JP4136891B2 - 蛍光画像／スペクトルを測定する蛍光測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、化学、工業、臨床、バイオ分野などの分野で使用される分析装置に関し、特に試料を特定の波長の励起光で励起し、発生した蛍光を測定することにより、試料の蛍光画像と試料上の所望の位置での蛍光スペクトルのいずれか又は両方を作成するための蛍光測定装置に関するものである。

スライドガラス、ゲル又は膜上に保持され、蛍光物質にてラベル化されたタンパク質などの対象物を含む微小領域（数μｍ〜数十μｍ）の蛍光を検出するには、測定しようとする領域に励起光を照射し、その励起光により励起されて対象物から発生する蛍光を検出する。そのような測定では、励起光として主にレーザー光が用いられている。

一例として、レーザ光源から発したレーザ光を試料に照射し、そのレーザ光の照射により励起された試料から発した蛍光を、共焦点光学系を通して結像させ、分光して検出するようにしたレーザ顕微鏡がある。そこでは励起光学系は光束を小さくするためのピンホールや、集光して試料上に照射するための集光レンズを用いて構成されている。

そのようなレーザ顕微鏡として、異なる波長を有する複数のレーザ光を発するレーザ光源と、このレーザ光源から発せられる各波長のレーザ光から特定波長のレーザ光を選択するレーザ光選択手段と、このレーザ光選択手段により選択されたレーザ光を走査して試料に照射する手段と、この照射手段により照射されたレーザ光により励起された試料が発した蛍光を通過させる如く試料の面と共役な位置に設置され蛍光の波長に対応した開口径に切換え可能な共焦点ピンホールと、この共焦点ピンホールの開口径を蛍光の波長にあわせて切換え制御する制御装置とを備えた走査型レーザ顕微鏡が提案されている（特許文献１参照。）。

そのような蛍光測定装置では、必要な波長ごとにレーザー光源が設置され、それらは共通した光学系により試料に集光されて照射されるように構成されている。
特開平１１−２７１６３６号公報

励起光としてレーザー光を使用すると波長走査ができないため、蛍光スペクトルは測定することができない。
また、励起光としてレーザー光を使用し、光学系としてレンズを使用した光学系を使用した従来の蛍光検出器を用いて蛍光画像を作成しようとすると、次のような問題が生じる。

(1)励起波長が限られるため、使用する蛍光物質が制限される。また、必要な励起波長が複数である場合には、使用する波長ごとにレーザー装置が必要になる。
(2)複数のレーザーを用いる場合、共通したレンズ系を通るため色収差が生じる。
(3)また、上記(2)の色収差により、１つの波長で焦点をあわせると、他の波長では焦点がボケる。そのためため蛍光検出の解像度が劣る。
(4)また、上記(2)の色収差により、１つの波長で焦点をあわせると、他の波長では焦点がボケ、検出しようとする微小領域以外のところにも強い励起光が照射されることになる。その結果、蛍光物質の褪色が生じ、正確な蛍光定量ができない。

一方、励起光としてレーザー光に替えて白色光を用いることが考えられる。白色光からはいろいろな波長が得られるが、波長あたりの光量が少ないので、単に光源を白色光源に替えただけでは、十分な検出感度を確保することはできない。
また、多波長を扱う場合、共通のレンズ系を使用すれば色収差に起因する問題は依然として残る。

そこで、本発明は、励起波長選択の自由度を大きくするとともに、検出感度を上げ、色収差に起因する問題を解決することのできる蛍光検出器を用いて蛍光画像や蛍光スペクトルを得ることができるようにすることを目的とするものである。

本発明の蛍光測定装置の第１の態様は、蛍光画像を得るためのものであり、白色光源、前記白色光源から出た光を分光する励起側分光手段、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、前記蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、前記蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備えた蛍光検出器と、試料と前記蛍光検出器を相対的に移動させ、前記蛍光検出器を試料上の所定の位置に位置決めする移動機構と、前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置情報と前記蛍光検出器による検出蛍光情報とから蛍光画像を作成する蛍光画像作成部とを備えている。

本発明の蛍光測定装置の第２の態様は、蛍光スペクトルを得るためのものであり、第１の態様におけるのと同じ蛍光検出器と移動機構の他に、励起側分光手段及び蛍光側分光手段の少なくとも一方の波長を走査することにより、前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置における蛍光スペクトルを測定するスペクトル作成部を備えている。

本発明の蛍光測定装置の第３の態様は、蛍光画像と蛍光スペクトルをともに得るためのものであり、上記の蛍光検出器と移動機構の他に、第１の態様における蛍光画像作成部と、第２の態様におけるスペクトル作成部とを備えている。

本発明では、白色光を分光するので、どの波長でも選択できるようになる。
励起光学系も蛍光光学系もレンズを使用しないので色収差をなくすことができ、解像度が劣ることがない。
またそれにより波長ごとに焦点を調整するような機構が不用なので、光学系が小型で簡単なものになる。

