JP4601266B2

JP4601266B2 - レーザ顕微鏡

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Publication number: JP4601266B2
Application number: JP2003155634A
Authority: JP
Inventors: 基彦鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: JP2004354937A; US20040245445A1; US20100172021A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標本に対してレーザ光をスキャン照射し、標本からの光を検出するレーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ顕微鏡は、レーザ光源からのレーザ光を対物レンズにより標本上に集光させ、その集光点をスキャナを用いて光学的に２次元走査し、標本からの光（特に蛍光）を対物レンズを通し、光検出器で検出し、２次元の情報を得るようにしている。このようなレーザ顕微鏡は、共焦点ピンホールを用いると、焦点位置以外からの光をカットできるため、光軸方向の分解能があることが知られており、この特性を利用して対物レンズと標本の相対的な位置関係を可変しながら、複数の２次元スライス画像を取得し、これらの２次元画像を３次元に構築することにより標本の３次元画像を取得することもできる。
【０００３】
一方、このようなレーザ顕微鏡には、光検出光路に分光器を配置し、標本の発する光の分光検出を可能にしたものがある。
【０００４】
例えば、特許文献１または特許文献２には、共焦点レーザ顕微鏡の光検出光路に分光器を配置し、標本の放出する光（蛍光、ラマン光）を波長分光し、この波長分光された光を光検出器で検出することにより、標本から発せられる光を分光検出するものが開示されている。
【０００５】
また、同じく特許文献１や特許文献３には、標本から光を光ファイバを介して分光器に伝送し、波長分光するものが開示されている。
【０００６】
これらの技術は、いずれも共焦点のレーザ顕微鏡に関するもので、前者では、標本から発せられた光を、スキャナに戻してディスキャンした後、標本面と共役な位置に配置される共焦点ピンホールを介して分光器に入射させ、また、後者についても、標本からの光をスキャナでディスキャンした後、標本面と共役な位置に配置される光ファイバの入射端面に入射させ、分光器に導光させるようにしている。この場合、光ファイバの入射端面は、入射される光の回折径と同じ径であることが必要で、十分に小さな径になることから、シングルモードファイバが用いられている。
【０００７】
ところで、最近、レーザ光源にＩＲ極短パルスレーザを用いた多光子レーザ顕微鏡が実用化されている。この多光子レーザ顕微鏡は、ＩＲ極短パルスレーザを用いることで、ＩＲ極短パルスレーザの照射された標本の焦点面のみに多光子現象を発生させるようにしたものである。この多光子レーザ顕微鏡においては、多光子現象により蛍光指示薬を励起し蛍光を発するようにして焦点面のみの標本像を取得することができるので、これまで共焦点効果を得るために必要であった共焦点ピンホールを不要にすることができる。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−５６２４４号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開２００２−１４０４３号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開２００２−２６７９３３号公報
【００１１】
【特許文献４】
特許第３２８３４９９号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、このような多光子レーザ顕微鏡についても、分光器を用いて標本の発する蛍光の分光検出を行なおうとすると、上述した第１または第２の特許文献に開示されるものは、標本から発せられた光をスキャナに戻しディスキャンしたのち、分光器に入射し、また、第１または第３の特許文献に開示されるものは、標本からの光をスキャナでディスキャンしたのち、光ファイバの入射端面に入射し分光器に導光するようになる。このため、いずれの方法も、標本からの光が分光器に達するまで、多数の光学部材で反射、透過を繰り返すようになり、また、分光器までの光路が長くなることから、検出光は減衰して益々微弱なものとなり、Ｓ／Ｎが悪化し、精度の高い分光検出ができないという問題があった。
【００１３】
そこで、従来、多光子レーザ顕微鏡については、共焦点ピンホールを不要にできることに着目して、第４の特許文献に開示されるように、標本からの蛍光をスキャナでディスキャンする前の光路途中から蛍光検出器側に導くようにしたものが考えられている。
