JP4804727B2

JP4804727B2 - 光走査型共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP4804727B2
Application number: JP2004186348A
Authority: JP
Inventors: 純一北川
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-06-24
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2024-06-24
Also published as: US7365842B2; JP2006010944A; US20050286048A1

Description

本発明は、励起光を走査しながら試料に照射し、試料からでてくる蛍光を検出する光走査型共焦点顕微鏡に関する。

近年、蛍光試薬の発展に伴い、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＣＬＳＭ）の高機能化が進んできている。従来のフィルターを用いた蛍光検出に加え、試料から発生した蛍光を分光して検出する手法が登場してきた。この蛍光分光検出によって、試薬ごとの固有の蛍光スペクトルをより詳細に分析・定量化できるようになってきている。また、波長特性に大きなクロストークをもつ複数の蛍光試薬を組み合わせた試料で蛍光観察されるようになり、それら個々の蛍光を分離して観察する要望がでてきている。

米国特許出願公開２００２／００２０８１９Ａ１号は、レーザー光によって励起された試薬が発する蛍光を分光して検出する装置を開示している。この装置では、具体的には、試料から発生した蛍光を回折格子からなる分散素子を用いて分光し、分光された蛍光をマルチチャンネル検出器によって検出している。ここで使用されるマルチチャンネル検出器は物理的に切り離された複数の検出チャンネルを備えており、分散された蛍光は個々のチャンネルに空間的に配分され、それぞれの波長領域に分離されて検出される。このため、チャンネル一つが最小波長帯幅となる。蛍光の分光プロファイルは電気的に各チャンネルの検出位置を識別するか検出位置を移動させることによって取得することができる。

特表２００２−１２２７８７号公報は、蛍光を分光して検出する別の装置を開示している。この装置では、プリズムからなる分散素子によって分散された蛍光に対して、スリットの開口幅によって決まる波長帯の蛍光を検出することができる。さらに、光路上の少なくとも一つの光学部品を回転や摺動させることにより、波長帯（の中心波長）を変化させることができる。これにより、分光プロファイルを取得することができる。

米国特許第５，１９２，９８０号は、蛍光を分光して検出する別の装置を開示している。この装置では、回折格子からなる分散素子によって蛍光を分散させ、検出器の前に配置された一つのピンホールによって共焦点効果を得るとともに波長選択を行なう。特表２００２−１２２７８７号公報と同様に分散素子を回転させることによって所望の領域内でピンホールにより波長選択を行なう。ピンホールの大きさによって極めて狭い波長幅を選択でき、高精度な分光検出を行なうことができる。
米国特許出願公開２００２／００２０８１９Ａ１号特表２００２−１２２７８７号公報米国特許第５，１９２，９８０号

米国特許出願公開２００２／００２０８１９Ａ１号の装置では、回折格子を用いて分散された蛍光はマルチチャンネル検出器で検出されるため、蛍光がもつ波長成分が空間的に配置された個々のチャンネルでそれぞれに配分される。このため、チャンネル一つ一つの物理的な大きさが受けもつ波長帯幅を意味し、システム全体の最小波長分解能に相当する。このため、蛍光プロファイルを取得する際に波長帯幅を自由に可変できないという制限を受ける。また、元来微弱な蛍光をさらに分散させて測光するが、マルチチャンネル検出器の個々のチャンネルは検出感度がそれほど高くない。このため、高感度でダイナミックレンジ広く分光検出を行なうことは難しい。

特表２００２−１２２７８７号公報の装置では、実際に分光プロファイルをどのように取得するかについて詳細に記載されていない。ここではスリット幅を狭くして検出波長帯幅を小さくすることによって高精度な検出を行なうことができるが、元来極めて微弱な蛍光を分散させて測光するため、検出器に非常に高い感度が求められるという難点がある。

米国特許第５，１９２，９８０号の装置では、回転可能な回折格子からなる分散素子によって蛍光を分光し、分光された蛍光をピンホールを介して検出している。ピンホールの大きさは、共焦点効果と波長分解能の両方に同時に寄与するため、自由に変えることはできない。このため、蛍光の分光プロファイル検出のような微弱測光には利用できない。

