JP4939703B2 - 走査型レーザー顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、走査型レーザー顕微鏡に適用されるミラーの駆動機構と、この駆動機構によって駆動されるミラーを備えた走査型レーザー顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特開２０００−５６２３３号公報には少なくとも１つの照射光波長分離用分散素子と、少なくとも一波長領域を対象とした顕微鏡照射方向への再反射のための、少なくとも部分的に反射する、照射光波長分離部分に配置された少なくとも１つの素子とから成っていて、顕微鏡、特に共焦点顕微鏡の照射光路における波長または波長領域を調整下で集束化するための装置が開示されている。
【０００３】
図２２は上記共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図である。ファイバーＦから出た光はレンズＫにより平行光にされ、分散素子ＤＰに入射する。分散素子ＤＰがレーザー光に含まれる波長に分解し、その分解された光線、例えばλ１、λ２、λ３は、これらが集束する位置に小さなミラーＳ１、Ｓ２、Ｓ３を有し、その他の部分は透明になっているミラー保有体である素子ＳＴに到達する。
【０００４】
なお照射光線は分光プリズムの中心から離れて上方部に導光されるので、個々の部分光線λ１、λ２、λ３はレンズＬ１の上方部に入り、そこから少し斜め下方に進んで小型ミラーＳ１、Ｓ２、Ｓ３上に集束し、そこでの反射と同時に光路はさらに下方に傾き、レンズＬ１を通過して素子ＤＰの下方に戻る。
【０００５】
小型ミラーＳ１、Ｓ２、Ｓ３からの戻り光線は分散素子ＤＰの通過後には分散が元どおり集束し、複数波長をもった光としてレンズを通過し、ピンホールを通過して顕微鏡に導かれ、図２３に示されているように顕微鏡対物レンズを通過して対象物に達する。
【０００６】
対象物からの蛍光は小型ミラーＳ１、Ｓ２・・・それぞれの中間領域に到達し、図２４に示すように小型ミラーＳ１、Ｓ２・・・の透光部分ＳＴを通過する。透光部分ＳＴを通過した各評価光路に対応して楔型プリズムＧＫ（ここではＧＫ１、２、３、４）が配置されており、この楔型プリズムＧＫを２軸に可動に構成することによって、波長域が制限可能に構成され、各評価光路に配置された光検出器で検出される。
【０００７】
上述したように、特開２０００−５６２３３号公報は走査型共焦点レーザー顕微鏡をベースに、少なくとも１つの照射光波長分離用分散素子と、少なくとも一波長領域を対象とした顕微鏡照射方向への再反射のための、少なくとも部分的に反射する、照射光波長分離部分に配置された少なくとも１つの素子とを有し、照射光路における波長または波長領域を調整下で集束可能に構成することにより、波長分離のための光学的フィルター（励起光と蛍光を分離するためのダイクロイックミラー）を必要としない、自由度の高い走査型共焦点レーザー顕微鏡を提供可能にしている。
【０００８】
しかし、レーザー光は光学系を通過、または反射することにより、徐々にそのビーム品質を劣化させる。この劣化は一方的に起こり、復元することはない。ビーム品質が劣化すると、本来対物レンズが有する集光性能がでなくなり、回折スポットが広がってしまうため、共焦点レーザー顕微鏡としての面内解像度、共焦点効果ともに劣化させてしまう。つまり、共焦点レーザー顕微鏡の性能は特に、照明光路における光学的な精度によるところが大きい。
【０００９】
レーザー光のビーム品質劣化の原因として、特にミラーの面精度不良に起因する場合が多い。通常、ミラーは１／１０λ以下の面精度が要求されるが、特開２０００−５６２３３号公報に係る構成では、小型ミラーＳ１、Ｓ２・・・に対してレーザー光は集光して反射されるので、より高い面精度が要求される。また、ミラー面に付着する挨がビーム品質の劣化に重大な影響を及ぼす。
【００１０】
この埃について考慮すると、自然界に存在し装置内を浮遊した挨がミラー面に付着する可能性がある。それに加えて、レーザー光を集光させると集光位置で光トラップ効果が生じるので、装置内に浮遊している挨をレーザー光そのものが集塵する可能性もある。更に、近年、蛍光蛋白を使用したアプリケーションとして、蛍光退色法が広く利用されるようになった。この手法は単にレーザー光を試料に照射して試料からの蛍光を検出するだけでなく、試料の蛍光物質を積極的に退色させ、蛍光物質の復元を観察する方法で、通常の蛍光観察に比べると、強いレーザーパワーが要求される。従って上述したような光トラップによる集塵の可能性が更に高まる。
【００１１】
また、試料からの２光子蛍光を観察するためのレーザー顕微鏡が近年特に注目を集めているが、２光子蛍光を発生させるためには試料に数ミリワットから数十ミリワットの強いレーザーパワーが要求される。従って、光トラップによる集塵の可能性は極めて大きくなる。
【００１２】
特開２０００−５６２３３号公報に係る構成で上記アプリケーションを満足させ、さらに、２光子蛍光を観察するための装置を提供するには、装置内の挨を極めて高いレベルで排除しなければならない。従って、製作面でのコストに重大な影響を与える。
【００１３】
また、特開２０００−５６２３３号公報に係る構成は、光検出器の配置の自由度が低く、制限されるという問題を有する。
【００１４】
特開２０００−５６２３３号公報に係る構成では、試料からの光は小型ミラーＳ１、Ｓ２・・・のそれぞれの中間領域に到達し、図２４に示すように小型ミラーＳ１、Ｓ２・・・の透光部分ＳＴを通過する。透光部分ＳＴを通過した各評価光路に対応して楔型プリズムＧＫ（ここではＧＫ１、２、３、４）が配置されており、この分散により各光束が曲げられて、さらにレンズＫＯにより集光される。
【００１５】
しかしながら、図２５に示すように楔型プリズムＧＫを通過しない光束も異なる角度で光検出器方向に向かうことになり、この角度差はプリズムの楔角を大きくとってもせいぜい６０度程度である。なお楔型プリズムの楔角を大きくとると、屈折角は大きくなるが、集光位置から楔型プリズムヘの入射位置までの距離が離れるので波長分解精度が低下する。つまり、角度差と波長分解精度は相反する関係となっている。
【００１６】
従って、特に、光検出器にサイドオンタイプのフォトマルチプライヤーを用いる場合は、レイアウトが制限され、光検出器の位置をミラー保有体である素子ＳＴから遠ざけねばならず、装置が大型化してしまう。これは試料からの光をミラー保有体である素子ＳＴの位置で透過させ、プリズムで屈折させることにより所望のスペクトル域を制限させる前記従来技術の構成をとるかぎり避けられない欠点である。
【００１７】
更に、特開２０００−５６２３３号公報に係る構成では、分離された各光検出光路に独立の共焦点絞りを配置していない、また配置することが構成上極めて困難である。
【００１８】
一般的に試料からの蛍光は、光検出器にフォトマルチプライヤーを必要とするほど微弱であるのが普通である。また、蛍光試料は励起光（レーザー光）を強く当てるほどに退色が激しくなるので、観察者は試料の退色と、得られる画像イズのバランスを見て、許容できる範囲内で、可能な限り励起光量を下げようとするのが普通である。従って、この種の装置では蛍光のロスを極力抑えることが極めて重要なポイントになる。
【００１９】
２つの蛍光色素（ＤＡＰＩ、ＣＹ５）で標識された試料について考える。
ＤＡＰＩはＵＶ域（３４０〜３６５ｎｍ）に吸収波長域をもち、放出される蛍光波長は、ほぼ４５０ｎｍにそのピークがあらわれる。一方、ＣＹ５は赤色域（６３０〜６５０ｎｍ）に吸収波長域をもち、蛍光波長は、ほぼ６７０ｎｍにそのピークがあらわれる。
【００２０】
ここで、これらの蛍光が結像位置で形成されるスポットについて、図２３を参照して述べる。
【００２１】
対物レンズ２１´で試料２２´上にレーザースポットを形成し、ここから放射される蛍光は、対物レンズ２１´、結像レンズ２０´、瞳投影レンズ１９´を経て、共焦点絞り１６´が配置されている位置、すなわちレンズ１７´による結像位置にそのスポットを結ぶ。なおスポット径（回折径）は次式で表わされる。
【００２２】
φ＝１．２２×λ／ＮＡ
ここでＮＡはレンズ２１を出射する出射開口であり、λは波長である。
【００２３】
この式からスポット径はＤＡＰＩ（蛍光波長４５０ｎｍ）とＣＹ５（蛍光波長６７０ｎｍ）では約１．５倍ほど異なり、ＣＹ５の方が大きい。
【００２４】
従って上記従来技術では、共焦点効果を確保するためにＤＡＰＩのスポット径に合わせて共焦点絞り２８の径を設定することになる。これはＤＡＰＩに対しては最適に設定されていることになるが、ＣＹ５に対しては、不必要に共焦点絞り２８により絞られてしまい、貴重な蛍光を失ってしまう。逆に共焦点絞り２８の径をＣＹ５に合わせると、ＤＡＰＩは十分な共焦点効果が得られないという欠点がある。このように、各検出光路に共焦点絞りを配置していないので、前述したような欠点を有する。
【００２５】
また、各検出光路に試料からの蛍光が分散する方向とは異なる方向に分散する楔型プリズムが少なくとも１個は存在するので、これらの光路にそれぞれ共焦点絞りを配置するのは現実的には困難である。なぜならば、分散をさらにキャンセルして光束を集束させるためのプリズムを再配置し、これを上記楔型プリズムの動きに同期して動かさなければならないからである。
