JP4818262B2 - 光ビームの光のスペクトルを選択検出するための光学装置 - Google Patents

Description

本発明は、光ビームの光のスペクトルを選択検出するための光学装置に関し、特に共焦点走査顕微鏡内で検出光ビームの光を検出するのに好適な光学装置であって、光ビームを空間的にスペクトル分解するための手段と、予め設定可能な連続スペクトル領域を選択するための選択手段と、検出器とを有するものに関する。

走査顕微鏡において試料は、光ビームで照射されて、試料から放射される反射光または蛍光が好適な検出手段に供給される。
照射される光ビームは、ビーム偏向機構によって蛇行状に試料上を案内される。
ビーム偏向機構は、一般に互いに直交する２つの方向に傾動可能なミラーからなる。
試料から放射する光は、照射される光ビームの位置に対応して測定される。

試料から放射する光のスペクトルを選択検出するための光学装置として、冒頭に記載された形式の光学装置が公知である。
例えば、特許文献１に開示された光学装置では、いわゆる、マルチバンド検出器により異なる波長成分を同時に検出することができる。
このような装置では、使用されるマルチバンド検出器がきわめて複雑で、そのためきわめて高価であるという欠点がある。
マルチバンド検出器は、マルチチャネル検出を可能とするが、必ずしも、多くの用途で要求されていない。
この点に関して、多くの顕微鏡検査法では、むしろ、単一チャネル検出システムが望ましい。

単一チャネルスペクトル検出器が使用される冒頭に記載された形式の光学装置についても公知である。
特許文献２に開示された走査顕微鏡では、調整可能な２つの絞りによって下限波長及び上限波長が設定可能であり、下限波長よりも小さい波長を有する検出光の光成分または上限波長よりも大きな波長を有する検出光の光成分は阻止される。
この場合、絞りの位置は、例えば、検出ビーム光路中に存在する照射光の残留成分が阻止されるように設定されている。

この公知の装置は、特に、複数の蛍光色素で着色された試料を異なるレーザのラインで順次走査しようとする実験では欠点を有することがわかる。
検出動作の際に、絞りは、それぞれのスペクトル検出領域に適合するために、また照射光の残留成分をマスクするために、迅速かつ連続して移動されなければならない。
しかし、絞りの最大可能な移動速度は、せいぜいフレームごとの多色検出に間に合うにすぎない。
それに対して、試料を異なるレーザのラインでラインごとに走査させようとする場合、絞りはその移動性能からみると遅すぎることがわかる。
独国特許出願公開第１９９０２６２５号明細書 独国特許出願公開第１０１５６６９５号明細書

そこで、本発明は、冒頭に記載された形式の光学装置に簡単な手段を用いて、（フレームごとまたはラインごとの）順次走査による多色検出及びλ走査を高精度で実施することができるように構成及び改善することを目的としている。

本発明によれば、前記目的は、請求項１の特徴部分によって達成される。
すなわち、本発明の光学装置は、選択された連続スペクトル領域内において予め設定可能なスペクトル部分領域をマスクするために、光ビーム中に導入可能な少なくとも１つの遮断素子(blocking element)が設けられているように構成されている。

本発明では、光ビームの光のスペクトルを選択検出するために、マルチバンド検出器を使用すると、それに対応する装置の構造がしばしば不必要に複雑となり、製造コストが高価となるという認識が前提となっている。
さらに、検出されるべき光ビームのスペクトル領域の特定部分がマスクされる場合に、スペクトルの選択検出は、意外なほど簡単に単一チャネル検出器システムで実行できるという認識が前提となっている。
本発明によれば、このために光ビーム中に導入可能な少なくとも１つの遮断素子が設けられている。
光ビーム中に導入される遮断素子は、検出されるべき波長成分のスペクトル選択に関して高い柔軟性を与えることができ、上述したような、例えば、ラインごとの順次走査で多色検出する場合に必要となるような迅速な適合性を可能にしている。

好ましい実施形態としては、選択手段がスリット絞り機構として具体化される。
具体的には、スリット絞り機構は、上限波長より上の波長を有する光成分をマスクするための第１絞りと、下限波長より下の波長を有する光成分をマスクするための第２絞りとを備えている。