【００１４】
このような光路途中に分光器を配置すると、分光器に入射される標本からの光は、ディスキャンされていないため、分光器の入射口（一般にはスリット）に入射される光は、スキャン状態にあって入射角が変化したものとなる。ここで、標本からの光は、円形状をした光ビームであるため、入射光の殆どを分光器内に導くことができず、このため分光検出に必要な十分な光量が確保できず、Ｓ／Ｎが悪化し、精度の高い分光検出を行なうことができないという問題があった。
【００１５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、高いＳ／Ｎを得られ、精度の高い分光検出を行なうことができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、前記対物レンズと前記光走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の前記標本上の集光位置から発する光を分離する波長分離手段と、前記波長分離手段により分離された光路に円形の入射端が配置され前記標本からの光が入射される光ファイバと、前記光ファイバの出射端に配置され、該出射端から出射される前記標本からの光が入射され当該光を分散して検出する分光器とを具備し、前記対物レンズの瞳を前記光ファイバの入射端に投影する投影レンズを前記波長分離手段により分離された光路上に備え、前記光ファイバの出射端が直線状に形成されその直線の向きが前記分光器の分散方向と直交する向きに配置されていることを特徴としている。
【００２０】
この結果、本発明によれば、標本からの光を光走査手段まで戻すことなく波長分離手段により分光器側に分離するようにしたので、分光器までの光路途中での光の損失を最小限にすることができる。これにより、多光子吸収現象により標本より放出される非線型現象の極めて微弱な光についても、光路上の損失を最小限にして、効率よく分光器に入射させることができる。また、光路上にピンホールがなくなるので、対物レンズで集光された微弱な光を無駄なく、効率よく分光器に入射させることができる。
【００２１】
また、本発明によれば、標本からの光は、光ファイバ中を伝送されるが、光ファイバの出射端が直線状に形成されているので、標本からの光の形状を分光器の入射スリットの形状に合わせることができ、対物レンズで集光した光を無駄なく分光器に導くことができる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、光ファイバの入射端が対物レンズの瞳と共役の位置にあるので、ディスキャンされていない光であっても、漏れなく、光ファイバに取り込むことができる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２４】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用されるレーザ顕微鏡の概略構成を示している。
【００２５】
図において、１は顕微鏡本体で、この顕微鏡本体１は、水平方向のベース部１ａに直立して胴部１ｂが設けられている。また、この胴部１ｂの先端には、ベース部１ａと平行にアーム部１ｃが設けられている。
【００２６】
顕微鏡本体１のアーム部１ｃには、レボルバ２が設けられている。このレボルバ２には、複数の対物レンズ３が保持されていて、これら対物レンズ３を選択的に観察光路の光軸上に位置させることができるようになっている。
【００２７】
顕微鏡本体１の胴部１ｂには、ステージ４が配置されている。ステージ４には、標本５が載置されている。また、ステージ４は、図示しない焦準機構により、観察光路上に位置される対物レンズ３の光軸方向に沿って上下動するようになっている。
【００２８】
一方、６はレーザ光源で、このレーザ光源６には、標本５面に多光子吸収による非線形現象を起こさせるためのＩＲ極短パルスレーザ光（ＩＲ極短パルスコヒーレント光）を発するものが用いられる。
【００２９】
レーザ光源６より発せられるＩＲ極短パルスレーザ光の光路には、光学ユニット７が配置されている。光学ユニット７は、顕微鏡本体１のアーム部１ｃ上方に配置されており、光走査手段としてのスキャナ８、リレーレンズ９、反射ミラー１０、結像レンズ１１、波長分離手段としてのダイクロイックミラー１２および投影レンズ１３を有している。
【００３０】
レーザ光源６より発せられるＩＲ極短パルスレーザ光は、スキャナ８に入射される。スキャナ８は、互いに直交方向に走査される走査ミラー８ａ、８ｂを有していて、これら走査ミラー８ａ、８ｂによりＩＲ極短パルスレーザ光を２次元方向に偏向する。スキャナ８で２次元偏向された光は、リレーレンズ９を透過した後、反射ミラー１０により光路を折り返され、結像レンズ１１よりダイクロイックミラー１２を透過して対物レンズ３の瞳径を満足するように入射する。ここでのダイクロイックミラー１２は、レーザ光源６のＩＲ極短パルスレーザ光を透過し、後述する標本５からの光を反射偏向（分離）するような特性を有している。