【００２６】
更に、上記の従来の構成では、数種類のレーザー光に対応するために、レーザー光の反射用の小型ミラーの交換、調整をおこなわなくてはならない。
【００２７】
上記のように、レーザー光は、分散素子ＤＰでレーザー光に含まれる波長に分解された光線は、これら集光する場所に小さなミラーＳ１、Ｓ２、Ｓ３を有し、その他の部分は透明になっているミラー保有体である素子ＳＴに到達する。つまり、レーザー光が波長と集束するところでは必ず小さなミラーが、例えばミラー保有ガラス棒として配置されている。
【００２８】
また、棒状励起選択器（小型鏡Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３・・・付き鏡保有体ＳＴ）は取り換えることができるので、単一または複数の波長をも任意に構成することができる。
【００２９】
この従来例では、励起光であるレーザー光を反射させ、蛍光を含む試料からの光を光検出器へ導くために小型ミラーＳ１、Ｓ２、Ｓ３・・・を有し、その他の部分は透明になっているミラー保有体である素子ＳＴが必要となる。このミラー保有体ＳＴで、単一の波長または複数の波長域の励起光に対応可能ではあるが、様々な組合せが考えられるレーザー光には、その度に保有体ＳＴもしくは小型ミラーの交換が必要となる。しかし、この保有体ＳＴには、小型ミラーでレーザー光を確実に反射させ顕微鏡に導くために、小型ミラーの角度やミラー部の位置に高い精度が要求されるので、交換時に精度を出すための難しい調整が必要となる。
【００３０】
また、従来の構成は、蛍光を最良の条件で検出することが難しいという問題を有する。例えば、励起波長が４８８、５４３、６３３ｎｍに対応したスペクトル域に小型ミラーを有するＳＴを使用して、２つの蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＣＹ５）で標識された試料の蛍光観察を行う場合を考えると、その励起波長には４８８、６３３ｎｍを使用する。従って、５４３ｎｍの波長は使用しない。
【００３１】
このとき、ＦＩＴＣで標識された部分から放出される蛍光は、５４３ｎｍの波長を含んでいる。しかし、５４３ｎｍの波長の光は、小型ミラーにより反射してしまうので試料からの蛍光として検出することができない。従って、ミラー保有体ＳＴをひとつで数多くのレーザー光に対応させるには小型ミラーを数多く配置する必要がある。しかし、そのようにすることで、多くのレーザー光に対応可能となるが、励起光として使用していないレーザー光の波長と同じ波長を持つ試料からの光に含まれる蛍光を必ず反射させてしまうことになる。
【００３２】
上記の従来技術とは別に、特表平９−５０２２６９号公報には、蛍光光束をプリズム等のスペクトル分解手段により分光し、一方では第１スペクトル範囲を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分を反射して第２スペクトル範囲をなす２つの光路を構成し、それぞれの光路に対して光検出器を設けた分光装置が開示されている。
【００３３】
特表平９−５０２２６９号公報の分光装置２１６の構成を図２６を参照して説明する。
選択装置２２５は、光束２１４を分解するスペクトル分解手段２２７と、一方では第１スペクトル範囲２２９を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８とを有している。光検出器２２６は、絞り込まれた第１スペクトル範囲２２９の光路に配置された第１光検出器２３１と、反射されたスペクトル範囲の光路に設置された第２光検出器２３２とを有している。さらに選択装置２２５は、反射されたスペクトル範囲２３０の光路に設置され、第２スペクトル範囲２３４を絞り込む手段２３３を有する。第２光検出器２３２は、絞り込まれた第２スペクトル範囲２３４の光路に設置されている。
【００３４】
以上は２個の光検出器を有する装置の構成を示したものであるが、特表平９−５０２２６９は３個の光検出器を有する装置の構成についても開示している。この構成を図２７に示す。
【００３５】
反射されたスペクトル範囲２３０の光路に設置され、一方では第２スペクトル範囲２３４を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３５を更に反射する手段２３３を有する。第２光検出器２３２は、絞り込まれた第２スペクトル範囲２３４の光路に設置され、第３光検出器２３６は、更に反射されたスペクトル範囲２３５の光路に設置されている。更に、反射されたスペクトル範囲の光路に第３スペクトル範囲２３９を絞り込む手段２３８が設置され、第３光検出器２３６は、絞り込まれた第３スペクトル範囲２３９の光路に設置されている。
【００３６】
上記のようにして、合計３つのスペクトル範囲２２９、２３４、２３９を選択、光検出することが可能になっている。
【００３７】
次に、ＬＥＩＣＡ社のレーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＳＰのカタログからの抜粋図を図２８に示す。ここにはプリズムと反射手段との間に集光レンズが配置されている構成が開示されている。なお集光レンズ以外の光検出部の構成は図２６に示す構成と同じである。
【００３８】
特表平９−５０２２６９の構成では、光束２１４がスペクトル分解手段２２７でスペクトル分解され、一方では第１スペクトル範囲２２９を絞り込み、他方では絞りを通過しないスペクトル範囲の少なくとも一部分２３０を反射する手段２２８（可変スリット）で、各蛍光の波長域に分割している。しかし、光束２１４の光束径はある程度の大きさを有するので、十分な分光分解能で各検出光路に分割されないという欠点がある。分光分解能を上げるにはスペクトル分解手段２２７と反射手段２２８の距離を長くとればよいが、装置が大型化するので現実的ではない。
【００３９】
光束径の大きさで分光精度が制限されるという欠点を補う手段として、ＬＥＩＣＡ社のレーザー顕微鏡ＴＣＳ−ＳＬのカタログに係る図２８が示すように、スペクトル分解手段の後方に集光レンズを配置している。これにより光束を回折径にまで絞れるので、図２６に示す集光レンズが無い構成よりも分光分解能が向上している。
【００４０】
しかし、いくら集光レンズにより光束を集光しても、集光位置は、例えば、図２６において、絞り込み手段２２８と２３３の両方に最適な位置に設定することはできない。仮に集光位置を絞り込み手段２２８に設定するとする。この場合、絞り込み手段２２８では光束は回折径にまで絞られているので、極めて高い精度の分光が可能であるが、絞り込み手段２３３の光学的な位置は集光位置から大きくはずれ、従ってこの位置では光束は広がってしまっているので、高い精度の分光を実現できない。
【００４１】
従って同じ分光精度を得ようとすると、集光位置を絞り込み手段２２８と２３３の中間位置に設定することになるが、この場合はどちらに対しても集光位置からずれているので、理想的な分光精度を実現することはできないことになる。
【００４２】
なお、光検出器を３個有する構成の場合は、絞り込み手段２２８と絞り込み手段２３８の距離が更に大きくなるので、上述したような欠点はなおさら顕著に現れる。
【００４３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、改良されたミラー駆動機構および前記ミラー駆動機構によって駆動されるミラーを備えた走査型レーザー顕微鏡を提供することを目的とする。
【００４４】
具体的には、以下の通りである。
（１） 対物レンズにレーザー光が導かれるまでの（照明）光路中にレーザー光のビーム品質の劣化を抑えることができること。また、装置中に浮遊する挨が光学系に付着することによるによるレーザー光のビーム品質の劣化を受けにくいこと。
（２） サイドオンタイプのフォトマルチプライヤーでも容易に配置できるような、レイアウトの自由度が高いこと。
（３） 分離された各光検出光路に独立の共焦点絞りを配置することが容易なこと。
（４） 波長分解能が極めて高いこと。
（５） 様々な波長のレーザー光に対応でき、光学素子の難しい調整、交換を必要としないこと。
【００４５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を講じた。
【００４６】
本発明の第１の態様による走査型レーザー顕微鏡は、少なくともひとつのスペクトル域を有するレーザー光を走査装置により対物レンズを介して試料上を走査し、前記試料からの蛍光を所望のスペクトル範囲に絞り込んで光検出する走査型レーザー顕微鏡において、少なくとも１つのスペクトル域からなる前記レーザー光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、スペクトル分解された前記レーザー光を集光する第１の光学手段と、前記レーザー光をコリメートして前記試料へ導く一方で、前記試料からの光を集光する第２の光学手段と、スペクトル分解された前記レーザー光を合成する一方で、前記試料からの光をスペクトル分解するスペクトル合成／分解手段と、前記第１の光学手段と前記第２の光学手段の略焦点位置に配置され、少なくともひとつのスペクトル域のレーザー光は通過させ、試料からの光の一部を反射する少なくとも１つの反射手段と、前記反射手段により導かれた試料からの光を検出する光検出器と、を具備することを特徴とする。