蛍光画像を作成する場合でも、蛍光スペクトルを測定する場合でも、蛍光を検出する位置を割り出すことが必要になる。その際、試料位置の基準点を決定するために、蛍光側分光手段の設定波長を励起側分光手段の設定波長と同一波長に設定し、移動機構により試料を移動させて試料上の特定のマークを検出することにより試料位置の基準点を検出する基準位置検出部を備えていることが好ましい。

本発明の蛍光測定装置に含まれる蛍光検出器における励起光学系と蛍光光学系は共通の結像光学系を備えたものとすることができる。
その際、励起光学系と蛍光光学系とは一部の光路を共通にしており、その共通の光路とそれぞれの光路との分岐位置に励起光と蛍光を分離するハーフミラー又はダイクロイックミラーを備えて励起光と蛍光を分離する光学系とすることができる。

励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものとすることができる。その際、その励起光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。そのピンホールにより、試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されて蛍光物質の褪色が生じるのを防ぐことができるので、正確な蛍光測定を行なうのに好都合である。

蛍光光学系も試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものとすることができる。その際、蛍光光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。そのピンホールにより、試料の所定領域のみの蛍光を検出するようにすることができるので、蛍光測定の解像度を向上させるのに好都合である。

また、励起光学系と蛍光光学系は試料面上に一方の焦点を共通にもつ共焦点光学系を構成しており、かつ試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点を共通の焦点としているものとすることができる。その際、共通の焦点の位置にピンホールを配置してもよい。このピンホールにより、試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されて蛍光物質の褪色が生じて正確な蛍光測定ができなくなるのを避けるとともに、試料の所定領域のみの蛍光を検出するようにしてその解像度を向上させることができる。

励起光学系は光源からの白色光又分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備えることができ、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系とすることができる。これにより、励起光密度を高めることができる。
その第２の光学系は分光に影響のない小さい角度で光を射出するように配置して、結像光学系の数を少なくすることができる。

本発明において、「焦点」の語は、結像光学系に光軸に平行な光線が入射したとき光線が収斂あるいはそこから光線が発散していくように見える点であると定義される狭義の焦点に限らず、光軸に対し傾斜した角度で結像光学系に光線が入射し結像している場合には、その結像点も含めて焦点と呼ぶ。
結像光学系として、シュワルツシルト鏡のほか、ウォルタ鏡や楕円面鏡、放物面鏡なども用いることができる。

シュワルツシルト鏡は、図４（Ａ）に示されるように、大きな凹面主鏡２６と小さな凸面副鏡２８を対向させたものであり、凹面主鏡２６の中央には凸面副鏡２８で反射された光束が通る孔が開けられている。これは双曲面と楕円鏡との組合わせからなり、それぞれの焦点の一方ａ（又はｂ）を光源、他方ｂ（又はａ）を集光点とするものである。シュワルツ鏡は像を縮小したり拡大したりすることができ、また平行光（完全な平行光のみならず、平行光に近い擬似平行光も含む。以下の記述においても同じ。）も出すことができる。

ウォルタ鏡は双曲面鏡と楕円面鏡とを組み合わせたミラーである。双曲面鏡の右側焦点から出た発散光は双曲面鏡を反射後、左側焦点から出た発散光のように振る舞う。一方、楕円面鏡では左側焦点から出た発散光は楕円面鏡を反射した後、右側焦点に集光する。したがって、双曲面鏡の左側焦点と楕円面鏡の左側焦点を一致させることにより、双曲面鏡の右側焦点から出た発散光は双曲面鏡、楕円面鏡と反射した後、楕円面鏡の右側焦点に集光する。（なお、ここで、右側、左側というのは説明の便宜上定めているだけで、左右を入れ替えても同じである。）

楕円面鏡は楕円面の一方の焦点から出た発散光を他方の焦点に集光させるように作用する。
放物面鏡は平行光を一点に集光したり、逆に一点から出た発散光を平行光に変換するように作用する。

白色光源は紫外から赤外に及ぶ波長範囲内の光を発生ものである。白色光源としては、キセノンランプのほか、水銀キセノンランプ、ハロゲンランプなどを用いることができる。
励起側分光手段はグレーティング、プリズム及び分光フィルターのうちのいずれかである。

蛍光側分光手段もグレーティング、プリズム及び分光フィルターのうちのいずれかである。
励起光学系は励起側分光手段により分光された光を集光して光束密度をあげるために鏡を組み合わせてなる結像光学系をさらに備えることができる。

本発明の蛍光測定装置は、光源として白色光源を使用し、励起光を試料に照射する励起光学系にも試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系にも、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を備えた蛍光検出器を用いる。そのため、白色光を分光することによりどの波長でも選択できるようになり、レンズを使用しないので色収差をなくすことができ、解像度が劣ることがなく、また色収差がなくなることにより波長ごとに焦点を調整するような機構が不用で光学系が小型で簡単なものになる。

励起光学系と蛍光光学系が共通の結像光学系を備えたものとすれば、光学系が簡単になる。
励起光学系と蛍光光学系の一方又は両方が試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しているものとすれば、光学系が簡単になる。
励起光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置すれば、そのピンホールにより、試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されて蛍光物質の褪色が生じるのを防ぐことができるので、正確な蛍光測定を行なうのに好都合である。