【００３１】
対物レンズ３を透過した光は、ステージ４上の標本５に集光される。この場合、標本５上の集光点は、光学的に２次元走査される。また、標本５上では、ＩＲ極短パルスレーザ光により対物レンズ３の焦点面で多光子吸収による非線形現象が発生し、蛍光、ラマン光などの光が放出される。
【００３２】
標本５から放出された光は、対物レンズ３に取り込まれ、対物レンズ３を出射した後、ダイクロイックミラー１２で反射偏向（分離）される。
【００３３】
ダイクロイックミラー１２の分離光路には、投影レンズ１３および光ファイバ、ここではバンドルファイバ１４の入射端面１４ａが配置されている。投影レンズ１３は、図２に示すように対物レンズ３の瞳３ａをバンドルファイバ１４の入射端面１４ａに投影するためのもので、対物レンズ３の瞳と共役の位置にバンドルファイバ１４の入射端面１４ａを位置させるようになっている。
【００３４】
バンドルファイバ１４の出射端１４ｂ側には、集光レンズ１５を介して分光器１６が配置されている。この場合、バンドルファイバ１４は、入射端面１４ａを図３中Ａに示すように円形状に形成されるとともに、出射端１４ｂを図３中Ｂに示すようにファイバ束を直線状に配列した形状に形成され、この出射端１４ｂより出射される光を、集光レンズ１５により分光器１６の入射口の直線状のスリット１６１に集光させるようにしている。つまり、分光器１６のスリット１６１に対して直線状のバンドルファイバ１４の出射端１４ｂを平行に配置し、出射端１４ｂからの光を効率よく分光器１６のスリット１６１に伝えるようにしている。
【００３５】
図４は、分光器１６の概略構成を示すものである。分光器１６は、スリット１６１が上述した集光レンズ１５の集光位置に配置されている。スリット１６１を通過した光は、凹面ミラー１６２で反射し、平行光となって反射型回折格子１６３に入射される。そして、この回折格子１６３で分光された光は、さらに凹面ミラー１６４で反射され、光検出器１６５で検出され、電気信号に変換されて図示しないコンピュータに送られ、データ処理される。この場合、分光器１６のスリット１６１は、回折格子１６３における光の分散方向と直交する向きに配置されている。これにより、バンドルファイバ１４の出射端１４ｂのファイバ束の配列方向は、分光器１６における光の分散方向と直交する向きになっている。
【００３６】
なお、分光器１６の構成は、一例であって、他の構成のものを用いることもできる。
【００３７】
次に、このように構成された多光子レーザ顕微鏡の動作を説明する。
【００３８】
この場合、レーザ光源６よりＩＲ極短パルスレーザ光（ＩＲ極短パルスコヒーレント光）が発せられると、このレーザ光は、光学ユニット７のスキャナ８に入射される。そして、互いに直交方向に走査される走査ミラー８ａ、８ｂにより偏向され、リレーレンズ９を透過し、その後、ミラー１０により光路を折り返され、結像レンズ１１より対物レンズ３の瞳径を満足するように入射される。
【００３９】
対物レンズ３を透過した光は、ステージ４上の標本５に集光される。この場合、標本５上の集光点は、光学的に２次元走査されている。
【００４０】
標本５では、ＩＲ極短パルスレーザ光により対物レンズ３の焦点面で多光子吸収による非線形現象が発生し、蛍光、ラマン光などの光が放出される。
【００４１】
標本５から放出した光は、対物レンズ３に取り込まれ、対物レンズ３を出射し、ダイクロイックミラー１２で反射偏向（分離）される。つまり、標本５から放出した光は、スキャナ８まで戻ることなく、手前のダイクロイックミラー１２で分離される。ダイクロイックミラー１２で分離された光は、投影レンズ１３を介してバンドルファイバ１４の入射端面１４ａに入射される。この場合、バンドルファイバ１４の入射端面１４ａには、投影レンズ１３により対物レンズ３の瞳が投影されており、標本５からの光が２次元偏向している状態で入射される。
【００４２】
この場合、バンドルファイバ１４の入射端面１４ａは、図３中Ａに示すように円形状に形成されているので、２次元偏向に応じて角度が変化する標本５からの円形状の光ビームを漏れなく取り込むことができる。また、バンドルファイバ１４の出射端１４ｂは、図３中Ａに示すように分光器１６のスリット１６１の形状に合わせてファイバ束を直線状に配列した形状になっており、この出射端１４ｂからの出射光を直線状に配列された光ビームに変更するようにしているので、各ファイバ束から出射する光の角度が２次元偏向にともなって変動していても、これらの出射光を集光レンズ１５で集光することで、幅の狭いスリット１６１に漏れなく導くことができる。これにより、標本５からの検出光を無駄なく分光器１６内に導くことができるので、高いＳ／Ｎの分光検出を実現することができる。
【００４３】
