffe zusammensetzt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungs-Spektren
die den im Objekt (15) eingebrachten fluoreszenten Farbstoffen zugeordnet werden, zu einer Anregungs-Mischmatrix M_Ex zusammengefasst werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungs-Mischmatrix M_Ex und die Detektions-Mischmatrix M_Det die Bedingungen vom Beleuchtungssystem (1) zum Objekt (15) modellieren, wobei die spektrale Zusammensetzung des Beleuchtungslichts bekannt ist, und dass unter Berücksichtigung der im Objekt (15) vorhandenen Farbstoffe eine Einstellung der Spiegelblendenanordnung (34, 35) erfolgt.
Verfahren nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine Pseudoinverse der Anregungs-Mischmatrix
und eine Pseudoinverse der Detektions-Mischmatrix
die Bedingungen vom Objekt (15) zum Detektor (36, 37) modellieren, wobei die Einstellung der Spiegelblendenanordnung (34, 35) bekannt ist, und dass eine geeignete spektrale Zusammensetzung des Beleuchtungslichts gewählt wird, wobei die notwendigen Daten aus der Datenbank stammen.
System zur Einstellung eines Fluoreszenz-Spektralmesssystems zur Mikroskopie mit einem Beleuchtungssystem (1), das aus dem Licht mindestens eines Lasers (10) einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich von 300 bis 1600 nm erzeugt, einem SP Modul (20), das ein von einem Objekt (15) ausgehendes Detektionslicht (17) empfängt, einem optischen Umlenkmittel (5), das im Beleuchtungslicht (3) und im Detektionslicht (17) vorgesehen ist, wobei ein Rechnersystem (23) mit einer Datenbank vorgesehen ist, in der mehrere Anregungs- und Emissionsspektren von Farbstoffen abgelegt sind, das Rechnersystem (23) ein Mittel zum Berechnen eines Bandes des Beleuchtungslichts für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff und zum Berechnen eines Bandes des Detektionslichts für jeden im Objekt (15) vorhandenen Farbstoff aufweist, wobei die in der Datenbank des Rechnersystems (23) vorhandenen Anregungs- und Emissionsspektren verwendbar sind und ein Mittel zum Einstellen des berechneten Bandes im Beleuchtungslicht (3) und ein Mittel zum Einstellen des berechneten Bandes im Detektionslicht (17) vorgesehen ist, wobei das Mittel zum Einstellen des berechneten Bandes im Beleuchtungslicht ein AOBS ist und das Mittel zum Berechnen des Bandes des Beleuchtungslichts und des Bandes des Detektionslichts ein Mittel zur Modellierung und Optimierung der optischen Konfiguration des Scanmikroskops (100) umfasst, wobei ein Peripheriegerät (27) vorgesehen ist, über das der Benutzer mindestens ein Optimierungsziel eingibt, wie das Optimierungsziel Intensität des Beleuchtungslichts, Signal-Rausch-Verhältnis, Übersprechverhältnis und/oder Fehldetektionsrisiko.
System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Eistellen des berechneten Bands im Detektionslicht ein SP-Modul (20) ist.
System nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das SP-Modul (20) eine Spiegelblendenanordnung (34, 35) umfasst, mittels der das berechnete Band des Detektionslichts (17) im Emissionsspektrum selektierbar ist.
System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peripheriegrät (27) eine erste und eine zweite Auswahlbox (95₁ , 95₂ ) umfasst, über die der Benutzer mehrere Farbstoffe wählt, die im Objekt (15) vorgesehen sind.
System nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Peripheriegrät (27) eine Vielzahl von Clickboxen (96₁ , 96₂ , 96₃ , 96₄ ) zur Aktivierung von Optimierungszielen umfasst.