好ましくは、検出器に対する絞りの相対的な位置は、互いに独立して変更可能である。
これにより、選択可能なスペクトル領域の幅及びその絶対的な位置を、スペクトルとして扇状に広げられた検出光ビームの範囲内で自由に選択することができる。
具体的に応用する場合には、２つの絞りを共に移動させて、例えば、λ走査において幅約５ｎｍのスペクトル領域のみが絞り開口を通過できるように範囲設定する。
絞り開口は、画像ごとに数ｎｍずつ移動させることができる。
得られたデータ記録から各画素におけるスペクトルのプロファイルを求めることができる。
複数の蛍光色素で処理された試料を観察する場合には、２つの絞りは、順次走査で多色検出するために、幅約５０ｎｍのスペクトル領域が絞り開口を通過できるように位置決めすればよい。

好ましくは、光ビームをスペクトル分解するための手段の下流に、焦点面を生成するための集束光学系(focusing optic)が設けられている。
最も単純な集束光学系は、集束レンズである。
スリット絞り機構及び遮断素子は、焦点面内に位置決めされて、マスクエッジをできるだけ明確にすることができる。

好ましい改良としては、光ビーム中で遮断素子の位置が変更できる。
この場合、位置の変更は、一方で、異なるスペクトル領域をマスクするために分割面内で行なわれる。
他方、位置の変更は、光路中への完全な進入又は光路からの退避として行なわれる。
こうして、例えば、検出光ビーム中に進入する遮断素子の数は、顕微鏡システムを作動させる場合の異なるレーザのライン数に合せておくとよい。
その結果、全体で３つの異なるレーザのラインが設定されている場合、それに対応して３つの遮断素子が光ビーム中に設けられる。
光ビーム中に残存する単波長の励起光がスリット絞り機構の２つの絞りの一方でマスクされる場合、２つの遮断素子だけを光ビーム中に導入すれば十分である。

遮断素子のさらなる迅速な適合性に関しては、遮断素子を傾動可能に設定することが好ましい。
遮断素子を回転させるための駆動手段としては、例えば、ステッピングモータ、圧電モータまたは検流計が用いられる。
この場合、遮断素子は、薄板として具体化される。
対応するスペクトル領域をマスクする場合には、薄板は、その広い面側が光ビーム中に位置決めされる。
それに対して、対応するスペクトル領域を検出器へ通す場合、薄板が傾動され、その狭い面側が光ビーム中に位置決めされる。
具体的には、薄板の幅は、５０〜１００μｍ程度とすればよい。
４００〜８００ｎｍの可視スペクトル領域が焦点面において２０ｍｍの空間的広がりを有するスペクトル分割の場合、この薄板の幅は、１〜２ｎｍのスペクトル幅に相当する。
他方で、薄板の厚さはほぼ１０μｍ程度とすることで、狭い面側が光ビーム中に位置決めされる状態において、遮断素子はスペクトルにほとんど影響を及ぼさなくなる。

遮断素子によりマスクされたスペクトル領域の情報内容が完全に失われるのを防止するために、遮断素子は鏡面仕上げしておくことが望ましい。
さらに、マスクされた波長成分が鏡面仕上げされた遮断素子によって反射されて入射する光検出器が備えられる。
光検出器は遮断素子に対して角度を固定して配置しておき、較正のためまたはオンライン制御による測定に利用すればよい。

好ましい実施形態としては、光ビームをスペクトル分解するための手段は、分散素子(dispersive element)として具体化される。取扱いが簡単であることから、特に、プリズムまたは格子が好適である。
プリズムの場合スペクトル分割の非線形性を考慮することが必要であるが、これは遮断素子が独立して位置決めまたは傾動させる場合に問題とならない。

その時間応答がきわめて良好であることから、好ましくは光電子増倍管が検出器として使用されている。
また、別の形式の検出器を使用してもよく、特に、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）の使用が好ましい。
ＡＰＤは、高感度であることが特徴で、通常は小さな検出領域を有している。

本発明の技術思想を有利に構成および改善するには種々の手段がある。
この点に関して、一方では請求項１の従属請求項を、他方では図面を参照した本発明の実施例の以下の説明を参照されたい。
本発明の有利な実施例の説明と関連して、一般的に有利な構成および改善形態を説明する。