蛍光光学系で試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置にピンホールを配置すれば、そのピンホールにより、試料の所定領域のみの蛍光を検出するようにすることができるので、蛍光測定の解像度を向上させるのに好都合である。

励起光学系が光源からの光を試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備えた場合には、励起光密度を高めることができる。
その第２の光学系が分光に影響のない小さい角度で光を射出するように配置すれば、結像光学系の数を少なくすることができる。

次に、図面を参照して実施例について詳細に説明する。
図１は蛍光画像を作成する態様の一実施例である。
１は蛍光検出器を表わしている。まず、蛍光検出器１について説明する。２は白色光源としてのキセノンランプである。光源２からの光を励起側分光器４に集めるために、光源２に関し分光器４とは反対側に凹面ミラー６が配置されている。

分光器４で分光されて所定の波長とされた励起光の光量を多く利用するために、レンズを用いず鏡を組み合わせてなる結像光学系としてのシュワルツシルト鏡８が配置され、励起光はそのシュワルツシルト鏡８により集光され、位置２４に結像する。

位置２４の励起光の像を一方の焦点とし、試料面上に他方の焦点を結ぶ励起光学系としての共焦点光学系を構成するために、レンズを用いず鏡を組み合わせてなる結像光学系としてのシュワルツシルト鏡１０，１４が配置されている。シュワルツシルト鏡１０，１４の間の光路上には光路を９０°折り曲げるハーフミラー１２が配置されている。シュワルツシルト鏡１０はシュワルツシルト鏡８で集光された励起光の像からの光を受光し、分光に影響のない小さい角度で射出し、ハーフミラー１２の手前の位置に結像２４ａを結ぶように配置されている。また、シュワルツシルト鏡１４はシュワルツシルト鏡１０から射出された励起光をハーフミラー１２での反射を介して集光し、試料面１６に像を結ぶように配置されている。シュワルツシルト鏡１４は試料面１６から発生する蛍光を集光して分光に影響のない小さい角度で射出し、ハーフミラー１２を透過して分光器２０の入口付近に像１９を結ぶ。分光器２０に入射した蛍光は、分光器２０で分光され、検出器２２で検出される。検出器２２はＰＭＴ（光電子増倍管）又はシリコンフォトダイオードなどである。

この実施例では、位置２４ａ，試料面１６上の点及び位置１９は結像点であり、狭義の焦点ではないが、これらの点も焦点と呼ぶ。
この実施例ではシュワルツシルト鏡１４は励起光学系と蛍光光学系に共通の共焦点光学系を構成している。焦点２４ａは励起光学系における試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点であり、焦点１９は蛍光光学系における試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点である。

この実施例の蛍光検出器１では、分光に影響のない小さい角度でハーフミラー１２に入射させるようにシュワルツシルト鏡１０，１４を配置したことにより、試料への照射面積、光量、蛍光検出の解像度などを減少させることなく、シュワルツシルト鏡の数を少なくしている。シュワルツシルト鏡の数が少なくなると、光学系を小さくすることができ、光軸調整も容易になり、コスト低下につながる。

さらに、この実施例の蛍光検出器１では、励起光学系の焦点２４ａの位置に励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４を配置し、蛍光光学系の焦点１９の位置に蛍光検出の解像度を向上させるピンホール３６を配置している。

共焦点光学系をなす励起光学系において、焦点２４ａは試料面１６上の焦点と共役な関係にあるので、その焦点２４ａの位置にピンホール３４を配置することにより、試料面１６に照射される励起光スポットの大きさを制限することができ、試料面１６において検出しようとする微小領域以外の部分が励起光で照射されるのを防ぐことができる。

一方、共焦点光学系をなす蛍光光学系においても、焦点１９は試料面１６上の焦点と共役な関係にあるので、その焦点１９の位置にピンホール３６を配置することにより、試料面１６上の所定の微小領域以外からの蛍光が分光器２０に入射するのを排除して所定領域のみの蛍光を検出することができ、その結果として蛍光検出の解像度を向上させることができる。

この実施例では、光源２からの白色光は凹面ミラー６により励起側分光器４に集められ、分光器４で分光されて所定の波長の励起光となる。その励起光はシュワルツシルト鏡８により集光され、位置２４に結像される。結像された励起光はシュワルツシルト鏡１０によってハーフミラー１２に射出される。励起光はハーフミラー１２で反射されてシュワルツシルト鏡１４に入射し、シュワルツシルト鏡１４によって試料面１６の所定の領域に集光されて照射される。励起光により励起されて試料面１６から発生した蛍光は、同じシュワルツシルト鏡１４により集光され、シュワルツシルト鏡１４から射出されてハーフミラー１２を透過し、蛍光側分光器２０に入射する。蛍光は分光器２０で分光され、検出器２２で検出される。

後の実施例においても同様であるが、ハーフミラー１２に替えてダイクロイックミラーを使用していもよい。ダイクロイックミラーは、励起光波長成分を反射し、それよりも長波長の蛍光を透過させる特性をもったものを使用する。シュワルツシルト鏡１０，１４が分光に影響のない小さい角度で光を射出させるように配置されているのは、ハーフミラー１２に替えてダイクロイックミラーを使用した場合に、ダイクロイックミラーでの反射と透過に関する波長特性に影響を与えないようにすることである。