本発明は、このような実状を考慮して成されたものであり、その目的は、蛍光の分光検出を十分な光強度で行なえる光走査型共焦点顕微鏡を提供することである。

本発明の光走査型共焦点顕微鏡は、励起光ビームを射出するための光源部と、前記光源部からの励起光ビームを走査するための走査光学系と、励起光ビームを試料に照射するための対物レンズと、試料に照射される励起光と励起光照射に起因して試料から生じる検出光（蛍光と反射光を含む）とを分離するための分離光学素子と、共焦点効果を得るための共焦点検出部と、検出光を分光検出するための分光検出装置と、前記分光検出装置によって得られた蛍光スペクトル情報から蛍光の種類ごとのスペクトル成分に対応した蛍光スペクトル情報を分離演算する蛍光分離演算処理部を備えており、前記分光検出装置は、検出光を分光するための分光器と、前記分光器によって分光された光から任意の幅の波長帯の光を抽出するための光抽出部と、前記光抽出部によって抽出された光を検出するための検出器と、前記光抽出部によって抽出される光の波長帯を一定の送り量ずつシフトさせることで波長掃引を行なう波長帯移動部とを有している。波長帯移動部による波長帯のシフト量が前記光抽出部によって抽出される光の波長帯の幅よりも小さい。

本発明によれば、蛍光の分光検出を十分な光強度で行なえる光走査型共焦点顕微鏡が提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

［第一実施形態］
図１は、本発明の第一実施形態によるレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を概略的に示している。

本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡１００は、励起光ビームを射出するための光源部１１０と、光源部１１０からの励起光ビームを走査するための走査光学系１３０と、励起光ビームを試料Ｓに照射するための対物レンズ１４０と、試料Ｓに照射される励起光と励起光照射に起因して試料Ｓから生じる検出光（蛍光と反射光を含む）とを分離するための分離光学素子であるダイクロイックミラー１２０と、共焦点効果を得るための共焦点検出部１５０と、検出光を分光検出するための分光検出装置１６０とを備えている。

光源部１１０は、励起光を発するレーザー光源１１１と、レーザー光源１１１から発せられた励起光を伝達する光ファイバー１１２と、光ファイバー１１２によって伝達された励起光を励起光ビームとして射出する射出部１１３とを有している。

走査光学系１３０は、ガルバノミラーや音響光学素子などの光ビームを走査する公知の走査素子を用いて構成される。

共焦点検出部１５０は、ダイクロイックミラー１２０と分光検出装置１６０の間の光路上に位置している。共焦点検出部１５０は、例えば、二枚の凸レンズ１５１と１５３とそれらの間に配置されたピンホール１５２とを有している。ピンホール１５２は、走査光学系１３０と対物レンズ１４０による励起光の焦点（収束点）に対して、対物レンズ１４０と走査光学系１３０と凸レンズ１５１とを介して共焦点の位置に配置されている。これにより、共焦点検出部１５０は、ダイクロイックミラー１２０によって分離された検出光から、光軸に沿った特定の高さ位置にある試料面（試料中の面）からの検出光を選択的に取り出す。

分光検出装置１６０は、検出光を波長ごとに異なる方向に偏向させる分散素子１６１と、分散素子１６１を光軸に直交する軸周りに回転させる回転デバイス１６２と、分散素子１６１によって分光された検出光を収束させるための収束レンズ１６３と、開口幅を変更可能な機械的な可変開口であるスリット１６４と、スリット１６４によって抽出された光を検出するための検出器１６５とを有している。

スリット１６４は、分散素子１６１によって分光された光から任意の幅の波長帯の光を抽出するための光抽出部として機能する。スリット１６４は、スリット幅すなわち開口を規定している二枚の遮光板１６４ａと１６４ｂを有している。二枚の遮光板１６４ａと１６４ｂは共に、光軸に垂直な方向に移動可能であり、抽出する光の波長帯の上限と下限を定める。つまりスリット１６４は、抽出する光の波長帯の幅を自由に変更することができる。

また、分散素子１６１は、検出光を分光するための分光器として機能する。分散素子１６１は、これに限らないが、例えば回折格子で構成される。この場合、検出光は波長に対応した回折角で回折されるによって分光される。分散素子１６１は、回折格子に限定されるものではなく、分光機能をもつ任意の光学素子、例えばプリズムで構成されてもよい。この場合、検出光は波長に対応した屈折角で屈折されるによって分光される。図１は分散素子１６１が回折格子で構成された例を示している。分散素子１６１がプリズムで構成された場合には、回折と屈折の違いから、収束レンズ１６３とスリット１６４と検出器１６５の配置を図１と異ならせる必要があるが、そのほかは本実施形態の構成をそのまま適用できる。