【００４７】
本発明の第２の態様による走査型レーザー顕微鏡は、少なくとも１つのスペクトル域からなるレーザー光を走査装置により対物レンズを介して試料上を走査し、前記試料からの蛍光を所望のスペクトル範囲に絞り込み、光検出する走査型レーザー顕微鏡において、少なくとも１つのスペクトル域からなる前記レーザー光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、スペクトル分解された前記レーザー光を集光する第１の光学手段と、前記第１の光学手段の略焦点位置に配置され、スペクトル分解された前記レーザー光を少なくとも部分的に前記試料への光路へ向けて反射させる一方で、前記試料からの光を波長幅と波長域を調整可能に通過させる少なくとも１つの反射手段と、前記反射手段で反射された、前記レーザー光をコリメートする一方で、前記試料からの光を前記反射手段に略集光する第２の光学手段と、スペクトル分解された前記レーザー光を合成する一方で、前記試料からの光をスペクトル分解するスペクトル合成／分解手段と、前記反射手段を通過した試料からの光を検出する光検出器と、を具備することを特徴とする。
【００８２】
【発明の実施の形態】
（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。なお、図１（ａ）は全体図であり、図１（ｂ）は、３角形状のミラー１１ａ、１１ｂの側面図（図１（ａ）の１Ｂ−１Ｂ矢視図）である。
【００８３】
レーザー光源１は多波長の発振線を有するアルゴンレーザーであり、４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５１４．５ｎｍの３本の発振線を有する。レーザー光源２はヘリウムネオンレーザーであり、５４３ｎｍの発振線を有している。これらのレーザー光はビーム合成用のダイクロイックミラー３によりビーム合成されて、ＡＯＴＦ４に入射する。ＡＯＴＦ４は、上記４本の発振線に対して選択フィルターとして機能する。具体的には、ＡＯＴＦ４は、各発振線に対応するＲＦを選択的にかけることによって、光ファイバー５に選択的に発振線を導光することができる。
【００８４】
光ファイバー５を出射したレーザー光はコリメートレンズ６により平行光線となって出射し、プリズム７（Ｓ１）に入射する。ここで選択された発振線（ここでは４５７．９ｎｍと５１４．５ｎｍ）は光路を曲げられ、それぞれレーザー光８ａ、８ｂとして出射する。これらのレーザー光はそれぞれ集光レンズ９（Ａ１）により、焦点位置にそれぞれ１０ａ、１０ｂとして集光する。集光レンズ９（Ａ１）の略焦点位置に配置された２軸方向（紙面に垂直な方向と図１の矢印方向）に可動な３角形状のミラー１１ａ、１１ｂは１０ａと１０ｂの位置で通過するレーザー光８ａ、８ｂ以外は遮光するように位置調整されている。３角形状のミラー１１ａ、１１ｂを通過したレーザー光８ａ、８ｂはレンズ１２（Ａ２）により平行光に戻され、さらにプリズム１３（Ｓ２）で合成されて１本のレーザー光１４となってレンズ１５に入射する。なお光学系４４０と光学系４４１は本実施形態においては全く同じものが対称的に用いられている。
【００８５】
レーザー光１４は、レンズ１５の焦点位置に配置された絞り１６を通過してレンズ１７に入射し、このレンズ１７で平行光にされてＸ−Ｙスキャナ１８に入射する。
【００８６】
Ｘ−Ｙスキャナ１８を出射したレーザー光は、瞳投影レンズ１９、結像レンズ２０を透過して、対物レンズ２１により試料２２上を集光して走査する。
【００８７】
試料２２からの蛍光及び試料２２を反射したレーザー光は光路を逆にたどる。
なお、絞り１６は試料２２と光学的に共役な位置に配置されているので、絞り１６は共焦点絞りとして機能する。
【００８８】
絞り１６を通過した前記光線はレンズ１５により平行光線にされ、プリズム１３（Ｓ２）にてスペクトル分解される。すなわち、試料２２を反射したレーザー光は光路を完全に逆にもどり、４５７．９ｎｍ、５１４．５ｎｍのレーザー光で励起され、試料から放出された蛍光はそのスペクトル特性によりスペクトル分解され、レンズ１２（Ａ２）の焦点位置（レンズ９（Ａ１）の焦点位置でもある。
）に集光する。
【００８９】
これらの蛍光は頂角を有する形状のミラー１１ａ、１１ｂを反射し、それぞれレンズ２３ａ、２３ｂ（光学手段（Ａ３））を通過して光検出器２４ａ、２４ｂで検出される。
【００９０】
なお、光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′はそれぞれレーザー光のプリズム７（Ｓ１）への入射位置３０、試料からの光がプリズム１３（Ｓ２）へ入射する位置３１と光学的に共役な位置になるように配置されている。
【００９１】
ここで３角形状のミラー１１ａ、１１ｂの構成及び作用について図２を参照して詳しく説明する。
【００９２】
ミラー１１ａ、１１ｂはそれぞれＸ−Ｙステージ１２５ａ、１２５ｂにより可動に構成されている。ミラー１１ａ、１１ｂをＹ方向に移動させることにより、光検出器２４ａ、２４ｂにむけて反射する光線のスペクトル幅を自在に設定することができ、またＸ方向に移動させることにより、スペクトル域を、それぞれ自在に設定することができる。なお、ミラー１１ａ、１１ｂはそれぞれレンズ９（Ａ１）の焦点位置として形成されるスペクトル集光線３４０に対してα＝１５度だけ仰角をもって配置されている。
【００９３】
上記例では、レーザー光として、４５７．９ｎｍと５１４．５ｎｍの発振線に対応するようにミラー１１ａ、１１ｂの位置関係を設定しているが、４本の発振線のうち任意の２本の組合せ、或いは任意の１本に対してミラー位置を設定することもできる。
【００９４】
観察対象である試料の蛍光特性によりレーザー光の発振線が選択されると、指示器２６により制御器２７に司令信号が出され、制御器２７はＡＯＴＦ４を制御して目的の発振線に対応するＲＦを出力するとともに、ステージ１２５ａ、１２５ｂを駆動して、目的の発振線は通過して、試料からの蛍光は最大に検出されるようにミラー１１ａ、１１ｂの位置を制御する。もちろん、試料が２重染色であり、蛍光のクロストークが問題となる場合は、Ｘ−ＹステージをＹ方向に駆動して、光検出器に向けて反射するスペクトル幅を制限することも可能であり、或いはＸ−ＹステージをＸ方向に駆動してスペクトル域をシフトすることも指示器２６により可能である。
【００９５】
図２は、例えば４５７．９ｎｍの発振線が１本だけ選択された場合に、試料からの蛍光を全スペクトル域にわたって検出する場合のミラー１１ａの位置を示した図である。図２において、４５７．９ｎｍの波長のレーザー光はミラー１１ａをすり抜け、試料からの蛍光はミラー１１ａの全幅で反射され、光検出器２４ａで検出される。
【００９６】
図３は試料からのスペクトル分布を検出する場合のミラー１１ａの動きについて示す図である。
【００９７】
ミラー１１ａはレンズ１２（Ａ２）で集光されるスポット径と同等の幅を持つようにステージ１２５ａをＹ方向に駆動して、光検出器２４ａで検出される検出信号を記憶する。また、この時、ミラー１１ａをＸ方向に駆動しながら適当なサンプリング信号に同期させている。
【００９８】
これにより試料からの蛍光スペクトル分布を得ることができる。
【００９９】
上記のように、試料からの蛍光に対して、波長幅と波長域の両方を調整可能にして各光検出器に導光、検出できるようにしたので、様々な蛍光試料に対応できる。更に、試料が２重染色されたものであっても、蛍光のクロストークを容易に抑えることができる。
【０１００】
また、選択されたレーザー発振線に対して自動的にミラー１１ａ、１１ｂを設定できるようにしたので、使い易い。なお、ミラー１１ａ、１１ｂは、目的とする発振線以外の光束を遮光するためにも使用することができる。
【０１０１】
更に、光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′が、それぞれレーザー光のプリズム７（Ｓ１）への入射位置３０、及び試料からの光がプリズム１３（Ｓ２）へ入射する位置３１と光学的に共役な位置になるように配置されている。従って、ミラー１１ａ、１１ｂの移動があっても、蛍光光束は光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′の位置で振れることがなく、光検出器にサイドオン型のフォトマルチプライヤーのような感度分布特性をもつような検出器を用いても安定した光検出を行うことができる。
【０１０２】
上記の第１の実施形態では光学手段（Ａ１）、（Ａ２）としてレンズを使用しているが、レンズの替わりに放物鏡のような凹面鏡であってもよい。この場合、色収差が生じないので各波長のレーザー光、及び試料２２からの蛍光はスペクトル集光線３４０上に完全に集光する。従って、高い波長分解能を得ることができる。
【０１０３】