次に、この実施例で蛍光画像を作成するための構成について説明する。
６０は蛍光画像を作成しようとする試料プレートである。試料プレート６０は試料ステージ６２に固定されている。試料ステージ６２はＸ−Ｙステージであり、水平面内のＸ，Ｙ方向に移動することができ、検出位置を平面内の任意の位置に移動させることができるものである。このような試料ステージ６２に試料プレート６０を固定することにより、蛍光検出器１と試料プレート６０を相対的にＸ軸上とＹ軸上に移動させながら蛍光を取得し、蛍光画像を構成することができる。

試料ステージ６２には試料ステージ６２をＸ，Ｙ方向に移動させるための駆動機構が設けられている。その駆動機構を介して試料ステージ６２の駆動を制御するために、試料ステージ駆動制御部７０が設けられている。試料ステージ６２、その駆動機構及び試料ステージ駆動制御部７０は、試料と蛍光検出器を相対的に移動させ、蛍光検出器を試料上の所定の位置に位置決めする移動機構を構成している。また、移動機構は、蛍光検出器１を試料面に対して相対的に垂直方向に移動させて焦点をあわせる自動焦点（オートフォーカス）機構を含むことができる。

試料プレート６０は各工程のために試料ステージ６２から外され、再度試料ステージに固定されることがある。試料プレート６０の着脱を繰り返すと、装着位置が数μｍから数十μｍの範囲でずれることがある。そのため、図２に示されるように、試料プレート６０には幾つかの基準マーク６４を設けておくのが好ましい。基準マーク６４は蛍光を発するものではなく、励起光を照射し、その反射光の強弱によって認識することができるものであるとする。

その基準マーク６４を検出するために、基準位置検出部７２が設けられている。基準位置検出部７２は、蛍光側分光器２０が励起波長と同じ波長を選択するように蛍光側分光器２０を設定し、蛍光検出器１を基準マーク６４と相対的にＸ軸、Ｙ軸上を移動させながら強度を検出することにより、基準マーク６４を検出する。基準位置検出部７２は検出した基準マーク６４を画像処理して基準点を決定し、目的試料位置を補正する情報として供する。

蛍光画像を作成するために蛍光画像作成部７４が設けられている。蛍光画像作成部７４は、試料ステージ駆動制御部７０から、位置決めされた蛍光検出位置情報を取り込んで基準位置検出部７２が検出した基準位置に基づいて蛍光検出位置情報を補正し、蛍光検出器１の検出器２２から検出蛍光情報を取り込み、蛍光検出位置情報と検出蛍光情報とから蛍光画像を作成する。

７６は表示部であり、蛍光画像作成部７４により作成された蛍光画像を表示する。
試料ステージ駆動制御部７０、基準位置検出部７２及び蛍光画像作成部７４は専用のコンピュータ７８により、又はパーソナルコンピュータにより実現される。

図３は蛍光スペクトルを測定する態様の一実施例である。
蛍光検出器１、試料ステージ６２、試料ステージ駆動制御部７０、基準位置検出部７２の構成は、図１に示された実施例のものと同じである。

この実施例では、蛍光スペクトルを測定するために、スペクトル作成部８０を備えている。スペクトル作成部８０は、試料ステージ駆動制御部７０から、位置決めされた蛍光検出位置情報を取り込んで基準位置検出部７２が検出した基準位置に基づいて蛍光検出位置情報を補正し、励起側分光器４及び蛍光側分光器２０の少なくとも一方の波長を走査することにより、蛍光検出位置における蛍光スペクトルを測定する。

表示部７６は、スペクトル作成部８０により測定された蛍光スペクトルを表示する。
スペクトル作成部８０も試料ステージ駆動制御部７０、基準位置検出部７２とともに専用のコンピュータ７８により、又はパーソナルコンピュータにより実現される。

本発明のさらに他の態様は、蛍光画像と蛍光スペクトルを１台の装置でともに測定できるようにするものである。そのような測定装置は、図１と図３の実施例における試料ステージ駆動制御部７０、基準位置検出部７２、蛍光画像作成部７４及びスペクトル作成部８０を全て備えることにより実現することができる。

蛍光による画像化としては、目的試料位置での蛍光強度の他に、蛍光スペクトルなどの蛍光情報を検出して画像化してもよい。
試料表面には数μｍ〜数十μｍの幅で凹凸があるので、正確な蛍光検出ができないことがある。そのため、試料表面から蛍光検出部までの高さを可変にしておき、目的試料の各位置でオートフォーカスするようにすればよい。

蛍光検出器１は図１及び図３に示されたものの他に種々の構成をとることができる。次に、蛍光検出器１の幾つかの構成を示す。図１又は図３の実施例の光学系をこれらの光学系に置き換えたものも本発明の実施例である。