回転デバイス１６２は、スリット１６４によって抽出される光の波長帯を移動させる波長帯移動部として機能する。より詳しくは、回転デバイス１６２は、分散素子１６１を回転させることにより、スリット１６４を通過し得る光の波長帯の代表波長（例えば中心波長または下限波長または上限波長）を一定のシフト量で移動させる。回転デバイス１６２は、これに限らないが、例えばガルバノメーターやステッピングモーターで構成される。

検出器１６５は、これに限らないが、好ましくは高感度の検出器、例えばフォトマルチプライヤーで構成される。

レーザー走査型共焦点顕微鏡１００はさらに、分光検出装置１６０で得られた蛍光情報（蛍光分光画像または蛍光特性データ）から蛍光の種類ごとのスペクトル成分に対応した蛍光情報を分離演算する蛍光分離演算処理部１７０を備えている。

図１において、光源部１１０から射出された励起光ビームは、ダイクロイックミラー１２０によって反射され、走査光学系１３０と対物レンズ１４０を経て試料Ｓに照射される。試料Ｓは蛍光色素によって染色されており、蛍光色素は励起光の照射に対して蛍光を発する。試料Ｓからの検出光（通常、複数種類の蛍光と反射光を含んでいる）は、対物レンズ１４０と走査光学系１３０を通り、ダイクロイックミラー１２０を透過することによって励起光から分離され、共焦点検出部１５０に入射する。ダイクロイックミラー１２０を透過した検出光は、共焦点検出部１５０を通過することによって試料Ｓ中の特定の高さ位置にある面からの検出光だけになり、分光検出装置１６０に入射する。

分光検出装置１６０に入射する検出光は、分散素子１６１によって波長成分ごとに異なる方向に偏向されることにより分光される。言い換えれば、検出光は、分散素子１６１によって波長に従って空間的に分散される。分光された検出光は収束レンズ１６３に入射し、波長成分ごとに異なる位置に収束される。収束レンズ１６３によって収束された検出光の一部（特定の波長帯の光）はスリット１６４を通過して検出器１６５に入射する。より詳しくは、スリット１６４に達した検出光のうち、スリット１６４の開口幅（スリット幅）で決まる波長帯内の波長成分の検出光だけが選択的にスリット１６４を通過して検出器１６５によって入射する。

検出器１６５は、入射した光を、その光強度を反映した電気信号に変換して出力する。検出器１６５から出力される電気信号は蛍光分離演算処理部１７０に入力されて処理される。

分光検出のあいだ、スリット１６４は一定の開口幅（スリット幅）に固定される。スリット１６４の開口幅は、検出器１６５によって検出光が十分な強度で検出されるように、あらかじめ調整される。スリット１６４の開口幅は、検出器１６５によって検出される光の波長帯の幅を決める。言い換えれば、スリット１６４の開口幅は、分光検出における波長分解能を意味する。

分散素子１６１は、回転デバイス１６２により、所定の角度範囲内を一方向に一定の送り量ずつ回転される。これに伴い、スリット１６４を通過する光の波長帯が所定の波長領域内を一方向に一定の送り量で移動される。波長帯の移動方向は任意で、分散素子１６１の回転方向によって決まる。つまり、波長帯は、短波長側から長波長側へ移動されても、または長波長側から短波長側へ移動されてもよい。これにより、検出器１６５によって検出される光が波長掃引される。波長掃引の波長領域（掃引幅）は、回転デバイス１６２によって回転される分散素子１６１の角度範囲によって決まる。

通常、蛍光は極めて微弱であるため、分光検出のために分散素子１６１によって蛍光を分散させることは、蛍光の検出にとっては非常に不利である。

本実施形態は、このような事情を考慮して、分光検出において、既知の蛍光特性と検出器１６５の感度に応じて、十分な強度で蛍光を検出することに向けられている。

図２は、本実施形態による分光検出における、蛍光試薬の典型的な蛍光特性と、検出器によって検出される光の波長帯と、波長帯が移動される波長領域とを示している。波長領域Ｌは、通常は波長帯の中心波長を代表値として設定されるが、波長帯の代表値は波長帯内の任意の値でよく、図２では波長帯の下限値を基準にして設定されてもいる。