また、本実施の形態を含む下記の各実施形態において、スペクトル分解手段（Ｓ１）、スペクトル合成／分解手段（Ｓ２）のうちのいずれか一方、又は両方に対して回折格子を使用しても良い。この場合、回折格子は分散量を大きく取れるので前記光学手段（Ａ１）と（Ａ２）の焦点距離を小さくすることができる。従って、装置の小型化が可能になる。
【０１０４】
（第２の実施形態）
図４は、第２の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図４において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。なお、以下の各実施の形態において、ミラーの駆動部分の構成は、特に断らない限り図１と同じである。
【０１０５】
プリズム１３（Ｓ２）を出射したレーザー光は光路に挿脱可能に構成された中間倍率変更手段３２を経て、Ｘ−Ｙスキャナ１８に入射する。中間倍率変更手段３２の倍率を設定することにより、対物レンズ２１の瞳径にレーザー光束が略一致するようになっている。
【０１０６】
図４で試料からの光はミラー１１ａ、１１ｂで反射されてそれぞれレンズ２３ａ、２３ｂに入射し、平行光線となってプリズム２８ａ、２８ｂに入射し１本のビームに合成される。
【０１０７】
なお、光学系４４２ａ、４４２ｂには光学系４４１、４４０と全く同じものが用いられている。
【０１０８】
各プリズムを出射した光線は共焦点レンズ２９ａ、２９ｂの焦点位置に配置された共焦点絞り１６ａ、１６ｂを通過して光検出器２４ａ、２４ｂで検出される。
【０１０９】
共焦点絞り１６ａ、１６ｂは絞り径が電動により可変できるように構成されており、試料２２の蛍光特性に対して自動的に設定される。絞り径の制御は、例えばミラー１１ａ、１１ｂの位置に対応した波長から絞り径を演算し、図示しない制御部で制御するようにしても良い。
【０１１０】
また複数の対物レンズ２１が図示しないレボルバに取り付けられており、指示器２６の司令信号を受けて、制御器２７により光路に選択的に挿入される。対物レンズは開口数と倍率により瞳径が異なるが、瞳径の大きな対物レンズが選択された場合には制御器２７により光路に中間倍率変更手段３２（入射レーザー光束に対して光束径を拡大して出射する。）が自動的に挿入され、瞳径の小さな対物レンズが選択された場合には中間倍率変更手段３２は光路から外されるように構成されている。
【０１１１】
このように、本実施形態においては、瞳径の大きな対物レンズ２１が選択されても、瞳径の小さな対物レンズ２１が選択されても、対物レンズ２１への入射レーザー光束は対物レンズ２１の瞳径にほぼ一致させることができる。従って、照明光の損失を抑えるだけでなく、対物レンズが有する最大の結像性能を得ることができる。
【０１１２】
更に、試料からの蛍光光束は、瞳径の大きな対物レンズが選択されても、瞳径の小さな対物レンズが選択されても、プリズム１３に入射する蛍光光束径はほぼ一定（プリズム１３を出射するレーザー光束径とほぼ同じ径）になる。従ってレンズ１２（Ａ２）で集光するスポット径は選択される対物レンズによらずほぼ一定になるので、ミラー１１ａ、１１ｂによる波長分解能はほぼ一定に保たれる。
【０１１３】
本第２の実施形態では中間倍率変更手段３２を光路に挿脱することにより、２段階に対物レンズ２１の瞳へのレーザー入射光束を変更可能にしているが、中間倍率変更手段３２としてズーム光学系を使用することも考えられる。この場合、光路に選択された対物レンズ２１に対して最適なレーザー入射光束を与えることが可能となる。
【０１１４】
上記のように、第２の実施形態によれば、各検出光路に独立して共焦点絞りを配置しているので、試料の蛍光スペクトル特性に対して最適な絞り径に設定できる。従って、蛍光を損失することなく共焦点効果を得ることができる。
【０１１５】
また、プリズムと光検出器の間に共焦点絞りを配置しているので、レーザー光の散乱光が光検出器で検出され難いという利点がある。
【０１１６】
更に、光路に選択された対物レンズ（の瞳径）にかかわらず、波長分解能をほぼ一定にすることが可能であるとともに、対物レンズが有する最大の結像性能を得ることができる。
【０１１７】
（第３の実施形態）
図５は、第３の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図５において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。図５に示すように、本実施形態においては、シングルモードファイバー５４０の両端をそれぞれレンズ１５及びレンズ１７の焦点位置に配置して、顕微鏡／走査装置部４１と分光器部４２を前記シングルモードファイバー５４０で接続している。これにより、顕微鏡／走査装置部４１と分光器部４２を別ユニットとして構成している。さらにレーザー光源部４３と分光器部４２もシングルモードファイバー５で接続されている。なおシングルモードファイバー５４０は空間フィルターとして機能するので、共焦点絞りとして機能する。
【０１１８】
顕微鏡／走査装置部４１と分光器部４２及びレーザー光源部４３を別ユニットとして構成しているので、顕微鏡及び／走査装置部４１を小型にでき、自由度の高いレイアウトが可能になる。
【０１１９】
（第４の実施形態）図６は、第４の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図６において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。なお、図６において、図６（ａ）は全体概観図であり、図６（ｂ）は、主要部の正面図である。図６に示すように、ミラー１１ａ、１１ｂは、それぞれ、その反射面がスペクトル集光線３４０を含むように配置され、さらに、反射面が入射光束に対して角度βをなすように、わずかに上方、下方に傾いて配置されている。
【０１２０】
ミラー１１ａ、１１ｂの反射光はそれぞれ６０ａ、６０ｂとしてレンズ１２に入射し、光検出器２４ａ、２４ｂで検出される。
【０１２１】
ミラー１１ａ、１１ｂは、図１に示すようなそれぞれステージ１２５ａ、１２５ｂの駆動機構により、図６（ｂ）に示すように、捩れた角度をなすように配置され、異なる矢印方向（Ｙｌ、Ｙ２方向）及びスペクトル集光線３４０と同じＸ方向に移動可能に構成されている。
【０１２２】
なお、光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′はそれぞれレーザー光のプリズム７（Ｓ１）への入射位置３０、試料からの光がプリズム１３（Ｓ２）へ入射する位置３１と光学的に共役な位置になるように配置されている。
【０１２３】
第４の実施形態では、レンズ９（Ａ１）、レンズ１２（Ａ２）の集光位置に完全に一致する位置にミラー１１ａ、１１ｂを配置し、ミラー１１ａ、１１ｂを移動しても反射面は常にスペクトル集光線３４０上にあるので、ミラー１１ａ、１１ｂを移動しても波長分解能は全く劣化しない。従って極めて波長分解能の高い分光装置を提供できる。
【０１２４】
また、検出光路の集光レンズとしてレンズ１２を共用しているので、安価でコンパクトな分光装置を提供できる。
【０１２５】
更に、光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′はそれぞれレーザー光のプリズム７（Ｓ１）への入射位置３０、試料からの光がプリズム１３（Ｓ２）へ入射する位置３１と光学的に共役な位置になるように配置されている。従って、ミラー１１ａ、１１ｂの移動があっても、蛍光光束が光検出器２４ａ、２４ｂの検出部２４ａ′、２４ｂ′の位置で振れることがなく、光検出器にサイドオン型のフォトマルチプライヤーのような感度分布特性をもつような光検出器を用いても安定した光検出を行うことができる。
【０１２６】
（第５の実施形態）
図７は、第５の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図７において、図４と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。図７に示すように、ミラー１１ａ、１１ｂは、正面図（展開図を含む）である図７（ｂ）に示すように、第４の実施形態と同様に、それぞれわずかに上方、下方に傾いて配置されており、反射された試料からの光はそれぞれ６０ａ、６０ｂとしてレンズ１２（Ａ２）に入射し、平行光束になって、プリズム１３に入射して、１本のビームに合成される。
【０１２７】
プリズム１３を出射した各蛍光光束は共焦点レンズ２９ａ、２９ｂの焦点位置に配置された共焦点絞り１６ａ、１６ｂを通過して光検出器２４ａ、２４ｂで検出される。
【０１２８】
共焦点絞り１６ａ、１６ｂは絞り径が電動により可変できるように構成されており、試料２２の蛍光特性に対して自動的に設定される。
【０１２９】
絞り径の制御方法としては、例えばミラー１１ａ、１１ｂの位置に対応した波長から絞り径を演算し、図示しない制御部で制御するようにしても良い。
【０１３０】
本実施形態によれば、検出光路の集光レンズとしてレンズ１２を共用し、スペクトル合成用としてプリズム７、１３を共用しているので、安価でコンパクトな走査型共焦点レーザー顕微鏡を提供できる。特にプリズムを共用していることでビームの集束を確実にできる。