図１は、共焦点走査顕微鏡１の基本的な構成を示しており、この走査顕微鏡１は、検出光ビーム３の光のスペクトルを選択検出するための光学装置２を有する。

走査顕微鏡１は、光源４としてレーザ５を含み、照射光ビーム６を放射する。
励起絞り(excitation diaphragm)７を通過後、照射光ビーム６は、ビームスプリッター８から走査モジュール９へ反射される。
そして、この走査モジュール９は、カルダン懸架式走査ミラー１０を有し、走査ミラー１０は、ビームが走査光学系(scanning optic)１１、管光学系(tube optic)１２、および、顕微鏡光学系(microscope optic)１３を通過して試料１４上に到達または通過するようにガイドしている。
光源４から到来する照射光ビーム６は、図１では実線で示している。

試料１４から放射する検出光ビーム３は、破線で示されているが、顕微鏡光学系１３、管光学系１２、走査光学系１１を通過し、走査モジュール９を介してビームスプリッター８に到達する。
検出絞り(detection diaphragm)１５を通過後、検出光ビーム３は、第１集束光学系(first focusing optic)１６として設けられたレンズ１７に当たる。
その後、検出光ビーム３は、空間的スペクトル分解手段１８として設けられたプリズム１９に当たる。
プリズム１９の後に配置された、第２集束光学系２０として設けられたレンズ２１によって、スペクトル的に扇状に広げられた検出光ビーム３は焦点面に集束される。

焦点面に位置決めされたスリット絞り機構２２は、２つの絞り２３、２４で形成されている。
これらの２つの絞り２３、２４の間に全体で３つの遮断素子２５、２６、２７が配置されている。
スリット絞り機構２２および遮断素子２５、２６、２７を通過する際に、図２で詳述するように、検出光ビーム３から特定の予め設定可能なスペクトル領域がマスクされる。
スリット絞り機構２２および遮断素子２５、２６、２７を通過後に検出光ビーム３中に残存する波長成分は、検出器２８として設けられた光電子増倍管２９で検出される。

図２は、絞り２３、２４および遮断素子２５、２６、２７によって検出光ビーム３から特定波長成分をマスクする基本的な作用をさらに詳細に示している。
図１と同じ符号は同じ部材を表す。
上述したように、この検出光ビーム３は、プリズム１９を通過後にレンズ２１によって焦点面に集束される。
２つの絞り２３、２４は、焦点面内に配置されて、予め設定可能な連続スペクトル領域を選択することができる。
絞り２３は、絞り２３の位置によって限定される上限波長よりも大きな波長を有する光成分を阻止する。
同様に、絞り２４は、絞り２４の位置によって決定される下限波長よりも小さな波長を有する光成分を阻止する。
上限波長および下限波長を変更するために、これらの絞り２３、２４は、図１に両方向矢印で示すように、移動させることができる。

絞り２３、２４の間には３つの遮断素子２５、２６、２７が配置されており、これらの絞り２３、２４によって選択されたスペクトル領域内に配置する予め設定可能なスペクトル部分領域は、これらの遮断素子で検出光ビーム３からマスクされることができる。
遮断素子２５、２６、２７は、幅約５０〜１００μｍ、厚さ約１０μｍの薄板として構成されている。
薄板は、図示しない検流計により、両方向矢印で示された軸を中心に傾動することができる。
遮断素子２５、２６、２７がその狭い面を光電子増倍管２９の方向に合せる場合、検出光ビーム３はほとんど影響を受けない。
特定スペクトル領域をマスクしようとする場合、対応する遮断素子２５、２６、２７は、例えば９０°まで傾動し、その広い面を検出光ビーム３の方向に合せる。

図２に示す実施例において、スリット絞り機構２２と検出器２８との間にレンズ３１が配置されている。
レンズ３１が検出光を集束し、検出光は比較的小さな活性検出領域を有する、例えば、ＡＰＤ等の検出器にも結像することができる。

異なる実験パラメータ及び例えば異なる照射レーザのラインを有する異なる顕微鏡システムの両方に装置を柔軟に適合するために、遮断素子２５、２６、２７は焦点面に沿って移動させることができ、それぞれの場合において異なるスペクトル領域をマスクすることができる。
さらに、遮断素子は用途ごとに交換し、例えば幅狭または幅広の遮断素子に取り替えることもできる。

遮断素子２７は、鏡面仕上げにされている。
遮断素子２７によって反射された検出光ビーム３の波長成分は、それに対応する角度で位置決めされた光検出器３０に当り、較正のためまたはオンライン制御による測定のために検出される。