図２において、波長帯は、短波長側から長波長側へ、一定の送り量ずつ移動される。αｎはｎ回目の送り移動後の波長帯を示し、Δαは波長帯の一回の送り移動量（波長シフト量）示している。波長帯αｎの下限値はスリット１６４の遮光板１６４ａの位置に対応し、波長帯αｎの上限値はスリット１６４の遮光板１６４ｂの位置に対応している。波長帯αｎの幅は、ｎの値に関係なく一定である。波長シフト量Δαは、分散素子１６１の回転の送り量に対応している。

本実施形態では、図２から分かるように、波長帯のシフト量Δαが波長帯の幅よりも小さく設定される。波長帯αｎの幅を便宜的に｜α｜と表すと、Δα＜｜α｜である。さらに波長帯αｎの幅｜α｜は、スリット１６４の開口幅により、既知の蛍光特性と検出器１６５の感度に応じて、検出器１６５による検出が十分な強度で行なえるように設定される。

波長帯αｎの幅｜α｜は、十分な信号強度を得るために、比較的大きい値に設定されるとよい。また波長帯αｎの波長シフト量Δαは、検出精度を考慮すると、極めて小さい値に設定されるとよい。波長帯αｎの幅｜α｜と波長シフト量Δαは、例えば、｜α｜＝１０ｎｍに対してΔα＝２ｎｍや、｜α｜＝５０ｎｍに対してΔα＝５ｎｍなどに設定される。｜α｜とΔαの値は、もちろんこれらに限定されるものではなく、Δα＜｜α｜を満たす範囲で測定条件などを考慮して適当に設定されるとよい。

波長帯の幅｜α｜と波長シフト量Δαをこのように設定することにより、十分な強度で測光を行なえるとともに、波長分解能が高くなくても波長シフト量Δαに基づく蛍光強度の変化分を極めて高精度に検出することができる。これにより、図３に示されるように、精密な蛍光プロファイルを得ることができる。また、システムの特性や得られる蛍光特性に基づいて、システムまたは得られるプロファイルデータを較正してもよい。

つぎに、蛍光分離演算処理部１７０による分離演算処理について図４と図５を用いて説明する。

図４は、本実施形態による分光検出によって得られる二つの蛍光成分αとβを含む蛍光プロファイルと、二つの蛍光成分αとβのそれぞれの蛍光プロファイルとを示している。また、図５は、二つの蛍光成分αとβが波長軸λ方向にスタック化された蛍光分光画像γと、二つの蛍光成分αとβのそれぞれの蛍光画像を示している。

図４に上段に示される取得された蛍光プロファイルは、蛍光分離演算処理部１７０による分離演算によって、図４に下段に示されるα成分の蛍光プロファイルとβ成分の蛍光プロファイルとに分離される。この分離演算は、蛍光成分αとβのそれぞれについてあらかじめ既知の参照データを準備しておくことにより行なってもよいし、取得された蛍光プロファイルに二つの蛍光成分αとβが含まれていると仮定して、蛍光成分αとβのプロファイルを推定しながら繰り返し計算により近似することにより行なってもよい。これにより、分光検出された蛍光特性から、図４の下段に示されるように、個々の蛍光プロファイルαとβを抜き出すことができる。

この手法は、図５の上段に示される蛍光分光画像γに対しても同様に適用できる。具体的には、蛍光分光画像γのそれぞれの画像についてピクセルごとに図４に示される演算処理を行なうことにより、図５の下段に示される二つの蛍光成分αとβのそれぞれの蛍光画像を得ることができる。

本実施形態では、分光検出における波長分解能を意味する波長帯の幅を比較的広く設定することにより、試料からの極めて微弱な蛍光を十分な強度で検出することができる。また、波長シフト量を波長帯の幅よりも極めて小さく設定することにより、蛍光プロファイルを極めて高い精度で検出することができる。ここで検出されるプロファイルはオーバーラップ部分を含む相対的なものであるが、得られるプロファイルから蛍光特性の変化分をより詳細に取得することができる。