【０１３１】
本第５の実施形態において、プリズム７、１３の代わりに回折格子を構成しても良い。この場合に、回折格子は分散を大きく取れるので装置の小型化に役立つ。
【０１３２】
（第６の実施形態）
第６の実施形態は第２の実施形態（２チャンネル）を４チャンネルに構成した実施形態である。
【０１３３】
図８（ａ）において、レーザー光源１は多波長の発振線を有する水冷アルゴンレーザーであり、３５１ｎｍ、３６４ｎｍ、４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５１４．５ｎｍの５本の発振線を有する。レーザー光源２はヘリウムネオンレーザーであり、５４３ｎｍの発振線を有している。これらのレーザー光はビーム合成用のダイクロイックミラー３によりビーム合成され、ＡＯＴＦ４に入射する。ＡＯＴＦ４は、上記６本の発振線に対して選択フィルターとして機能するＡＯＴＦ４に入射する。具体的には、ＡＯＴＦ４は、各発振線に対応するＲＦを選択的にかけることによって、光ファイバー５に選択的に発振線を導光することができる。なお、図示しない制御器により、ミラー１１ａから１１ｄは、Ｘ−Ｙ方向に可動に構成されている電動ステージ１２５ａから１２５ｄによりそれぞれ位置制御される。
【０１３４】
ここで、図８の８Ｂ−８Ｂ矢視図である図８（ｂ）に示すように、ミラー１１ａから１１ｄは、それぞれレンズ９（Ａ１）及びレンズ１２（Ａ２）の焦点位置として形成されるスペクトル集光線３４０に対してα＝１５度だけ仰角をもって配置されている。
【０１３５】
さらに、反射面が入射光束と角度βをなすように、わずかに上方、下方に傾いて配置されている。
【０１３６】
これにより、図８において、紙面に垂直な方向に同じ検出光路が構成されている。
【０１３７】
本第６の実施形態においては、４つの検出光路を有しているので、４重染色された試料を観察可能であり、またＤＡＰＩのようなＵＶで励起される蛍光試料にも対応できる。
【０１３８】
また、検出光路の数は本実施形態では４チャンネル、すなわち、ミラーを４個配置するものであったが、ミラーを３個配置して、３つの検出光路を有する装置（３チャンネル）にしてもよいし、更に多くの検出光路を有する装置に構成することも可能である。なお、上記の実施形態では、ミラーを４個配置するものであり、その他にもミラーを３個配置する例も開示したが、ミラーは複数個配置する必要は特になく、例えば、１個のミラー、好ましくは、３角形状のミラーをＸ−Ｙ方向に駆動できるだけでも、上記の実施形態と同様の効果を達成することができる。また、ここで述べたような構成のものは、上記の実施形態に限られるものではなく、種々変形して用いることができ、少なくとも本明細書に記載された実施形態への適用は可能である。
【０１３９】
（第７の実施形態）
図９は、第７の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図９において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。なお、図９（ｂ）は、ミラー及びその駆動部分の構成を示す図９（ａ）の９Ｂ−９Ｂ矢視図である。また、図９（ｃ）は、図９（ａ）の９Ｃ矢視図である。図９（ｂ）に示すようにミラー１１´ａ、１１´ｂの反射面は、スペクトル集光線３４０に対して、垂直でない、頂角（この例では９０度）をなす２つの稜線Ｒｌ、Ｒ２でそれぞれ構成される。（すなわち各稜線Ｒｌ、Ｒ２はスペクトル集光線３４０に対してそれぞれ４５度をなす。）
さらに、ミラー１１´ａ、１１´ｂで反射された蛍光光束を通過させ、レーザー光束がミラー１１´ａ、１１´ｂにより反射された反射光束を遮断する遮断部材５０（図９（ｃ）参照）がミラー１１´ａ、１１´ｂとレンズ２３ａ、２３ｂ（光学手段（Ａ３））の間に配置されている。
【０１４０】
試料からの蛍光をできるだけ多く光検出器に導くためには、ミラー１１´ａ、１１´ｂをレーザー光束（この例では４５７．９ｎｍと５１４．５ｎｍ）に可能な限り近づける必要がある。しかし、レーザー集光スポットはレーリー分布している。そのため、レーザー光の一部はミラー１１´ａ、１１´ｂにより反射されて光路を曲げられて、光検出器２４ａ、２４ｂに向かってしまうために、レーザー光が光検出器２４ａ、２４ｂで検出されてしまう可能性がある。
【０１４１】
第７の実施形態ではミラー１１´ａ、１１´ｂをスペクトル集光線３４０に対して４５度をなす稜線を有するミラーで構成し、さらに、ミラー１１´ａ、１１´ｂにより反射された反射光束を遮断する遮断部材がミラー１１´ａ、１１´ｂとレンズ２３ａ、２３ｂ（光学手段（Ａ３））の間に配置されている。従って、レーザー光が光検出器で検出されることがないので、極めてＳ／Ｎの良い試料からの蛍光画像を得ることができる。
【０１４２】
（第８の実施形態）
図１０は、第８の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図１０において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１４３】
図１０において、レーザー光源３３は紫外線域の発振線を有する水冷アルゴンレーザーであり、３５１ｎｍの発振線を有する。
【０１４４】
前記レーザー光源３３が発するレーザー光はビームエクスパンダー３４で対物レンズの瞳径に略一致するようにビーム径が拡大され、３５１ｎｍの光は反射し、それよりも長い波長の光を透過するダイクロイックミラー３５によりＸ−Ｙスキャナ１８に導かれ、対物レンズ２１を介して試料２２に照射される。試料（ＤＡＰＩ）からの蛍光（中心波長は約４５０ｎｍ）は光路を逆にたどり、ダイクロイックミラー３５を透過して第１の実施形態と同様に光検出される。
【０１４５】
レンズ９、１２として、通常高い性能の収差補正が要求されるが、とりわけ紫外線域で収差補正を厳密に行うとなると、レンズ構成は複雑になる。さらに高い精度が要求されるので、製作面においてもコスト高の原因となる。
【０１４６】
第８の実施形態では３５１ｎｍの紫外線域のレーザー光をプリズム７、１３を介さずに導光しているので、レンズ９、１２の設計、製作は容易になり、コストを抑えることができる。
【０１４７】
また、本実施形態においては、レーザー光源３３を新たに配置したが、レーザー光源３３に替えて、レーザー光源１及びレーザー光源２を用い、ＡＯＴＦ４で所望の波長を選択するようにしても良い。なお、第５の実施形態においても、同様の構成が可能である。
【０１４８】
（第９の実施形態）
図１１は、第９の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図である。図１１において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。なお、図１１では、走査型レーザー顕微鏡の全体構成ではなく、分光部分のみを示している。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）に適用されるミラーの構成例を示す図であって、１１Ｂ−１１Ｂ矢視図である。図１１（ｂ）において、図１０と同じ部分には同じ符号を付す。
【０１４９】
図１１（ｂ）において、ミラー１１ａから１１ｄは、図１０と同様に、それぞれ、スペクトル集光線３４０に対して仰角α（＝１５度）をもって配置されるとともに、その反射面が入射光束と角度βをなすように、わずかに上方、下方に傾いて配置されている。ここで、ミラー１１aと１１ｃよりもミラー１１ｂと１１ｄの方が小さくなっている。
【０１５０】
４つの検出光路を有しているので、第６の実施形態と同様に、さまざまな蛍光試料に対応できる。また、レンズ１２の集光位置に略一致する位置にミラー１１ａから１１ｄを配置し、ミラー１１ａから１１ｄを移動しても反射面は常にスペクトル集光線３４０の近傍にあるので、ミラー１１ａから１１ｄを移動しても波長分解能がほとんど劣化しない。従って、波長分解能が高く、さまざまな蛍光試料に対応できる分光装置を提供できる。
【０１５１】
（第１０の実施形態）
図１２を参照して、第１０の実施形態を説明する。図１２において、四角形状のミラー４４ａ、４４ｂは、一端が円周状に配置されたバンドルファイバー５０ａ、５０ｂ内に配置されており、軸４５ａ、４５ｂ回りに回転可能に構成されている。更に、四角形状のミラー４４ａ、４４ｂは、スペクトル集光線３４０に沿って可動に構成されている。また、バンドルファイバー５０ａ、５０ｂの他端には光検出器２４ａ、２４ｂが配置されている。すなわち、ミラー４４ａ、４４ｂの回転により波長幅を調整し、スペクトル集光線３４０に沿って移動することにより波長域を調整するようにして反射可能に構成されており、反射光はバンドルファイバーで光検出器２４ａ、２４ｂに導かれる。
【０１５２】
本実施形態によれば、バンドルファイバーを用いて光検出器に導光しているので、光線はそのスペクトル特性に係わらず、光検出器２４ａ、２４ｂに対して同じ位置に入射する。従って、光検出器２４ａ、２４ｂがフォトマルチプライヤーのような受光部に感度分布を有するものであっても、感度が変化することなく精度の高い分光測光が可能である。