図４（Ｂ）は図１及び図３の実施例に含まれる光学系におけるシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。９，１３及び１７はウォルタ鏡又は楕円面鏡であり、シュワルツシルト鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図１の実施例及び図３の実施例で光学系を図４（Ｂ）の光学系に置き換えても動作はそれぞれ図１の実施例及び図３の実施例の動作と同じである。

図５（Ａ）は他の蛍光検出器の例である。光源２からの光は凹面ミラー６により励起側分光器４に集められ、分光器４で分光されて所定の波長とされた励起光はシュワルツシルト鏡８により集光され、位置２４に結像する。ここまでの光学系は図１のものと同じである。

位置２４の励起光の像を一方の焦点とし、試料面上に他方の焦点を結ぶ励起光学系としての共焦点光学系を構成するために、シュワルツシルト鏡１０，１４が配置されている。シュワルツシルト鏡１０，１４の間の光路上には光路を９０°折り曲げるハーフミラー１２が配置されている。シュワルツシルト鏡１０は焦点２４からの励起光を平行光として射出し、シュワルツシルト鏡１４はシュワルツシルト鏡１０からの平行光とされた射出光をハーフミラー１２を介して受光し、試料面１６の所定の領域の焦点に集光して照射する。

シュワルツシルト鏡１４は試料面１６が励起光の照射により励起されて発生する蛍光を集光し平行光にして射出する。シュワルツシルト鏡１４とともに蛍光光学系としての共焦点光学系を構成するために、ハーフミラー１２を挟んでシュワルツシルト鏡１８が配置されている。ハーフミラー１２は励起光を反射するとともに、シュワルツシルト鏡１４から射出した蛍光を透過させる。シュワルツシルト鏡１８は蛍光側分光器２０の入口に焦点１９をもち、分光器２０の入口に蛍光を集光して入射させる。分光器２０で分光された蛍光は検出器２２で検出される。

この実施例では、光源２からの白色光は凹面ミラー６により励起側分光器４に集められ、分光器４で分光されて所定の波長の励起光となる。その励起光はシュワルツシルト鏡８により集光され、位置２４に結像される。結像された励起光はシュワルツシルト鏡１０に集光され平行光としてハーフミラー１２に射出される。励起光はハーフミラー１２で反射されてシュワルツシルト鏡１４に入射し、シュワルツシルト鏡１４によって試料面１６の所定の領域に集光されて照射される。励起光により励起されて試料面１６から発生した蛍光は、同じシュワルツシルト鏡１４により集光され、平行光とされてハーフミラー１２を透過し、シュワルツシルト鏡１８により集光されて蛍光側分光器２０に入射する。蛍光は分光器２０で分光され、検出器２２で検出される。

図５（Ｂ）は図５（Ａ）の光学系のシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。９はウォルタ鏡又は楕円面鏡でシュワルツシルト鏡８に替わるもの、１１，１５及び１８ａは放物面鏡でシュワルツシルト鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図５（Ｂ）の光学系の動作は図５（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図６（Ａ）はさらに他の蛍光検出器を表わしたものであり、図５（Ａ）の蛍光検出器において、励起光学系の焦点２４の位置にピンホール３４を配置し、蛍光光学系の焦点１９の位置にピンホール３６を配置したものである。

図６（Ｂ）は図６（Ａ）の光学系のシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９はシュワルツシルト鏡８に替わるもの、放物面鏡１１，１５及び１８ａはシュワルツシルト鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図６（Ｂ）の光学系の動作は図６（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図７（Ａ）はさらに他の蛍光検出器を表わす。この蛍光検出器は、図１に示されたピンポール３４，３６が設けられていない点で相違している。ピンポール３４，３６を設けないことによって光軸調整が容易になる。

図７（Ｂ）は図７（Ａ）の光学系のシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。９，１３及び１７はウォルタ鏡又は楕円面鏡であり、シュワルツシルト鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図７（Ｂ）の光学系の動作は図７（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図８（Ａ）はさらに他の蛍光検出器を表わす。この蛍光検出器でも、シュワルツシルト鏡１０，１４は分光に影響のない小さい角度でハーフミラー１２に光を入射させるように配置されているが、図７の蛍光検出器と比較すると、シュワルツシルト鏡１０，１４による結像の位置が異なっている。図８の蛍光検出器では、シュワルツシルト鏡１０から射出された励起光がハーフミラー１２で反射された後に位置４０に結像するようにシュワルツシルト鏡１０が配置されている。また、シュワルツシルト鏡１４は、像４０からの励起光を集光して試料面１６上に結像するとともに、試料面１６から発生した蛍光を励起光の像と同じ位置４０に結像するように配置されている。蛍光はその結像点４０からハーフミラー１２を透過して分光器２０へ入射する。

この蛍光検出器でもシュワルツシルト鏡１４は励起光学系と蛍光光学系に共通の共焦点光学系を構成しているが、試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点４０は励起光学系の焦点であるとともに蛍光光学系の焦点を兼ねている。