さらに、得られた極めて高い精度の蛍光プロファイルを蛍光分離演算処理部によって分離演算することにより、蛍光成分ごとの蛍光情報（蛍光分光画像または蛍光特性データ）を得ることができる。これにより、例えば二つの蛍光成分の蛍光ピークが接近していて両者の蛍光情報の間に大きなクロストークがある場合であっても、二つの蛍光成分のそれぞれの蛍光情報すなわち蛍光画像または蛍光特性データを適切に観察することができる。

［第二実施形態］
通常、蛍光は極めて微弱であるため、分光検出のために分散素子１６１によって蛍光を分散させることは、蛍光の検出にとっては非常に不利である。さらに蛍光は、励起光の照射により褪色しやすいため、励起光の照射時間が長引くと、蛍光によっては褪色してしまって正確な蛍光特性を測定できなくなるおそれがある。

本実施形態は、このような事情を考慮して、分光検出において、既知の蛍光特性と検出器１６５の感度に応じて、十分な強度で蛍光を検出するとともに、分光検出を比較的高速で行なうことに向けられている。

本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡の装置構成を第一実施形態とまったく同じである。

図６は、本実施形態による分光検出における、蛍光試薬の典型的な蛍光特性と、検出器によって検出される光の波長帯と、波長帯が移動される波長領域とを示している。波長領域Ｌは、通常は波長帯の中心波長を代表値として設定されるが、波長帯の代表値は波長帯内の任意の値でよく、図２では波長帯の下限値を基準にして設定されてもいる。

図６において、波長帯は、短波長側から長波長側へ、一定の送り量ずつ移動される。αｎはｎ回目の送り移動後の波長帯を示し、Δαは波長帯の一回の送り移動量（波長シフト量）示している。波長帯αｎの下限値はスリット１６４の遮光板１６４ａの位置に対応し、波長帯αｎの上限値はスリット１６４の遮光板１６４ｂの位置に対応している。波長帯αｎの幅は、ｎの値に関係なく一定である。波長シフト量Δαは、分散素子１６１の回転の送り量に対応している。

本実施形態では、図６から分かるように、波長帯のシフト量Δαが波長帯の幅よりも大きく設定される。波長帯αｎの幅を便宜的に｜α｜と表すと、Δα＞｜α｜である。また波長帯αｎの幅｜α｜は、第一実施形態と同様に、スリット１６４の開口幅により、既知の蛍光特性と検出器１６５の感度に応じて、検出器１６５による検出が十分な強度で行なえるように設定されている。

波長帯αｎの幅｜α｜と波長シフト量Δαは、例えば、｜α｜＝１０ｎｍに対してΔα＝３０ｎｍや、｜α｜＝１５ｎｍに対してΔα＝５０ｎｍなどに設定される。｜α｜とΔαの値は、もちろんこれらに限定されるものではなく、Δα＞｜α｜を満たす範囲で測定条件などを考慮して適当に設定されるとよい。

本実施形態は、例えば、二つの蛍光ピークがやや離れていて裾野に大きなクロストークがあるような場合に有効である。波長シフト量Δαは、そのピーク変化を検出できる程度な値に設定されるとよい。

図７に黒丸で示されるように、波長シフト量Δαによって蛍光特性に対して波長軸に沿った測定点数を少なくできる。このため、分光検出を短時間すなわち高速に行なうことができる。従って、極めて褪色が早い蛍光色素に対して非常に有効である。この手法で取得できる情報は、不連続な測定点におけるものだけであるが、不連続な測定点における情報を用いて測定されていない部分（図７中の破線部分）を補完することにより、全体の蛍光プロファイルを推定することができる。

さらに、得られた蛍光プロファイルに対して、第一実施形態と同様に、蛍光分離演算処理部１７０による分離演算処理を適用することもできる。

本実施形態によれば、試料からの蛍光特性の概略を手軽に検出できる。さらに、第一実施形態と同様に、蛍光分離演算によって即座に個々の蛍光特性を観察することができる。

［第三実施形態］
図８は、本発明の第三実施形態によるレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を概略的に示している。図８において、図１に示された部材と同一の参照符号で指示された部材は同様の部材であり、その詳しい説明は省略する。本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡は、第一実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡と比較して、分光検出装置だけが相違しており、そのほかの構成は同じである。

図８に示されるように、本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡３００の分光検出装置３６０は、特定の波長帯の光を選択的に透過するバンドパスフィルター３６１と、バンドパスフィルター３６１を光軸に直交する軸周りに回転させる回転デバイス３６２と、バンドパスフィルター３６１を透過した光を検出するための検出器１６５とを有している。