【０１５３】
（第１１の実施形態）
図１３は、本発明の第１１の実施形態に係わる走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図（光検出器を除く）である。図１４（ａ）及び図１５は、光検出器を含む図１３の正面図である。図１３から図１５において、図１と同じ部分には同じ符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１５４】
なお、第１の実施形態では、レーザー光８ａ、８ｂがミラー１１ａ、１１ｂを通過し、試料２２からの蛍光がミラー１１ａ、１１ｂを反射して、光検出器２４ａ、２４ｂに入射するようにしたが、本実施形態では、３角形状のミラー１１ａ、１１ｂでレーザー光８ａ、８ｂが集光位置１０ａ、１０ｂで反射するように位置調整されている。そして、試料２２からの蛍光が３角形状のミラー１１ａ、１１ｂを通過して、その直後に配置された１軸方向（図１４（ａ）の矢印方向２３″）に移動可能な光選択用ミラー、ここでは、３角ミラー２３で蛍光をそれぞれの光路に反射して、レンズ２３ａ、２３ｂを通過して光検出器２４ａ、２４ｂで検出されるように構成されている。なお、この３角ミラーは、所望の波長幅と波長域を有する光束を選択する光選択用ミラーとして機能するが、一方、所望の波長幅と波長域以外の波長幅と波長域を有する光束を遮光するための遮光部材（遮光手段）としても機能する。
【０１５５】
本実施形態における３角形状のミラー１１ａ、１１ｂの構成及び作用について詳しく説明する。なお、図１３（ｂ）は、３角形状のミラー１１ａ、１１ｂの１３Ｂ−１３Ｂ矢視図（側面図）である。
【０１５６】
第１の実施形態と同様に、本実施形態においても、ミラー１１ａ、１１ｂは、それぞれ、Ｘ−Ｙステージ１２５ａ、１２５ｂにより可動に構成されており、ミラーをＸ方向に移動させることにより、反射させるレーザー光及び試料からの光のスペクトル域を自在に設定することができ、またＹ方向を移動させることにより、反射させる試料からの光のスペクトル幅をそれぞれ自在に設定することができる。また、Ｙ方向に移動させることでミラー１１a、１１ｂを光路から外すことができるようになっている。
【０１５７】
ミラー２３は電動ステージ２９により図１４（ａ）及び図１５に示す矢印２３″方向に可動に構成されている。ミラー２３をミラー２３の頂点２３’と３角形状ミラー１１ｂの中心軸を一致させて、同期させながら移動させることにより、光検出器２４ａ、２４ｂに向けて反射する光線のスペクトル域を設定することができる。
【０１５８】
本実施形態では、レーザー光として、４５７．９と５１４．５ｎｍの発振線に対応するように３角形状のミラー１１ａ、１１ｂの位置関係を設定しているが、４本の発振線のうち任意の組合せ、或いは図１５に示すような任意の１本に対して３角形状のミラーの位置を設定することもできる。
【０１５９】
そして、観察対象である試料の蛍光特性によりレーザーの発振線が選択されると、指示器２６から制御器２７に司令信号が出され、制御器２７はＡＯＴＦ４を制御して目的の発振線に対応するＲＦを出力するとともに、Ｘ−Ｙステージ１２５ａ、１２５ｂを駆動して、目的の発振線が確実に反射されるようにミラー１１ａ、１１ｂの位置を制御して、試料からの蛍光は最大に検出されるように３角ミラー２３の位置を制御する。もちろん、試料が２重染色であり、蛍光のクロストークが問題になる場合は、Ｘ−ＹステージをＹ方向に駆動して、光検出器へと通過するスペクトル幅を制限することも、或いはスペクトル域をシフトすることも指示器２６から可能である。
【０１６０】
本実施形態によれば、選択されたレーザー発振線に対して自動的に３角形状のミラー１１ａ、１１ｂ及び３角ミラー２３が設定されているので、使いやすい。
なお、本実施形態においては、
（第１２の実施形態）
図１６は、第１２の実施形態に係わる走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図（光検出器を除く）である。図１７は、光検出器を含む図１６の正面図である。図１６及び図１７において、図１３から図１５と同じ部分には、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１６１】
図１６に示すように、プリズム１３を出射したレーザー光は直接Ｘ−Ｙスキャナ１８に入射する。なお、コリメートレンズ６の焦点距離を適当に設定することにより、対物レンズ２１の瞳径にレーザー光束が略一致するようになっている。そして、図１７に示すように、試料２２からの光は３角形状のミラー１１ａ、１１ｂを通過して、偏向手段、ここでは、３角ミラー２３でそれぞれの光路に反射されてそれぞれレンズ２３ａ、２３ｂに入射し、平行光線となってプリズム２８ａ、２８ｂに入射し１本のビームに合成される。各プリズムを出射した光線は、共焦点レンズ２９ａ、２９ｂの焦点位置に配置された共焦点絞り１６ａ、１６ｂを通過して光検出器２４ａ、２４ｂで検出される。なお、共焦点絞り１６ａ、１６ｂは絞り径が電動により可変できるように構成されており、試料２２の蛍光特性に対して自動的に設定される。
【０１６２】
本実施形態においては、各検出光路に独立して共焦点絞りを配置しているので、試料の蛍光スペクトル特性に最適な絞り径に設定でき、蛍光を損失することなく共焦点効果を得ることのできる装置を提供することができる。また、プリズムと光検出器の間に共焦点絞りを配置しているので、レーザー光の散乱光が光検出器で検出され難いという利点がある。
【０１６３】
（第１３の実施形態）
図１８は、第１３の実施形態に係わる走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図（光検出器を除く）である。図１８において、図１３と同じ部分には、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１６４】
図１８に示すように、コリメートレンズ６を出射したレーザー光はプリズム３５の上部に入射してスペクトル分解され、それぞれレーザー光８ａ、８ｂとして出射する。これらのレーザー光はそれぞれレンズ３６のレンズ上部に入射し、そこから少し斜め下方に進み、集光レンズ３６の略焦点位置に配置された３角形状のミラー１１ａ、１１ｂ上に１０ａ、１０ｂとして集光して、反射と同時に斜め下方に傾き再びレンズ３６を通過して平行光線となり、プリズム３５の下方部に入射しスペクトル合成されて１本のレーザー光１４となりレンズ１５に入射して、顕微鏡へと接続される。
【０１６５】
試料２２からの光は顕微鏡の光路を逆に戻り、プリズム３５の下方部から入射してスペクトル分解され、レンズ３６の焦点位置に集光する。試料２２からの蛍光は３角形状のミラー１１ａ、１１ｂを通過し、第１１の実施形態として示した図１４（ａ）の検出光路に導光され試料からの蛍光が検出される。
【０１６６】
励起光路と検出光路のプリズム３５とレンズ３６を共用しているので、安価でコンパクトな走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【０１６７】
なお、個々の光検出器に導く試料からの光のスペクトル域を任意に設定できるようにするために、偏向手段を、レーザー光の一部を反射させ、かつ試料からの光を部分的に通過させるようにした上述した実施形態に用いていたが、これに限られるものではなく、発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々の光学系に適用でき、例えば試料からの光を導くためにミラー１１ａ、１１ｂを用いた本発明の実施の形態への適用も可能である。
【０１６８】
また、上述した実施形態では、偏向手段として３角ミラーを用いていたが、これに限られるものではなく、例えば、図１４（ｂ）に示すような光検出器を試料からの光の光路上と、試料からの光の光軸に対して垂直な方向の光路上との２箇所にそれぞれレンズを介して配置すると共に、傾斜をつけたミラー、ここでは４５°の傾斜で固定されたミラーを試料からの光の光軸に対して垂直な方向に移動可能に設けることで、そのミラーの移動により、試料からの光を反射と透過とに分けて各々の光検出器に導くようにすることもできる。
【０１６９】
（第１４の実施形態）
図１９は、第１４の実施形態に係わる走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図（光検出器を除く）である。図２０は、光検出器を含む図及び図１９の正面図である。本実施形態は第１１の実施形態（２チャンネル）を４チャンネルにした実施形態である。
【０１７０】
図１９において、レーザー光源１は多波長の発振線を有する水冷アルゴンレーザーであり、３５１ｎｍ、３６４ｎｍ、４５７．９ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４．５ｎｍの発振線を有している。これらのレーザー光はビーム合成用のダイクロイックミラー３によりビーム合成され、上記６本の発振線に対して選択フィルターとして機能するＡＯＴＦ４に入射する。ＡＯＴＦ４は、各発振線に対してＲＦを選択的にかけることによって、光ファイバー５に選択的に発振線を導光することができる。