最後に、上述した実施例は、特許請求の範囲の記載を説明するものにすぎず、特許請求の範囲の記載がこの実施例に限定されないことを特に指摘しておく。

検出光ビームの光のスペクトルを選択検出するための本発明に係る光学装置を備えた共焦点走査顕微鏡を示す構成図。 図１の光学装置を示す拡大図。

符号の説明

１ ・・・走査顕微鏡
２ ・・・光学装置
３ ・・・検出光ビーム
４ ・・・光源
５ ・・・レーザ
６ ・・・照射光ビーム
７ ・・・励起絞り
８ ・・・ビームスプリッター
９ ・・・走査モジュール
１０ ・・・走査ミラー
１１ ・・・走査光学系
１２ ・・・管光学系
１３ ・・・顕微鏡光学系
１４ ・・・試料
１５ ・・・検出絞り
１６ ・・・第１集束光学系
１７ ・・・レンズ
１８ ・・・スペクトル分解するための手段
１９ ・・・プリズム
２０ ・・・第２集束光学系
２１ ・・・レンズ
２２ ・・・スリット絞り機構
２３ ・・・第１絞り
２４ ・・・第２絞り
２５ ・・・遮断素子
２６ ・・・遮断素子
２７ ・・・遮断素子
２８ ・・・検出器
２９ ・・・光電子増倍管
３０ ・・・光検出器
３１ ・・・レンズ

Claims (10)

1. 共焦点走査顕微鏡（１）に使用されて検出光ビームのスペクトルを選択検出する共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）であって、
   前記検出光ビームを空間的にスペクトル分解する空間的スペクトル分解手段（１８）と、
   前記検出光ビームのスペクトルのうち予め設定可能な連続スペクトル領域を選択する選択手段と、
   前記検出光ビームの光路に配置されているとともに前記選択された連続スペクトル領域内において予め設定可能なスペクトル部分領域をマスクする少なくとも１つの遮断素子（２５、２６、２７）と、
   前記検出光ビームのうち前記選択手段および前記少なくとも一つの遮断素子（２５、２６、２７）によって遮断されなかった波長成分を検出する検出器（２８）と、
   前記空間的スペクトル分解手段（１８）と前記少なくとも一つの遮断素子（２５、２６、２７）との間に配置された集束光学系（２０）と、
   前記検出光ビームのうち前記少なくとも一つの遮断素子（２５、２６、２７）によってマスクされて反射された波長成分を検出する光検出器（３０）とを備え、
   前記少なくとも一つの遮断素子（２５、２６、２７）が、鏡面仕上げされた薄板であり、
   前記薄板が、前記集束光学系（２０）の焦点面に配置されているとともに前記焦点面に沿って移動可能であり、
   前記薄板が、前記予め設定可能なスペクトル部分領域をマスクするために前記薄板の広い面を前記検出光ビームに交差させた状態と前記予め設定可能なスペクトル部分領域を通すために前記広い面を前記検出光ビームに平行にした状態とを相互に切り替えるように傾動可能であることを特徴とする共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
2. 前記選択手段が、スリット絞り機構（２２）であることを特徴とする請求項１記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
3. 前記スリット絞り機構（２２）が、前記焦点面内に位置決めされていることを特徴とする請求項２に記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
4. 前記スリット絞り機構（２２）が、前記検出光ビームのうち上限波長より長い波長を有する光成分をマスクする第１絞り（２３）と、前記検出光ビームのうち下限波長より短い波長を有する光成分をマスクする第２絞り（２４）とを有していることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
5. 前記第１絞り（２３）および第２絞り（２４）の前記検出器（２８）に対する相対的な位置が、互いに独立して変更可能であることを特徴とする請求項４記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
6. 前記薄板が、５０〜１００μｍの幅を有していることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一つに記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
7. 前記薄板が、１０μｍの厚さを有していることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか一つに記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
8. 前記検出器（２８）が、光電子増倍管（２９）またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）であることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか一つに記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
9. 前記空間的スペクトル分解手段（１８）が、分散素子であることを特徴とする請求項１乃至請求項８のいずれか一つに記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。
10. 前記分散素子が、プリズム（１９）であることを特徴とする請求項９記載の共焦点走査顕微鏡用光学装置（２）。

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