本実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡は、分光検出装置を除けば、第一実施形態のレーザー走査型共焦点顕微鏡とまったく同様に動作する。つまり、試料Ｓに対する励起光の照射、試料Ｓから発生した検出光の分光検出装置への導光、分光検出装置によって検出された情報の処理は第一実施形態と同様である。

図９は、蛍光試薬の典型的な蛍光特性（破線）とバンドパスフィルター３６１の透過特性（実線）とを示している。バンドパスフィルター３６１の透過特性は、光の入射角に対して依存性を有しており、あらかじめ想定される光の入射角に従って精密に設計されている。このため、バンドパスフィルター３６１に対する光の入射角が設計値からずれると、それに応じて透過特性も変化する。

図９の上段は、設計値の入射角に対するバンドパスフィルター３６１の透過特性を示しており、図９の下段は、設計値からずれた入射角に対するバンドパスフィルター３６１の透過特性を示している。

バンドパスフィルター３６１は、設計値の入射角に対しては、中心波長λ０で幅αの波長帯の光を透過する。バンドパスフィルター３６１の透過特性は、バンドパスフィルター３６１がもつ干渉膜によって決まる。光を透過する波長帯の中心波長λ０と幅α０は干渉膜により自在に設定できる。バンドパスフィルター３６１は、検出する目的の蛍光に合った幅α０の透過波長帯をもつものが準備される。透過波長帯の幅α０は、第一実施形態と第二実施形態におけるスリット１６４と同様な働きをする。

回転デバイス３６２によってバンドパスフィルター３６１が回転されて設計の使用状態から傾けられると、バンドパスフィルター３６１に対する光の入射角が設計値からずれるため、例えば、図９の下段に示されるように、中心波長λ０’で幅α’の波長帯の光を透過するようになる。つまり、バンドパスフィルター３６１の回転に応じて、バンドパスフィルター３６１の透過特性の透過波長帯の中心波長がλ０からλ０’にシフトするとともに、幅がαからα’に変化する。この透過特性の変化は入射角に対して線形に発生する。透過波長帯の中心波長の波長シフト量Δα’はバンドパスフィルター３６１の回転角によって決まる。

従って、回転デバイス３６２によってバンドパスフィルター３６１の回転角、言い換えれば光軸に対するバンドパスフィルター３６１の傾きを制御することによって、透過帯（の中心波長）を変えることができる。これにより、検出器３６５によって検出される光の波長を変えることができる。

つまり、回転デバイス３６２によってバンドパスフィルター３６１を所定の角度範囲内で一方向に一定の送り量ずつ回転させることにより、検出器３６５によって検出される光を波長掃引することができる。検出器３６５によって検出される光の波長帯の移動方向はバンドパスフィルター３６１の回転方向によって決まる。波長帯は、短波長側から長波長側へ移動されても、または長波長側から短波長側へ移動されてもよい。波長掃引の波長領域（掃引幅）は、回転デバイス３６２によって回転されるバンドパスフィルター３６１の角度範囲によって決まる。

また波長シフト量Δα’は、試料中の蛍光物質や必要な情報精度に応じて、第一実施形態または第二実施形態に従って決められるとよい。

これまでの説明から分かるように、本実施形態では、バンドパスフィルター３６１は、検出光を分光するための分光器と、分光器によって分光された光から任意の幅の波長帯の光を抽出するための光抽出部として機能する。回転デバイス３６２は、バンドパスフィルター３６１によって抽出される光の波長帯を移動させる波長帯移動部として機能する。回転デバイス３６２は、これに限らないが、例えばガルバノメーターやステッピングモーターで構成される。

本実施形態では、微弱な蛍光強度を回折格子などの分散素子によって分散させないため、損失が少なく、蛍光を非常に強い強度で検出できる。ただし、バンドパスフィルター３６１における入射角変化に対する透過波長帯の移動は第一実施形態と第二実施形態による波長帯の移動に比べて小さいため、波長掃引の波長領域（掃引幅）は第一実施形態と第二実施形態に比べて狭い。このため本実施形態は、比較的狭い波長領域（例えば３０ｎｍ〜４０ｎｍ程度、より好ましくは５０ｎｍ〜６０ｎｍ程度）において詳細な分光検出を行なうことに適している。