【０１７１】
３角形状のミラー１１ａから１１ｄはそれぞれＸ−Ｙ方向に可動に構成されている電動Ｘ−Ｙステージ１２５ａから１２５ｄを介して制御器２７により位置制御される。
【０１７２】
図２０（ａ）において、試料２２からの蛍光は３角形状のミラー１１ａから１１ｄを通過して、その直後に配置された２軸方向（図２０の矢印方向３７’及び紙面に垂直な方向）に移動可能な３角形状のミラー３７ａから３７ｄで蛍光をそれぞれの光路に向けて反射する。３角形状のミラー３７ａから３７ｄで反射された蛍光は、レンズ２３ａから２３ｄを通過して光検出器２４ａから２４ｄで検出される。
【０１７３】
図２０（ａ）に示すように、３角形状のミラー３７ａから３７ｄは光軸に垂直な方向に対して、それぞれ異なる傾き角を持っており、それぞれの蛍光が異なる方向に反射するように上方もしくは下方に傾いて配置されている。
【０１７４】
ここで、３角形状のミラー３７ａから３７ｄの構成及び作用について詳しく説明する。
【０１７５】
図２０（ｃ）は３角形状のミラー３７ａから３７ｄの側面図（図２０（ｂ）の２０Ｃ−２０Ｃ矢視図）を示したものである。
【０１７６】
３角形状のミラー３７ａから３７ｄはそれぞれ、Ｘ−Ｙステージ３８ａから３８ｄにより可動に構成されており、配線３９から制御器２７に接続され制御器２７により位置制御される。Ｘ−ＹステージをＸ方向に移動させることにより、反射させる試料からの蛍光のスペクトル域を自在に設定することができ、Ｙ方向に移動させることにより、反射させる試料からの光のスペクトル幅を自在に設定することができる。また、Ｙ方向に移動させることで光路からミラーを外すことができる。
【０１７７】
なお、光検出器２４ａから２４ｄの検出部２４ａ′から２４ｄ′はそれぞれレーザー光のプリズム７への入射位置３０、試料からの光がプリズム１３への入射位置３１と光学的に共役な位置になるように配置されている。
【０１７８】
本実施形態においても、４つの検出光路を有しているので、４重染色の蛍光試料に対応できる。
【０１７９】
（第１５の実施形態）
図２１は、第１５の実施形態に係わる走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図である。図２１において、図１９及び図２０と同じ部分には、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
【０１８０】
図２１に示すように、試料２２からの蛍光は３角形状のミラー１１ａから１１ｄを通過して、その直後に配置された１軸方向（図２１の矢印の方向４０’）に可動な複数の光を同時に検出することができる直線状に複数の光検出器の配列した光検出器２４、例えばマルチアノードフォトマルチプライヤーチューブで検出される。
【０１８１】
上記の光検出器２４は、電動ステージ５４１により可動に構成されており、制御器２７により位置制御される。光検出器２４を移動することにより、４本の任意の発振線に対応した試料２２からの蛍光が同時に検出される。
【０１８２】
このように、複数の光を同時に検出することができる光検出器を使用することにより、コンパクトな走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【０１８３】
本実施形態においても、プリズム７の代わりに回折格子の構成が可能である。
回折格子は分散を大きくとれるので装置の小型化に役立つ。もちろんプリズム１３の代わりに回折格子を用いることも考えられるが、回折格子は偏光特性を有するので、試料からの蛍光（ランダム偏光）を分光するにはプリズムの方が理想的である。
【０１８４】
本発明は、上記の各実施形態に限定されるものではない。本発明の要旨を変更しない範囲で種々変形して実施できるのは勿論である。
【０１８５】
【発明の効果】
本発明によれば次のような効果が得られる。
【０１８６】
本発明によれば、対物レンズにレーザー光が導かれるまでの（照明）光路中にレーザー光のビーム品質の劣化を抑えることのできる分光型走査型レーザー顕微鏡を提供することができる。また、装置中に浮遊する挨が光学系に付着することによるによるレーザー光のビーム品質の劣化を受けにくい走査型レーザー顕微鏡を提供することができる。
【０１８７】
試料からの蛍光を反射するミラーの仰角を適当に設定することにより、サイドオンタイプのフォトマルチプライヤーでも容易に配置できるような、レイアウトの自由度が高い走査型レーザー顕微鏡を提供することができる。
【０１８８】
多チャンネルに構成された各光検出光路に独立の共焦点絞りを配置することが容易に可能な走査型レーザー顕微鏡を提供することができる。
【０１８９】
本発明によれば、特に、２つ以上のスペクトル範囲に絞り込み、それぞれ光検出を行う分光装置において、分光分解能の極めて高い、高精度の分光装置を提供することができる。
【０１９０】
本発明によれば、様々なレーザー光に対して適応ができる分光型走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【０１９１】
レーザー光と試料からの光を分解／合成するプリズム及びスペクトル分解されたレーザー光と試料からの光を集光するレンズをそれぞれ１つにすることで、コンパクトで安価な走査型レーザー顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の第１の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】 ４５７．９ｎｍの発振線が１本だけ選択された場合に、試料からの蛍光を全スペクトル域にわたって検出する場合のミラー１１ａの位置を示した図。
【図３】 試料からのスペクトル分布を検出する場合のミラーの動きについて示す図。
【図４】 第２の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図５】 第３の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図６】 第４の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図７】 第５の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図８】 第６の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図９】 第７の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１０】 第８の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１１】 第９の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１２】 第１０の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１３】 第１１の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１４】 第１１の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡における検出部の詳細を示す図。
【図１５】 第１１の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡における検出部の詳細を示す図。
【図１６】 第１２の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１７】 第１２の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡における検出部の詳細を示す図。
【図１８】 第１３の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図１９】 第１４の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２０】 第１４の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡におけるミラー部の詳細を示す図。
【図２１】 第１５の実施形態に係る走査型レーザー顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２２】 従来の共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。
【図２３】 蛍光が結像位置で形成されるスポットについて説明するための図。
【図２４】 従来の共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。
【図２５】 従来の問題点を説明するための図。
【図２６】 従来の共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。
【図２７】 従来の共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。