この場合、分光器１６のスリット１６１に集光された光は、その後、凹面ミラー１６２により平行光に変換され、回折格子１６３に導かれ、さらに凹面ミラー１６４で反射され、光検出器１６５で検出され、電気信号に変換されて図示しないコンピュータでデータ処理され、所定の分光検出が行なわれる。
【００４４】
従って、このようにすれば、標本５上に２次元偏向されたレーザ光により標本５から放出された光をスキャナ８まで戻すことなくダイクロイックミラー１２により分光器１６側に分離するようにしたので、従来のスキャナでディスキャンして分光器に入射させるようにしたものと比べ、分光器１６までの光路途中での光の損失を最小限にすることができる。これにより、多光子吸収現象により標本５より放出される非線型現象の蛍光やラマン光などの極めて微弱な光についても、光路上の損失を最小限にして、効率よく分光器１６に入射させることができるので、高いＳ／Ｎの分光検出を実現することができる。
【００４５】
また、共焦点ピンホールを使用しないので、対物レンズ３で集光された標本５からの光をすべて分光器１６に導くことができるので、多光子吸収現象により発生する蛍光、ラマン光のような微弱な光の検出に特に有効である。
【００４６】
さらに、標本５からの光は、２次元偏向している状態でバンドルファイバ１４に入射されるが、バンドルファイバ１４を伝送することで出射端１４ｂで、分光器１６のスリット１６１に沿った直線状の出射光となり、この直線状の出射光が出射端１４ｂから分光器１６に入射されるので、つまり、標本５からの光の形状を分光器１６のスリット１６１の形状に合わせることができるので、対物レンズ３で集光した光を無駄なく分光器に導くことができ、明るく（Ｓ／Ｎのよい）、精度の高い分光検出を行なうことができる。
【００４７】
さらに、バンドルファイバ１４の入射端面１４ａが常に対物レンズ３の瞳３ａと共役の位置にあるので、ディスキャンされていない光であっても、漏れなく、バンドルファイバ１４に取り込むことができる。
【００４８】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００４９】
図５は、第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５０】
この場合、ダイクロイックミラー１２で分離された光路上には、集光レンズ２１が配置されている。また、集光レンズ２１の集光位置には、光ファイバとしてマルチモードファイバ２２の入射端２２ａが配置されている。また、マルチモードファイバ２２の出射端２２ｂには、分光器１６が配置されている。
【００５１】
マルチモードファイバ２２には、コア径が数μｍ〜１０００μｍ程度のものが用いられる。また、集光レンズ２１には、ダイクロイックミラー１２から入射される標本５からの２次元偏向する光を十分に集光し、マルチモードファイバ２２の入射端２２ａに入射できるものが用いられる。
【００５２】
この場合も、分光器１６の入射口に直線状のスリット（不図示）がある場合は、マルチモードファイバ２２の出射端２２ｂを直線状に成型するようになる。勿論、マルチモードファイバ２２の出射端２２ｂには、出射される光を分光器１６の入射口に集光させるための集光レンズが設けられる。
【００５３】
その他は、図１と同様である。
【００５４】
このようにすれば、ダイクロイックミラー１２により分離された光路上の集光レンズ２１の集光位置に、マルチモードファイバ２２の入射端２２ａが配置されるので、マルチモードファイバ２２として、コア径が数μｍ〜１０００μｍ程度のものを使用することができる。
【００５５】
また、標本５からの検出光をスキャナ８まで戻すことなくダイクロイックミラー１２により分光器１６側に分離することができ、さらに、マルチモードファイバ２２を伝送させることにより、直線状に成型された出射端側で分光器１６のスリット１６１に沿った直線状の出射光とすることもできるので、第１の実施の形態で述べたと同様な効果を期待することができる。
【００５６】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００５７】
図６は、第３の実施の形態の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５８】
この場合、対物レンズ３を保持するレボルバ２には、対物レンズ３の瞳位置に近接してダイクロイックミラー１２とバンドルファイバ１４の入射端面１４ａが配置されている。
【００５９】
このようにすると、バンドルファイバ１４の入射端面１４ａが対物レンズ３の瞳位置に近接していることから、ダイクロイックミラー１２を介して入射端面１４ａに入射される標本５からの放出光の２次元移動の移動量を小さくできるので、バンドルファイバ１４の径に余裕を持たせることで、投影レンズを用いることなく直接入射端面１４ａに入射させることができる。
【００６０】