また、バンドパスフィルター３６１を傾けて使用すると、設計された透過特性とは若干変化するため、好ましくは、あらかじめ入射角に対するバンドパスフィルター３６１の透過特性を測定・算出しておき、分光検出されたデータを較正するとよい。例えば、バンドパスフィルター３６１の設計された入射角と傾き角に対して、透過波長帯で得られる蛍光総量の相対変化を較正用の比率データとして持っていれば、検出データを容量に較正することができる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態によるレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を概略的に示している。第一実施形態による分光検出における、蛍光試薬の典型的な蛍光特性と、検出器によって検出される光の波長帯と、波長帯が移動される波長領域とを示している。第一実施形態による分光検出によって得られた蛍光プロファイルを示している。第一実施形態による分光検出によって得られる二つの蛍光成分αとβを含む蛍光プロファイルと、二つの蛍光成分αとβのそれぞれの蛍光プロファイルとを示している。二つの蛍光成分αとβが波長軸λ方向にスタック化された蛍光分光画像γと、二つの蛍光成分αとβのそれぞれの蛍光画像を示している。本発明の第二実施形態による分光検出における、蛍光試薬の典型的な蛍光特性と、検出器によって検出される光の波長帯と、波長帯が移動される波長領域とを示している。第二実施形態による分光検出において、不連続な測定点における情報と、補完によって得られる全体の蛍光プロファイルとを示している。本発明の第三実施形態によるレーザー走査型共焦点顕微鏡の構成を概略的に示している。蛍光試薬の典型的な蛍光特性（破線）と図８中のバンドパスフィルターの透過特性（実線）とを示している。

符号の説明

１００…レーザー走査型共焦点顕微鏡、１１０…光源部、１１１…レーザー光源、１１２…光ファイバー、１１３…射出部、１２０…ダイクロイックミラー、１３０…走査光学系、１４０…対物レンズ、１５０…共焦点検出部、１５１…凸レンズ、１５２…ピンホール、１５３…凸レンズ、１６０…分光検出装置、１６１…分散素子、１６２…回転デバイス、１６３…収束レンズ、１６４…スリット、１６４ａ…遮光板、１６４ｂ…遮光板、１６５…検出器、１７０…蛍光分離演算処理部、３００…レーザー走査型共焦点顕微鏡、３６０…分光検出装置、３６１…バンドパスフィルター、３６２…回転デバイス、３６５…検出器。

Claims

励起光ビームを射出するための光源部と、
前記光源部からの励起光ビームを走査するための走査光学系と、
励起光ビームを試料に照射するための対物レンズと、
試料に照射される励起光と励起光照射に起因して試料から生じる検出光（蛍光と反射光を含む）とを分離するための分離光学素子と、
共焦点効果を得るための共焦点検出部と、
検出光を分光検出するための分光検出装置と、
前記分光検出装置によって得られた蛍光スペクトル情報から蛍光の種類ごとのスペクトル成分に対応した蛍光スペクトル情報を分離演算する蛍光分離演算処理部を備えており、
前記分光検出装置は、検出光を分光するための分光器と、前記分光器によって分光された光から任意の幅の波長帯の光を抽出するための光抽出部と、前記光抽出部によって抽出された光を検出するための検出器と、前記光抽出部によって抽出される光の波長帯を一定の送り量ずつシフトさせることで波長掃引を行なう波長帯移動部とを有しており、
前記波長帯移動部による波長帯のシフト量が前記光抽出部によって抽出される光の波長帯の幅よりも小さい、光走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、前記分光器は、検出光を波長ごとに異なる方向に偏向させる分散素子を備えている、光走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、前記光抽出部は、開口幅を変更可能な機械的な可変開口を備え、前記可変開口を規定している遮光板が抽出する光の波長帯の上限と下限を定める、光走査型共焦点顕微鏡。
請求項２において、前記波長帯移動部は、分散素子を光軸に直交する軸周りに回転させる回転デバイスを備えている、光走査型共焦点顕微鏡。
請求項１において、前記分光器は、特定の波長帯の光を選択的に透過するバンドパスフィルターを備え、前記波長帯移動部は、前記バンドパスフィルターを光軸に直交する軸周りに回転させる回転デバイスを備えている、光走査型共焦点顕微鏡。