この蛍光検出器においても、焦点４０の位置にピンホール４２を配置することができる。このピンホール４２は励起光スポットの大きさを制限するとともに、蛍光検出の解像度を上げる作用をし、共通の焦点４０の位置に１つ配置するだけですむ利点がある。
ピンホールの数が少なくなると、光学系が小さくなり、光軸調整も容易になり、コスト低下にもなる。

図８（Ｂ）は図８（Ａ）の光学系のシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９，１３及び１７はシュワルツシルト鏡８，１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図８（Ｂ）の光学系の動作は図８（Ａ）の光学系の動作と同じである。

以上の蛍光検出器は分光手段としてグレーティングを用いた分光器を使用している。それに対し、図９以降の実施例においては分光手段として分光フィルタを使用する。グレーティングは波長精度が高い利点があり、分光フィルタは検出感度を高める上で利点がある。

グレーティングを用いた蛍光検出器は蛍光画像作成と蛍光スペクトル測定の両方を行なうことができる。分光フィルタを用いた蛍光検出器は、蛍光画像作成はできるが、蛍光スペクトル測定は行なうことができない。

図９（Ａ）は分光フィルタを用いた蛍光検出器の参考例を表わす。光源２から発生する白色光はシュワルツシルト鏡１０により集光され、平行光として射出される。その射出された光は励起光を選択する分光フィルタ４４を透過して波長が選択されて励起光となる。励起光はハーフミラー１２で反射され、シュワルツシルト鏡１４で試料面１６に集光されて照射される。試料面１６から発生した蛍光はシュワルツシルト鏡１４で集光され、平行光となってハーフミラー１２を透過し、蛍光を選択するための分光フィルタ４６を透過してシュワルツシルト鏡１８に入射し、集光されて検出器２２に入射する。

この参考例では、シュワルツシルト鏡１０とシュワルツシルト鏡１４により励起光学系の共焦点光学系を構成しており、光源１２の像が試料面１６上に結ばれる。蛍光光学系においてはシュワルツシルト鏡１４とシュワルツシルト鏡１８により共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の蛍光像が検出器２２の入口に結ばれる。検出器２２の入口付近の蛍光の焦点位置には蛍光検出の解像度を上げるためのピンホール３６が配置されている。

図９（Ｂ）は図９（Ａ）の光学系のシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。放物面鏡１１，１５及び１８ａはシュワルツシルト鏡１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図９（Ｂ）の光学系の動作は図９（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図１０（Ａ）は分光フィルタを用いた他の蛍光検出器を表わす。図９の蛍光検出器と比較すると、励起光学系において試料の検出領域以外のところに強い励起光が照射されるのを防ぐために、励起光学系の共役な焦点位置に光源の像を形成し、その位置にピンホール３４を設けることができる構成になっている点で異なる。この蛍光検出器では、光源２からの白色光がシュワルツシルト鏡８ｂにより集光され、平行光として射出されてシュワルツシルト鏡８ｃ入射し、シュワルツシルト鏡８ｃにより焦点２４の位置に結像する。その焦点２４を経た白色光はシュワルツシルト鏡１０に入射し、シュワルツシルト鏡１０で平行光とされた後は、図９の蛍光検出器と同じ光学系によって光学フィルタ４４で波長が選択されて励起光となり、ハーフミラー１２からシュワルツシルト鏡１４をへて試料面１６に集光して照射される。試料面１６からの蛍光はシュワルツシルト鏡１４、ハーフミラー１２を経て、分光フィルタ４６で波長選択され、シュワルツシルト鏡１８により集光され、ピンホール３６を経て検出器２２に入射する。

励起光学系においてはシュワルツシルト鏡１０とシュワルツシルト鏡１４により共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の焦点と共役な関係にある焦点２４の位置に励起光スポットの大きさを制限するためのピンホール３４が配置されている。

図１０（Ｂ）は図１０（Ａ）の光学系におけるシュワルツシルト鏡を放物面鏡に置き換えた光学系を表わす。放物面鏡９ｂ，９ｃ，１１，１５及び１８ａはシュワルツシルト鏡８ｂ，８ｃ，１０，１４及び１８にそれぞれ替わるものである。
図１０（Ｂ）の光学系の動作は図１０（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図１１（Ａ）は分光フィルタを用いたさらに他の蛍光検出器を表わす。この蛍光検出器では、光源２からの白色光がシュワルツシルト鏡１０で集光され、平行光となって光学フィルタ４４を透過し、励起波長が選択される。その励起光はハーフミラー１２で反射され、シュワルツシルト鏡５０によって焦点４０に結像する。結像した励起光は、シュワルツシルト鏡５２とシュワルツシルト鏡１４によって試料面１６に集光されて試料を照射する。試料１６からの蛍光はシュワルツシルト鏡１４,５２により焦点４０に蛍光像を結ぶ。蛍光はシュワルツシルト鏡により集光され、平行光となってハーフミラー１２を透過し、蛍光を選択する光学フィルタ４６を経て検出器２２に入射して検出される。

この蛍光検出器ではシュワルツシルト鏡１４とシュワルツシルト鏡５２により励起光学系と蛍光光学系の共通の共焦点光学系を構成しており、試料面１６上の焦点と共役な位置に両光学系に共通の焦点４０をもっている。
この蛍光検出器では励起光スポットの大きさを制限するとともに、蛍光検出の解像度を上げるために、共通の焦点４０にピンホール４２を１つ配置するだけですむ。