また、バンドルファイバ１４の入射端面１４ａが対物レンズ３の直後に位置することで、対物レンズ３の軸外光もより多く入射させることが可能となり、標本５からの放出光を、さらに効率よく分光器に入射させることができ、高いＳ／Ｎにより分光検出を行なうことができる。
【００６１】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、レーザ光源にＩＲ極短パルスレーザを用いた多光子レーザ顕微鏡について述べたが、例えば、多光子レーザ顕微鏡以外の共焦点効果を利用しない顕微鏡で、標本から放出される蛍光の分光検出を行なうようなものにも適用できる。
【００６２】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６３】
なお、上述した実施の形態には、以下の発明も含まれる。
【００６４】
（１）光ファイバは、バンドルファイバであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【００６５】
（２）バンドルファイバは、出射端のファイバ束を直線状に形成したことを特徴とする（１）記載のレーザ顕微鏡。
【００６６】
（３）光ファイバは、マルチモードファイバであることを特徴とする請求項４記載のレーザ顕微鏡。
【００６７】
（４）マルチモードファイバは、出射端を直線状に形成したことを特徴とする（３）記載のレーザ顕微鏡。
【００６８】
（５）光ファイバの出射端より出射される光を分光器の入射口に集光させる集光レンズを設けたことを特徴とする請求項１乃至４、（１）乃至（４）のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【００６９】
（６）波長分離手段と光ファイバは、対物レンズの瞳位置に近接して配置されることを特徴とする請求項１乃至３、（１）乃至（５）のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【００７０】
（７）前記波長分離手段により分離された光路に配置され、前記対物レンズの瞳を前記光ファイバの入射端面に投影する投影レンズをさらに設けたことを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【００７１】
（８）前記波長分離手段により分離された光路に配置され、前記標本からの光を前記光ファイバの入射端面に集光させる集光レンズをさらに設けたことを特徴とする請求項１乃至３、（１）乃至（４）のいずれかに記載のレーザ顕微鏡。
【００７２】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、高いＳ／Ｎを得られ、精度の高い分光検出を行なうことができるレーザ顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態に用いられる投影レンズとバンドルファイバの入射端面の関係を説明する図。
【図３】第１の実施の形態に用いられるバンドルファイバの出射端と分光器のスリットの関係を説明する図。
【図４】第１の実施の形態に用いられる分光器の概略構成を示す図。
【図５】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図６】本発明の第３の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…顕微鏡本体、１ａ…ベース部、１ｂ…胴部
１ｃ…アーム部、２…レボルバ、３…対物レンズ
４…ステージ、５…標本、６…レーザ光源
７…光学ユニット、８…スキャナ、８ａ．８ｂ…走査ミラー
９…リレーレンズ、１０…反射ミラー、１１…結像レンズ
１２…ダイクロイックミラー、１３…投影レンズ
１４…バンドルファイバ、１４ａ…入射端面
１４ｂ…出射端、１５…集光レンズ、１６…分光器
１６１…スリット、１６２…ミラー
１６３…回折格子、１６４…ミラー、１６５…光検出器
２１…集光レンズ、２２…マルチモードファイバ
２２ａ…入射端、２２ｂ…出射端

Claims

レーザ光を発生するレーザ光源と、
前記レーザ光源からのレーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
前記対物レンズと前記光走査手段との間に配置され、前記レーザ光源からのレーザ光の前記標本上の集光位置から発する光を分離する波長分離手段と、
前記波長分離手段により分離された光路に円形の入射端が配置され前記標本からの光が入射される光ファイバと、
前記光ファイバの出射端に配置され、該出射端から出射される前記標本からの光が入射され当該光を分散して検出する分光器とを具備し、
前記対物レンズの瞳を前記光ファイバの入射端に投影する投影レンズを前記波長分離手段により分離された光路上に備え、
前記光ファイバの出射端が直線状に形成されその直線の向きが前記分光器の分散方向と直交する向きに配置されていることを特徴とするレーザ顕微鏡。