【図２８】 従来の共焦点走査型レーザー顕微鏡の構成を示す図。
【符号の説明】
１、２…レーザー光源
３…ダイクロイックミラー
４…ＡＯＴＦ
５…光ファイバー（シングルモードファイバー）
６…コリメートレンズ
７、１３…プリズム
８ａ、８ｂ…レーザー光
９、１２、１５、１７…レンズ
１０ａ、１０ｂ…集光位置
１１ａ、１１ｂ…ミラー（３角形状ミラー）
１３…プリズム
１８…Ｘ−Ｙスキャナ
１９…瞳投影レンズ
２０…結像レンズ
２１…対物レンズ
２２…試料
４４ａ、４４ｂ…ミラー
４５ａ、４５ｂ…軸
５０…遮断部材
５０ａ、５０ｂ…バンドルファイバー

Claims (22)

1. 少なくともひとつのスペクトル域を有するレーザー光を走査装置により対物レンズを介して試料上を走査し、前記試料からの蛍光を所望のスペクトル範囲に絞り込んで光検出する走査型レーザー顕微鏡において、
   少なくとも１つのスペクトル域からなる前記レーザー光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、
   スペクトル分解された前記レーザー光を集光する第１の光学手段と、
   前記レーザー光をコリメートして前記試料へ導く一方で、前記試料からの光を集光する第２の光学手段と、
   スペクトル分解された前記レーザー光を合成する一方で、前記試料からの光をスペクトル分解するスペクトル合成／分解手段と、
   前記第１の光学手段と前記第２の光学手段の略焦点位置に配置され、少なくともひとつのスペクトル域のレーザー光は通過させ、試料からの光の一部を反射する少なくとも１つの反射手段と、
   前記反射手段により導かれた試料からの光を検出する光検出器と、を具備することを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
2. 前記反射手段は、前記試料からの光を、その波長幅と波長域の両方を調整しながら反射可能に構成されていることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微鏡。
3. 少なくとも１つのスペクトル域からなるレーザー光を走査装置により対物レンズを介して試料上を走査し、前記試料からの蛍光を所望のスペクトル範囲に絞り込み、光検出する走査型レーザー顕微鏡において、
   少なくとも１つのスペクトル域からなる前記レーザー光をスペクトル分解するスペクトル分解手段と、
   スペクトル分解された前記レーザー光を集光する第１の光学手段と、
   前記第１の光学手段の略焦点位置に配置され、スペクトル分解された前記レーザー光を少なくとも部分的に前記試料への光路へ向けて反射させる一方で、前記試料からの光を波長幅と波長域を調整可能に通過させる少なくとも１つの反射手段と、
   前記反射手段で反射された、前記レーザー光をコリメートする一方で、前記試料からの光を前記反射手段に略集光する第２の光学手段と、
   スペクトル分解された前記レーザー光を合成する一方で、前記試料からの光をスペクトル分解するスペクトル合成／分解手段と、
   前記反射手段を通過した試料からの光を検出する光検出器と、を具備することを特徴とする走査型レーザー顕微鏡。
4. 前記試料からの光を集光するレンズと、前記レンズの焦点位置に配置された共焦点絞りと、を更に備え、これらが走査装置と前記スペクトル合成／分解手段との間に配置されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
5. 前記光検出器は試料からの光が前記スペクトル合成／分解手段に入射する位置と光学的に略共役な位置に配置されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
6. 前記反射手段と前記光検出器との間に配置され、前記反射手段により反射された試料からの光をコリメートする第３の光学手段を更に備えたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
7. 前記反射手段により反射された試料からの光をコリメートする第３の光学手段と、試料からの光を前記第３の光学手段を経てスペクトル合成するスペクトル合成手段と、試料からの光を前記スペクトル合成手段を経て集光する共焦点レンズと、前記共焦点レンズの焦点位置に配置された共焦点絞りと、前記共焦点絞りを通過した試料からの光を検出する光検出器と、からなる検出光路が前記反射手段に接続されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
8. 前記第２の光学手段と前記第３の光学手段とは同一に構成されることを特徴とする請求項６または7に記載の走査型レーザー顕微鏡。
9. 前記第２の光学手段と前記第３の光学手段とは同一に構成されるとともに、前記スペクトル合成／分解手段と前記スペクトル合成手段も同一に構成されることを特徴とする請求項7に記載の走査型レーザー顕微鏡。
10. 前記スペクトル合成／分解手段と前記対物レンズの間に配置された中間倍率変更手段を更に備えたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
11. 前記中間倍率変更手段は使用する対物レンズの瞳径に対応して設定可能に構成されることを特徴とする請求項１０に記載の走査型レーザー顕微鏡。
12. 前記スペクトル合成／分解手段から出射するレーザー光は直接走査装置に接続されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
13. 前記反射手段はミラーであって、その反射面は頂角を有する形状からなるとともに、前記スペクトル合成／分解手段により試料からの光束がスペクトル分解される方向に略一致する第１の移動軸と、前記第１の移動軸に対しては略直交し試料からの光束方向とは一致しない第２の移動軸とを有し、駆動機構によってこれら移動軸に沿って可動に構成されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
14. 前記反射手段の反射面は、前記スペクトル分解手段により前記レーザー光がスペクトル分解される方向に対して、垂直でない、頂角をなす２つの稜線で構成されるとともに、前記レーザー光が前記ミラーにより反射される光束を遮断する遮断部材が光路に配置されていることを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザー顕微鏡。
15. 前記反射手段の反射面は、前記スペクトル分解手段により前記レーザー光がスペクトル分解される方向に対して、垂直でない、頂角をなす２つの稜線で構成されることを特徴とする請求項３に記載の走査型レーザー顕微鏡。
16. 前記第１の光学手段と前記第２の光学手段は球面ミラー、または放物ミラーで構成されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
17. 前記スペクトル合成／分解手段と走査装置の間に配置され、レーザー光を該走査装置に導光するためのレーザー光導光手段を更に備えたことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の走査型レーザー顕微鏡。
18. 前記反射手段を通過した試料からの光束を反射させ、光の進行方向を偏向させる少なくとも１つの偏向手段を更に備えたことを特徴とする請求項３に記載の走査型レーザー顕微鏡。
19. 前記偏向手段は前記スペクトル分解手段により光束が分解されるスペクトル分解方向に略一致する方向と、この方向に略直交する方向の２方向に移動可能に配置された３角形成分を有する形状（スペクトル分解方向に対して平行でない稜線を有する形状）のミラーで構成されることを特徴とする請求項１８に記載の走査型レーザー顕微鏡。
20. 別のレーザ光が、前記スペクトル合成／分解手段と前記対物レンズとの間から入射することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微鏡。
21. 前記第２の光学手段は、前記反射手段と前記光検出器との間に配置され、前記反射手段により反射された試料からの光をコリメートすることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微鏡。
22. 前記第２の光学手段は、前記反射手段により反射された試料からの光をコリメートし、
    前記第２の光学手段によりコリメートされた試料からの光をスペクトル合成するスペクトル合成部と、
    前記スペクトル合成部により合成された試料からの光を集光する共焦点レンズと、
    前記共焦点レンズの焦点位置に配置された共焦点絞りと、
    前記共焦点絞りを通過した試料からの光を検出する前記光検出器とを含む検出光路が、前記反射手段に光学的に接続されることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザー顕微鏡。

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