図１１（Ｂ）は図１１（Ａ）の光学系におけるシュワルツシルト鏡を放物面鏡に置き換えた実施例を表わす。放物面鏡１１，１５，５１及び５３はシュワルツシルト鏡１０，１４，５０及び５２にそれぞれ替わるものである。
図１１（Ｂ）の光学系の動作は図１１（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図１２（Ａ）は分光フィルタを用いたさらに他の蛍光検出器を表わす。この蛍光検出器では、光源２からの白色光がシュワルツシルト鏡１０により集光され、分光に影響のない小さい角度で射出されてハーフミラー１２の手前の位置２４に光源の像を結ぶようにシュワルツシルト鏡１０が配置されている。光源からの光が、その後、光学フィルタ４４を経て励起光が選択され、ハーフミラー１２で反射されてシュワルツシルト鏡１４に入射し、集光されて試料面１６に照射されるようにシュワルツシルト鏡１４が配置されている。試料面１６からの蛍光はシュワルツシルト鏡１４で集光され、小さい角度で射出され、ハーフミラー１２を透過して光学フィルタ４６で蛍光が選択された後、検出器２２の入口の近くの位置１９に結像する。その後検出器２２に入射して検出される。

シュワルツシルト鏡１４は励起光学系と蛍光光学系で共通の共焦点光学系を構成している。励起光学系において試料面１６上の焦点に共役な焦点２４には励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４が配置され、蛍光光学系の共役な焦点１９には蛍光検出の解像度を向上させるピンホール３６が配置されている。

図１２（Ｂ）は図１２（Ａ）の光学系におけるシュワルツシルト鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた光学系を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡１３及び１７はシュワルツシルト鏡１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図１２（Ｂ）の光学系の動作は図１０（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図１３（Ａ）は分光フィルタを用いたさらに他の蛍光検出器を表わす。この蛍光検出器では、シュワルツシルト鏡１０から小さい角度で射出した光源２からの光が、ハーフミラー１２で反射された後に位置４０に結像するようにシュワルツシルト鏡１０が配置されている。シュワルツシルト鏡１０とハーフミラー１２の間の光路上に励起光を選択する光学フィルタ４４が配置されている。位置４０に結像した励起光が、シュワルツシルト鏡１４を経て試料面１６上に集光して照射されるようにシュワルツシルト鏡１４が配置されている。試料面１６からの蛍光はシュワルツシルト鏡１４で集光され、励起光の像と同じ位置４０に結像した後、ハーフミラー１２を透過して光学フィルタ４６で蛍光波長が選択された後、検出器２２に入射して検出される。

この蛍光検出器では励起光学系と蛍光光学系で共焦点光学系の共役な焦点４０が共通した位置にあり、その位置にピンホール４２を配置することにより、１つのピンホール４２が励起光スポットの大きさの制限と蛍光検出の解像度向上の両方の機能を果たすことができる。

図１３（Ｂ）は図１３（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９及び１７はシュワルツシルト鏡１０及び１４にそれぞれ替わるものである。
図１３（Ｂ）の光学系の動作は図１３（Ａ）の光学系の動作と同じである。

図１２（Ａ），（Ｂ）、図１３（Ａ），（Ｂ）の蛍光検出器では、ハーフミラー１２への入射角を分光に影響のない小さい角度にすることにより、シュワルツシルト鏡、ウォルタ鏡、楕円面鏡又は放物面鏡の数を減らしている。

図１４（Ａ）は光源からの白色光の受光光量を増加させるための励起光学系の一部を示したものである。光源２に関しシュワルツシルト鏡８ｆとは反対側に凹面ミラー６を配置して光源２からの白色光を集光してシュワルツシルト鏡８ｆに入射させ、シュワルツシルト鏡８ｆでさらに小さい像に結像した後、シュワルツシルト鏡１０に入射させる。その後、図１３と同様に、シュワルツシルト鏡１０により分光に影響のない小さい角度で射出される。その後の光学系は図１３と同じである。
この蛍光検出器では、シュワルツシルト鏡８ｆと１０の間の共焦点２４の位置にも励起光スポットの大きさを制限するピンホール３４を配置することができる。

図１４（Ｂ）は図１４（Ａ）の光学系におけるシュワルツ鏡をウォルタ鏡又は楕円面鏡に置き換えた実施例を表わす。ウォルタ鏡又は楕円面鏡９ｆ及び１３はシュワルツシルト鏡８ｆ及び１０にそれぞれ替わるものである。
図１４（Ｂ）の光学系の動作は図１４（Ａ）の光学系の動作と同じである。

本発明は化学、工業、臨床、バイオ分野などの分野において、試料を特定の波長の励起光で励起し、発生した蛍光を測定することにより試料を分析するために利用することができ、特に平面上に存在する試料の分析に適する蛍光測定装置として利用することができる。

本発明の蛍光測定装置で蛍光画像を作成する態様の一実施例を示す概略構成図である。 試料プレートの一例を示す平面図である。 本発明の蛍光測定装置で蛍光スペクトルを測定する態様の一実施例を示す概略構成図である。 （Ａ）は実施例で使用するシュワルツシルト鏡を示す概略正面図、（Ｂ）は図１、図３の実施例における光学系に替わる他の光学系を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器の他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は参考例における蛍光検出器の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。 （Ａ），（Ｂ）は実施例における蛍光検出器のさらに他の例を示す概略構成図である。

符号の説明

１ 蛍光検出器
２ 光源
４，２０ 分光器
６ 凹面ミラー
８，１０，１４，１８，８ｂ，８ｃ，８ｆ，５０，５２ シュワルツシルト鏡
９，９ｆ，１３，１７ ウォルタ鏡又は楕円面鏡
９ｂ，９ｃ，１１，１５，１８ａ，５１，５３ 放物面鏡
１２ ハーフミラー
１６ 試料面の焦点
１９，２４，２４ａ，４０ 共役な焦点
２２ 検出器
３４,３６，４２ ピンホール
４４，４６ フィルタ
６０ 試料プレート
６２ 試料ステージ
６４ 基準マーク
７０ 試料ステージ駆動制御部
７２ 基準位置検出部
７４ 蛍光画像作成部
７６ 表示部
７８ コンピュータ
８０ スペクトル作成部

Claims (11)

1. 白色光源、前記白色光源から出た光を分光する励起側分光手段、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、前記蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、前記蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備えた蛍光検出器と、
   試料と前記蛍光検出器を相対的に移動させ、前記蛍光検出器を試料上の所定の位置に位置決めする移動機構と、
   前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置情報と前記蛍光検出器による検出蛍光情報とから蛍光画像を作成する蛍光画像作成部とを備え、
   前記励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しており、かつ
   前記励起光学系は光源からの白色光又分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備え、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系である蛍光測定装置。
2. 白色光源、前記白色光源から出た光を分光する励起側分光手段、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、前記蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、前記蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備えた蛍光検出器と、
   試料と前記蛍光検出器を相対的に移動させ、前記蛍光検出器を試料上の所定の位置に位置決めする移動機構と、
   前記励起側分光手段及び前記蛍光側分光手段の少なくとも一方の波長を走査することにより、前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置における蛍光スペクトルを測定するスペクトル作成部とを備え、
   前記励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しており、かつ
   前記励起光学系は光源からの白色光又分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備え、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系である蛍光測定装置。
3. 白色光源、前記白色光源から出た光を分光する励起側分光手段、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起側分光手段により分光された光を励起光として試料に照射する励起光学系と、レンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系を含み前記励起光により励起された試料から発生した蛍光を集光する蛍光光学系と、前記蛍光光学系により集光された蛍光を分光する蛍光側分光手段と、前記蛍光側分光手段により分光された蛍光を検出する検出器とを備えた蛍光検出器と、
   試料と前記蛍光検出器を相対的に移動させ、前記蛍光検出器を試料上の所定の位置に位置決めする移動機構と、
   前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置情報と前記蛍光検出器による検出蛍光情報とから蛍光画像を作成する蛍光画像作成部と、
   前記励起側分光手段及び前記蛍光側分光手段の少なくとも一方の波長を走査することにより、前記移動機構により位置決めされた蛍光検出位置における蛍光スペクトルを測定するスペクトル作成部とを備え、
   前記励起光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成しており、かつ
   前記励起光学系は光源からの白色光又分光された励起光を、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に結像する第２の光学系を備え、その光学系もレンズを含まず鏡を組み合わせてなる結像光学系である蛍光測定装置。
4. 前記蛍光側分光手段の設定波長を前記励起側分光手段の設定波長と同一波長に設定し、前記移動機構により試料を移動させて試料上の特定のマークを検出することにより試料位置の基準点を検出する基準位置検出部を備えている請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
5. 前記励起光学系と蛍光光学系は前記結像光学系を共通のものとして備えている請求項１から４のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
6. 前記励起光学系で、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に試料面上での励起光スポットの大きさを制限するピンホールが配置されている請求項１に記載の蛍光測定装置。
7. 前記蛍光光学系は試料面上に一方の焦点をもつ共焦点光学系を構成している請求項１から６のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
8. 前記蛍光光学系で、試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点の位置に蛍光検出の解像度を向上させるピンホールが配置されている請求項７に記載の蛍光測定装置。
9. 前記励起光学系と蛍光光学系は試料面上の焦点と共役な関係にある他方の焦点を共通の焦点としている請求項７又は８に記載の蛍光測定装置。
10. 前記結像光学系はシュワルツシルト鏡、ウォルタ鏡、楕円面鏡及び放物線鏡のうちの少なくとも1つを含んでいる請求項１から９のいずれか一項に記載の蛍光測定装置。
11. 前記励起光学系と蛍光光学系とは一部の光路を共通にしており、その共通の光路とそれぞれの光路との分岐位置に励起光と蛍光を分離するハーフミラー又はダイクロイックミラーを備えている請求項１から１０に記載の蛍光測定装置。

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